PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)

CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.1. Phương pháp MS (Mass Spectrometry)
1912: Phương pháp này lần đầu tiên được Tomxon (người Anh) sử dụng để phát hiện đồng vị của một số nguyên tố
1918: Arnot và Milligant sử dụng phương pháp ion hóa các phân tử rồi sau đó dẫn qua môi trường từ tính
1919: Aston sử dụng phương pháp này để xác định khối lượng các nguyên tử
1946: Stephens phát triển phương pháp bằng cách gắn thêm thiết bị đo thời gian bay
1953-1958: Nhóm NC của Paul sử dụng phương pháp trong phân tích khi dùng thêm bộ lọc tứ cực
1965: Gohlke và Mclafferty kết nối với sắc ký khí GC-MS
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Phương pháp MS có đặc điểm:
- Độ nhạy cao
- Vạn năng: Có thể phân tích nhiều đối tượng từ phân tích nguyên tố đến các phân tử protein phức tạp.
- Có tính chuyên biệt và độ chọn lọc cao
Ứng dụng quan trọng hơn của phương pháp MS hiện nay là để nhận dạng và thiết lập cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Việc phân tích thành phần phân tử trong hỗn hợp phức tạp của các chất hữu cơ thường được tiến hành sau khi đã tách chúng bằng sắc ký. Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) là phương pháp kết hợp đang được sử dụng trong nghiên cứu, nhất là với các chất hữu cơ.
2
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.1.1 Nguyên tắc phương pháp
Mẫu phân tích được hoá hơi thành các nguyên tử, phân tử.
Các nguyên tử, phân tử được ion hoá trong các thiết bị ion hoá phù hợp với từng loại mẫu phân tích
Các ion dương tạo thành được tách theo tỷ số m/z (với m-là khối lượng ion dương, z-là điện tích của ion đó) qua tương tác tổ hợp của chùm ion dương với điện trường gia tốc và từ trường.
Việc ghi nhận các chùm ion dương đã được tách có thể thực hiện trên kính ảnh hoặc bằng detector biến đổi cường độ dòng các ion dương thành dòng điện
3
4
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
5
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Năng lượng cần thiết để tách 1 electron để tạo cation gốc phân tử
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.1.2. Các phương pháp ion hoá
Ion hóa điện tử (EI: Electronic ionization):
- Phân tử HCHC được hóa hơi đạt áp suất 10-5 Torr
- Hơi phân tử HCHC được đưa vào vùng ion hóa
Xảy ra sự va đập giữa dòng electron có năng lượng lớn (70 eV) tạo ra cation gốc M+o
Cation gốc bị phá thành nhiều mảnh nhỏ F1+, F2+…
Các mảnh nhỏ này lại tiếp tục bị phân hủy thành các mảnh nhỏ hơn f1+, f2+…
6
7
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
8
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Phổ khối theo phương pháp EI bao gồm cation phân tử, các mảnh ion và để hạn chế độ phân mảnh thường dùng dòng electron có NL < 15eV
9
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
10
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Phương pháp ion hóa hóa học (Chemiscal ionization: CI):
- Phân tử HCHC M được hóa hơi (áp suất cao: 0,1-2 Torr)
Chất ở trạng thái khí được đưa vào trong thiết bị ion hóa chứa lượng dư các khí có khối lượng phân tử nhỏ (RH) như H2, CH4, NH3…
Các khí này bị ion hóa trước sau đó mới trao đổi proton với các phân tử chất cần phân tích. Ion trao đổi proton: CH5+, (CH3)3C+, NH4+…
11
12
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
13
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Ví dụ:
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Phổ khối của benzophenone

Cation phân tử xuất hiện ở 183,2 m/e ứng với ion MH+
14
C6H5COC6H5
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
PP ion hóa electrospray (ESI):
Mật độ các hạt mang điện trở nên quá cao dẫn đến nổ tạo ra các vi hạt chứa các phân tử [MH]+ hoặc [M-H]+
Ở áp suất khí quyển, những giọt nhỏ chất rất nhỏ được tạo thành mang một điện thế cao. Dưới tác dụng của điện trường và dòng khí đồng trục tạo ra đám mây các giọt nhỏ mang điện. Dưới tác dụng của dòng khí nóng thứ hai, các giọt này bị bay hơi từ từ.
15
16
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
17
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
PP ion hóa bằng bắn phá bởi tia laser, plasma, tia lửa điện
18
19
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Phương pháp tạo Plasma
20
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
21
Phương pháp này thường áp dụng phân tích cho các đại phân tử như Protein
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
22
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
23
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.1.3. Các loại quang phổ kế
a) Quang phổ kế từ tính (secteur magnétique)
24
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Cơ sở lý thuyết: Dưới tác dụng của điện trường gia tốc có điện áp U0, các ion dương có động năng:
Trong đó: z - điện tích ion dương
m - khối lượng ion
V - vận tốc ion
Suy ra:
Dưới tác dụng của từ trường, các ion dương chuyển động theo các quỹ đạo tròn bán kính r rồi hội tụ trên kính ảnh hay detector. Khi chuyển động trên các quỹ đạo cong, các ion chịu tác dụng của lực hướng tâm (Fht) và lực ly tâm (Flt) với:

H – cường độ từ trường
Điều kiện chuyển động của các ion theo quỹ đạo bán kính r là sự cân bằng của hai lực Fht =Flt hay: Suy ra
25
26
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
27
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
b) Bộ lọc tứ cực FD (filtre quadripolaire)
28
29
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
30
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Một số ion có tỷ số m/z xác định cộng hưởng với thế xoay chiều có thể đi thẳng qua khoảng không đến detector và cho tín hiệu trên phổ.

Các ion khác không có quỹ đạo ổn định va chạm với các cực và bị giữ lại ở đó.

Bằng cách thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực, các ion có tỷ số m/z khác nhau có thể đến được detector và được ghi tín hiệu trên phổ
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
c) Bẫy ion (Piège à ion)
31
32
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Bẫy ion tứ cực hoạt động theo nguyên lý của bộ phân tích tứ cực, chỉ có một điểm khác là các ion được lưu giữ và đưa dần ra khỏi bẫy

Bằng cách thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực, các ion có tỷ số m/z khác nhau có thể vượt qua bẫy để đến detector
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
d) Xác định thời gian bay
Nguyên lý: Các ion có khối lượng khác nhau thì vận tốc bay trong từ trường cũng khác nhau. Động năng của hạt là:
Với: q là điện tích ion, V là cường độ điện trường
33
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Động năng của hạt ion với vận tốc v là 1/2mv2. Ta có
hay
Như vậy, hạt có khối lượng càng nhỏ thì có vận tốc càng lớn
L là chiều dài của ống thì thời gian bay của hạt ion là
34
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.1.4. Phân tích định tính và định lượng
I
Trên đồ thị phổ khối, trục tung là cường độ chùm ion dương đi vào detector, trục hoành là tỷ số m/z.

Phân tích định tính: Dựa theo phổ các mẫu chuẩn có thể xác định sự có mặt của các nguyên tố, phân tử có trong mẫu phân tích.
- Phân tích định lượng: Theo cường độ vạch phổ của mẫu phân tích chứa nguyên tố, chất cần phân tích, so sánh với cường độ vạch phổ của mẫu chuẩn có thể xác định nồng độ
35
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.1.5. Phân tích nguyên tố
Trước khi ion hoá phải chuyển mẫu vào trạng thái nguyên tử ở thể hơi. Dùng các nguồn kích thích để vừa bảo đảm quá trình nguyên tử hoá mẫu, vừa bảo đảm sự ion hoá nguyên tử. Có thể dùng tia lửa, laze, plazma (thường dùng ICP-plazma cảm ứng cao tần) hoặc bắn phá bằng chùm các ion. Sau đó các dòng ion dương tạo thành sẽ được gia tốc trong điện trường.
Phương pháp dùng tia lửa điện: có độ chọn lọc và độ nhạy cao (giới hạn phát hiện đạt 10-12gam), có thể phân tích đồng thời nhiều nguyên tố (60-70 nguyên tố).
Hạn chế của phương pháp là mẫu thử phải dẫn điện. Tuy nhiên có thể khắc phục bằng cách rải một lớp kim loại tinh khiết lên bề mặt của mẫu.
36
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Phương pháp dùng tia laze, plazma: bảo đảm nguyên tử hoá và ion hoá mẫu, các đặc trưng phân tích cũng giống như dùng tia lửa điện
Phương pháp dùng chùm ion bắn phá: Để ion hoá mẫu dùng các ion sơ cấp argon, oxi hay các khí khác được tạo thành từ súng bắn ion. Chùm các ion sơ cấp tập trung bắn phá mẫu phân tích, các ion thứ cấp sinh ra từ mẫu.
Phương pháp này thuận tiện để nghiên cứu và phân tích cục bộ bề mặt vì sự hình thành khuyết tật ở bề mặt mẫu khi bắn phá không lớn và các ion sơ cấp thâm nhập vào mẫu nghiên cứu không sâu. Phương pháp này có giới hạn phát hiện rất nhỏ, tới 10-18gam
37
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.2.1. Các đồng vị trong phổ khối
Ion phân tử CH4+ cho pic cơ sở là M+, pic cường độ nhỏ có số khối lớn hơn 1 đơn vị tương ứng với phân tử metan chứa đồng vị 13C thay vị trí của 12C. Pic này được gọi là pic (M+1)+. Do đó các hợp chất hữu cơ đều đi kèm pic nhỏ có số khối lớn hơn 1 đơn vị.
Đetơri 2H là đồng vị hiđro, hàm lượng tự nhiên chỉ có 0,015% nên không thấy được pic tương ứng trên phổ khối.
38
39
Oxi có 2 đồng vị: 16O (chiếm 99,759%) và 18O (chiếm 0,204%).
Lưu huỳnh có 3 đồng vị: 32S (95%), 33S (0,76%) và 34S (4,22%).
Clo có 2 đồng vị: 35Cl (75,53%), 37Cl (24,47%).
Các nguyên tố trên đều có pic của đồng vị có số khối lớn hơn 2 đơn vị so với pic của ion phân tử, các pic này gọi là các pic (M+2)+. Do đó các hợp chất hữu cơ chứa O, S, Cl đều có các pic (M+2)+ trên phổ khối của chúng do sự có mặt của các đồng vị 18O, 34S và 37Cl
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Chlobenzene
112
114
VD
Trong clorobenzen, khoảng 25% các nguyên tử clo là 37Cl, do đó pic M+ (112) có cường độ lớn hơn khoảng 3 lần cường độ pic (M+2)+ (114)
40
41
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
42
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.3. Cơ chế tách mảnh
Độ bền của các cacbocation tăng dần theo dãy sau:
Sự xâm nhập của một electron NL cao vào phân tử tạo thành cation gốc do mất 1e. Tiếp theo sẽ xảy ra quá trình chuyển vị hoặc phân mảnh phụ thuộc vào cấu trúc của phân tử
Sự phân mảnh xảy ra theo chiều hướng tạo thành các cacbocation bền vững hơn
43
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.3.1. Ankan
Đối với các ankan mạch thẳng, quá trình sẽ tạo ra mảnh có khối lượng m/e = M-15 tương ứng với sự tách ra nhóm metyl
Thông thường quá trình tạo ra các mảnh m/e = 29, 43, 57, 71... ứng với M-14n-15
Ngoài ra có thể tạo thành phân tử etilen
44
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
VD: Phổ khối của butan và isobutan như hình dưới đây: M= 58
45
46
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.3.2. Anken
Trong phổ khối của anken thường xuyên xuất hiện mảnh m/e = 41 ứng với cacbocation allylic
VD: Buten -1
M = 56
47
48
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
49
4.3.2. Ankin
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Quá trình phân mảnh trong ankin cũng xảy ra tương tự như trong anken. Các mảnh thường xuyên thu được là 25 ( ), 39 ( )+ . Mảnh rất quan trọng 53 ứng với quá trình phân tách β ( )+.
50
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
51
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.3.3. Hidrocacbon thơm
52
Đối với các hợp chất thơm do phân tử rất bền nên pic phân tử thường xuyên xuất hiện và rất quan trọng
Khi nhân thơm liên kết trực tiếp với 1 nguyên tử cácbon sp3 thì quá trình phân mảnh thường cho một mảnh rất bền C7H7+ có m/z=91 (ion tropylium)
Mảnh m/z=65 cũng thường xuyên xuất hiện do tách một phân tử axetilen từ ion tropulium
53
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Phổ MS của các hydrocacbon thơm có 1 pic lớn của phân tử vì nhân thơm rất bền khó phân mảnh như phổ của benzene dưới đây
54
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Khi nhánh là mạnh thẳng thì xuất hiện các mảnh có khối lượng là 91 + 14n
Mảnh phân tử là 134, ngoài ra xuất hiện mảnh 91 + 14 = 105, mảnh 105 + 14 = 119
55
Khi nhánh có mạch lớn hơn 3 nguyên tử C thì mảnh m/z=92 thường xuyên xuất hiện do chuyển vị sau:
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
56
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.3.4. Rượu
Pic của ion phân tử M gần như không tồn tại, tuy nhiên mảnh M-17 (mất OH) thường xuyên quan sát được.
Đối với các rượu bậc 1 hoặc bậc 2, mảnh quan trọng nhất là M-18 (mất một phân tử H2O)
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.3.4. Rượu
Pic của ion phân tử gần như không tồn tại vì các phân tử rượu dễ dàng phân mảnh tạo thành ion oxonium.
57
58
Đối với các rượu phân nhánh rất khó khăn khi phân tích quá trình phá mảnh
+
2-metyl-butan-1-ol (M = 88)
m/e = 57
Mảnh thường xuyên gặp trong quá trình phân mảnh:
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Pic có m/e = 57 rất bền nhưng rất khó để giải thích sự hình thành nên cacbocation đó.
Pic có m/e = 70 tương ứng với quá trình đề hydrát hóa như sau:
59
60
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.3.5. Ete
a) Cắt liên kết α của nhóm metoxylbutan
b) Đóng vòng tạo cyclobutan
Quá trình phá mảnh của các ete xảy ra tương tự như đối với các rượu
61
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Phổ MS của metoxylbutan (M = 88)
62
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.3.6. Amine
Quá trình phân mảnh của các amin xảy ra tương tự như ở rượu, còn các amin bậc hai tương tự như ete.
VD: Phổ MS của N-metyl isobutyl amin
63
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.3.7. Anđêhit
Ở anđêhit có 4 cách phân mảnh đặc trưng sau đây. VD phổ MS của pentanal
a)
b) Cắt liên kết β
64
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
c) Cắt liên kết α
d) Chuyển vị McLafferty
65
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Phổ MS của pentanal (M = 86)
66
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.3.8. Xêton
Phân mảnh xêton R’COR” thường cho hai mảnh R’CO+ và R”CO+. VD
67
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Mức độ kém hơn:
Pic m/e = 57 tương ứng với cacbocation rất bền
68
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Phổ MS của 3,3-đimetyl butan-2-on (M = 100)
69
70
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.3.9. Axit
Chuyển vị dạng McLafferty ở axit butanoic
Tạo hai mảnh rất bền m/e = 45 và 57 trong trường hợp của axit 2,2-đimetyl propanoic ứng với quá trình phân cắt liên kết α
71
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Phổ MS của axit 2,2-đimetyl propanoic (M = 102)
72
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.3.10. Este
Sự phân mảnh của các este xả ra tương tự như ở axit, tuy nhiên có vài điểm khác nhau như sau
73
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Phổ MS của n-propyl etanoat (M = 102)
74
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Phổ MS của etyl propanoat (M = 102)
Đối với este đồng phân, phổ MS của etyl propanoat lại phức tạp hơn
75
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
4.3.11. Amit
a) propanamit
Thường xuyên quan sát được pic của ion phân tử và sự phá mảnh xảy ra khi cắt các liên kết ở vị trí α của nhóm C=O
76
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Có thể xảy ra sự chuyển vị McLafferty
Phổ MS của propanamit
77
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
b) benzamit
78
CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)
Phổ MS của benzamit
79