Phản ứng sinh hóa kiểm nghiệm vi sinh vật

Các thử nghiệm sinh hóa
GV: Nguyễn Văn Hạnh
Chương 4
Phân lập khuẩn lạc thuần khiết là cần thiết cho định danh VSV
Việc định danh dựa chủ yếu vào đặc điểm kiểu hình đặc biệt là các phản ứng sinh hóa.
Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa để định danh VSV:
Cách truyền thống
Sử dụng các bộ KIT
Sử dụng các thiết bị tự động
Thử nghiệm khả năng lên men
Mục đích: thử nghiệm khả năng sữ dụng các nguồn CH của các VSV
Nguyên tắc: VSV sử dụng CH  tao acid  giảm pH môi trường
Các loại carbonhydrate
Monocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose …
Dicarbonhydrate: sucrose, lactose …
Polycarbonhydrate: tinh bột, cellulose
Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO
Các loại đường rượu: chứa chức -OH
Phenol Red Carbohydrate Broth
Hấp ở 115oC trong 15 phút
Trang 104
Thử nghiệm khả năng lên men
Môi trường: Phenolred broth base bổ sung 0,5-1% đường cần thử nghiệm
VSV sử dụng được nguồn đường trong môi trường sẽ làm giảm pH  thay đổi màu chất chỉ thị phenolred
Phản ứng (+): môi trường chuyển vàng
Phản ứng (-): môi trường có màu đỏ
Thử nghiệm Citrate
Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrat như là nguồn cacbon duy nhất.
Cở sở sinh hóa:
VSV sử dụng citrate, sinh ra CO2 làm kiềm hóa MT
VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa MT
Thử nghiệm Citrate
Môi trường Simmon citrate agar (tr. 105)

Ammonium dihydrogen phosphate 1.0g
Dipotassium hydrogen phosphate 1.0g
NaCl 5g
Sodium citrate 2g
MgSO4 0,2g
Bromothymol blue 0,08g
Agar 13g
Thử nghiệm Citrate
Chú ý
- Cấy lượng sinh khối vừa đủ
- Có đối chứng trắng đi kèm
Thử nghiệm Urease
Mục đích: phát hiện VSV có mang enzym urease
Cơ sở sinh hoá:
(NH2)2CO + H2O  2 NH3 + CO2
 tăng pH môi trường  đỏ phenol (vàng – đỏ)
Môi trường sử dụng:
Urea Broth (Rustigian – Stuart)
Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng)
Môi trường Urea Broth
Thực hiện
Chuẩn bị môi trường
Cấy VSV vào 5ml môi trường
ủ 37oC/24 giờ
Quan sát
Thử nghiệm Urease
Thử nghiệm khả năng sinh H2S
Mục đích: phát hiện khả năng sinh H2S
Cơ sở sinh hóa:

Acid amin chứa S H2S

Thiosulfate H2S

H2S sinh ra được nhận biết bởi ion sắt, chì tạo kết tủa màu đen (FeS, PbS)
desulfohydrase
thiosulfate reductase
Thử nghiệm khả năng sinh H2S
Để phân biệt các loài thuộc họ Enterobacteriaceae và giống Proteus
Môi trường sử dụng:
KIA, TSI (thạch nghiêng)
SIM, PIA (thạch sâu)
BSA (thạch đĩa)
Cấy vsv lên môi trường Ủ (37oC, 24 – 48h)
Thử nghiệm khả năng sinh H2S
Đọc kết quả:

Xuất hiện màu đen trong môi trường
Không xuất hiện màu đen trong môi trường
(+)
(-)
(+)
ĐC
Thử nghiệm khả năng sinh H2S
(+)
(+)
(-)
Thử nghiệm khả năng sinh Indol
Mục đích
Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol  các VSV có hệ emzym tryptophanase
Chủng VSV
MT canh trypton
Thu?c th? Kovac`s
Pứ dương tính
Pứ âm tính
37oC / 24h
Thử nghiệm khả năng sinh Indol
Là phản ứng giúp phân biệt
E. coli (+) với Klebsiella (-)
Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+)
Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-)
…
Đối chứng (+) Proteus rettgeri
(-) Serratia marcescens
Thử nghiệm KIA/TSI
KIA: Kligler iron agar (trang 99)
Pepton 20g
Lactose 20g
Glucose 1g
NaCl 5g
Feric ammonium citrate 0,5g
Sodium thiosulphate 0,5g
Agar 15g
Phenol red 0,025g
Nước cất 1 lít
pH 7,4±0,2
Thử nghiệm KIA/TSI
TSI: Triple sugar iron agar (trang 106)
Pepton 20g
Lactose 10g
Sucrose 10g
Glucose 1g
NaCl 5g
Feric ammonium sulphate o,2g
Sodium thiosulphate 0,2g
Agar 13g
Phenol red 0,025g
Nước cất 1 lít
pH 7,4±0,2
Thử nghiệm KIA/TSI
Mục đích: phát hiện khả năng
sử dụng các nguồn cacbonhydrate
sinh H2S
tạo hơi (gas)
Ủ 37oC/24 giờ
Quan sát:
Phần nghiêng / phần sâu / hơi / H2S
Thử nghiệm KIA/TSI
Thử nghiệm MR (Methyl red)
Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền trong quá trình lên men glucose.
Cơ sở sinh hóa:
Chất chỉ thị pH: methyl red



MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường càng acid
MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có tính acid bị chuyển hóa – môi trường dần trung tính
 Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37oC
Thử nghiệm MR (Methyl red)
Môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth)
Chủng VSV
ủ 2 – 5 ngày
37oC
Pứ âm tính
Pứ dương tính
ĐC
MR-VP broth
Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
Mục đích: Phát hiện vsv tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong quá trình lên men glucose
Cở sở sinh hóa: Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm khí hoàn toàn.
2 pyruvate acetoin + 2 CO2
Phức màu hồng
Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
Môi trường sử dụng: MR-VP
Phương pháp tiến hành:
Cấy vi sinh vật trong môi trường MR-VP
Ủ 24 – 48 giờ, nhiệt độ 37oC
Bổ sung thuốc thử vào môi trường, lắc nhẹ
Đọc kết quả sau 20 phút và chậm nhất là 4 giờ.
Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
Kiểm tra thuốc thử bằng đối chứng
(+) : Enterobacter cloacea
(-) : E. coli
Đọc kết quả:
(+): màu đỏ trên môi trường
(-): mặt môi trường không đổi màu
(+)
(-)
Thử nghiệm Bile Esculin
Mục đích: xác định khả năng thủy giải glucoside esculin thành esculetin và glucose khi có sự hiện diện của muối mật.
Cơ sở sinh hoá:
Esculin là hợp chất nhân tạo
Esculetine được phóng thích phản ứng với Fe2+ tạo thành phức hợp màu đen
Môi trường Bile Esculine Agar
Glucose
Esculetine
Phân tử Esculine
Sự phân giải Esculine thành Glucose và Esculetine
Thử nghiệm Bile Esculin
Khuẩn lạc Enterococcus faecalis cho kết quả BEA (+)
Thử nghiệm Malonate
Mục đích
Phát hiện các VSV có khả năng sử dụng malonate như nguồn carbon duy nhất
Cơ sở sinh hoá
Malonate là chất cạnh tranh với succinate
Khi VSV phân hủy được malonate thì cũng phân huỷ được các nguồn đạm vô cơ khác  tạo thành sp kiềm  làm tăng pH môi trường
Thử nghiệm Malonate
Môi trường sử dụng:
Malonate broth (bromothymol blue)

Dương tính: MT chuyển màu xanh da trời
Âm tính: MT không đổi màu và không sinh khối
(+)
(-)
ĐC
Thử nghiệm catalase
Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzym catalase.
Cơ sở sinh hoá:
Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý

H2O2 H2O + O2 (bọt khí)
(hydrogen peroxide)
catalase
Thử nghiệm catalase
Thực hiện
VSV lấy từ môi trường nuôi cấy (lỏng, rắn)
Đặt VSV lên lam kính sạch
Nhỏ H2O2 30%
Quan sát sau 1-2 giây
Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện
Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện
Thử nghiệm catalase
Thử nghiệm catalase
Thử nghiệm catalase trên đĩa petri: sử dụng H2O2 30%
Thử nghiệm decarboxylase
Mục đích: xác định khả năng tạo enzyme decarboxylase xúc tác phân cắt nhóm carboxyl ở một số acid amin
Cấu trúc của phân tử
Amino acid
3 thử nghiệm quan trọng
Lysine decarboxylase (LDC)
Ornithine decarboxylase (ODC)
Arginine decarboxylase (ADC) / Arginine dehydrolase (ADH)

Các enzyme trên là các enzyme cảm ứng, chỉ được tạo ra khi trong môi trường nuôi cấy có cơ chất tương ứng
Cơ sở sinh hoá
Các sp tạo ra làm tăng pH môi trường  đổi màu chất chỉ thị
Môi trường sử dụng:
Decacboxylase Basal Medium
chỉ thị bromocresol purple (5,2 – 6,8)
Thử nghiệm decarboxylase
Biểu hiện sinh hoá
Dương tính: pH môi trường tăng
Âm tính: pH giảm
MT trước khi cấy
Pứ dương tính
Pứ âm tính
Thử nghiệm decarboxylase
THỬ NGHIỆM COAGULASE
Mục đích: Thử nghiệm khả năng làm đông tụ huyết tương bởi enzyme coagulase
Là bước cuối trong định danh các giống Staphylococcus
Chủng đối chứng (+): S. aureus
(-): S. epidermidis
Thử nghiệm tiến hành với huyết tương và fibrinogen.
THỬ NGHIỆM COAGULASE
Thử nghiệm bằng 2 cách
Thử trên phiến kính
Thử nghiệm trong ống nghiệm:
0,5ml huyết tương
0,5ml huyết dịch sinh khối
Ủ và đọc kết quả mỗi
30 phút
THỬ NGHIỆM COAGULASE
Kết quả thử nghiệm Coagulase
(+) khi xuất hiện khối đông tụ huyết tương
(-) không xuất hiện khối đông tụ, dung dịch đồng nhất
Thử nghiệm gelatinase
Mục đích: thử nghiệm khả năng phân giải gelatine bởi gelatinase.
Cơ sở sinh hóa:
Gelatine polypeptide + acid amin

Gelatine trong môi trường dinh dưỡng môi trường đông đặc
VSV phân hủy gelatine môi trường lỏng
gelatinase
Thử nghiệm gelatinase
Đối chứng dương: Aeromonas hydrophila
âm: E. coli
Môi trường sử dụng Nutrient Gelatine
Dạng ống nghiệm thạch sâu
Cấy vi sinh vật và ủ ở nhiệt độ phòng.
Thử nghiệm gelatinase
Đọc kết quả
(+) môi trường tan chảy
(-) môi trường không tan chảy
TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA
Mục đích: thử nghiệm khả năng chuyển hoá glucose theo các con đường khác nhau
Cơ sở sinh hóa:
Lên men: là quá trình kỵ khí, tạo môi trường acid cao
Ôxi hóa: là quá trình hiếu khí
TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA
Môi trường sử dụng: Oxidation/Fermentation media (Hugh & Leifson media)
Chỉ thị pH: bromocresol purple
TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA
TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA
Đọc kết quả:
A: đối chứng
B: phản ứng Ôxi hóa
C: phản ứng lên men
Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)
Mục đích: Thử nghiệm khả năng khử nitrate
Cở sở sinh hóa:
NO2 + sulphanilamine/N-napthylethylenediamine hydrochloride  chất màu hồng
NO3 + bụi kẽm  màu hồng
Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)
Phương pháp tiến hành:
Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường chứa nitrate
Bổ sung chất thử để kiểm tra sự hiện diện của nitrite
Phản ứng định tính nitrite (-) bổ sung lượng kẽm nhỏ để định tính nitrate
Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)
Thử nghiệm oxydase
Mục tiêu: phát hiện VSV có hệ enzym oxydase (hệ cytochrom C)
Cơ sở sinh hoá
Cytochrom C khử + H+ + O2 Cytochrom C ôxi hoá + H2O
Cytochrom C ôxi hoá + TMPD khử  TMPD ôxi hoá (màu xanh)
Thử nghiệm oxydase
Thuốc thử
TMPD (0,1%): N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine
Bảo quản lạnh trong tối
Thời hạn bảo quản: 2 tuần
Đối chứng (+): Serratia marcescens
(-) : Proteus rettgeri
Thử nghiệm oxydase
Thực hiện:
Lấy VSV từ Nitrient Agar đặt lên giấy thấm
Nhỏ thuốc thử TMPD
Quan sát sau 30 giây
Phản ứng (+): sinh khối chuyển màu xanh
Phản ứng (-): sinh khối vẫn màu trắng
Thử nghiệm oxydase
Thử nghiệm ONPG
Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme ß-galactosidase – enzyme cảm ứng.
Cơ sở sinh hóa:
ONPG o-nitrophenol
Màu vàng
Không màu
Thử nghiệm ONPG
Lactose agar
Chủng VSV
2ml ONPG broth
Pứ (+)
Pứ (-)
ủ qua đêm
37oC
Màu vàng
Thử nghiệm khả năng tan huyết
Mục tiêu: phát hiện các vi sinh vật có khả năng làm tan hồng cầu
Máu sử dụng: cừu, bê non, thỏ …
Cơ sở sinh hoá:
Các heamolysine là các tác nhân làm tan hồng cầu động vật
Vi sinh vật khác nhau  heamolysine khác nhau  cường độ và biểu hiện tan hồng cầu khác nhau
Thử nghiệm khả năng tan huyết
Phân loại: 3 kiểu tan huyết
Tan huyết hoàn toàn (ß): vòng tan huyết trong, rõ
Tan huyết không hoàn toàn (α):xung quanhvà dưới khuẩn lạc chuyển đục và có màu khác
Không tan huyết (ɣ): hoàn toàn không tan huyết
Thử nghiệm CAMP
Mục tiêu: thử nghiệm khả năng cộng hưởng tan huyết giữa các VSV
Cơ sở sinh hóa:
S. aureus tiết β-lysin gay tan hồng cầu
VSV tiết CAMP gây tan huyết
β-lysin + CAMP  gây tan huyết mạnh, hoàn toàn
Ý nghĩa: dùng phân biệt Streptococcus nhóm B (+) với Streptococcus nhóm khác (-)
Staphylococcus aureus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus pyogenes
(+)
(-)
Thử nghiệm tính di động
Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật.
Cở sở: Vi sinh vật di động nhờ tiêm mao
Các tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật vào môi trường thạch mềm (0,5% agar).
Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vết cấy.
Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh đường cấy, môi trường không bị đục.
Thử nghiệm tính di động
(+)
(+)
(-)
Ứng dụng thử nghiệm sinh hóa để định danh VSV
Mỗi loài vsv có những đặc tính sinh hóa khác nhau
Thực hiện kiểm tra các thử nghiệm sinh hóa có thể giúp xác định tên loài (định danh) vi sinh vật đó.
Bảng sinh hóa dùng định danh các loài vi sinh vật đường ruột (trang 23)
Hệ thống xác định vi sinh vật API-20E
(bioMerieux, Inc)