Phan tich du luong chat khang sinh trong thuc pham

Đại học Bách Khoa TP.HCM
Khoa công nghệ Hóa Học
Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm
BÁO CÁO PHÂN TÍCH THỰC PHẨM
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LƯỢNG DƯ THUỐC KHÁNG SINH TRONG THỰC PHẨM
TP.HCM, 12/2011
Sinh viên thực hiện:
1. Vũ Minh Triết 60902903
2. Bùi Thiên Duy 60900368
3. Trần Tấn Lộc 60901467
4. Trương Đờ Kháng 60901168
Giảng viên hướng dẫn: TS. Vũ Ngọc Hòa
Nội dung báo cáo tiểu luận
Giới thiệu tổng quan về chất kháng sinh
Các phương pháp xác định lượng chất kháng sinh trong thực phẩm
Biện pháp khắc phục lượng dư chất kháng sinh trong thực phẩm.
I. Giới thiệu chất kháng sinh
1 Định nghĩa
Kháng sinh còn được gọi là trụ sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn [1].
Tác dụng của chất kháng sinh
Được xem là phụ gia của thức ăn chăn nuôi gia sức và thủy hải sản
Làm thuốc chữa bệnh
Penicillin G
Cơ chế tác động của chất kháng sinh
Phân loại chất kháng sinh
Mặt trái của thuốc kháng sinh
Tích tụ thuốc kháng sinh trong cơ thể động vật và con người
Hiện tượng nhờn thuốc
Các chất kháng sinh cấm và giới hạn sử dụng
7. Các chất kháng sinh thường gặp trong thực phẩm
Thuốc kháng sinh họ fluoroquinolone
Chloramphenicol
Penicillin
Sulfonamit

II. Phương pháp xác định hàm lượng chất kháng sinh
Phân tích hàm lượng Chloramphenicol trong thủy sản bằng kít elisa thông qua phân tích khẳng định bằng LC – MS/MS.
Đối tượng: Tôm, cua, cá, ghẹ, hải sản,…
Dụng cụ
Kit thử của các hãng R-Biopharm và TAPB
Hệ thống LC-MS/MS
Tiến hành
- Phân tích trên LC – MS/MS
- Các thông số chính:
LC: Pha động: ACN: H20 (80:20)
Tốc độ dòng: 0,3ml
Thể tích tiêm:10ul
MS/MS: ESI (–)
MRM : 321  152
321  194
321  256
326  157
d. Kết quả
- Thứ tự phát hiện: Tôm = Nhuyễn thể < Cá < Cua, Ghẹ < Chả giò, há cảo < Thuỷ sản tẩm bột < Thuỷ sản khô < Mắm thuỷ sàn
Lượng tinh bột có trong mẫu phân tích có ảnh hưởng đáng kể đến độ chính xác của xét nghiệm ELISA.
Hàm lượng phát hiện là >0,3ppb.
Mức độ ảnh hưởng của nền mẫu tới kết quả của phép thử ELISA là khác nhau giữa các loại thủy sản khác nhau
2. Phương pháp xác định dư lượng kháng sinh streptomycin
Đối tượng: Chủ yếu là thịt gia súc như thịt heo,…
Dụng cụ:
Máy trắc quang UV-VIS
Cuvét thủy tinh có chiều dày 2 cm
Ngoài ra còn các dụng cụ của phòng thí nghiệm như:
c. Hóa chất
HCl 1M
NaOH 1M
Streptomycin sunphat
Nước cất
Tiến hành
Chuẩn bị mẫu phân tích
20g Nguyên Liệu
Nghiền, xay
10ml nước cất
Máy xay sinh tố
5 Phút
Định mức lên 50ml bằng nước cất
Đun cách thủy
Sôi trong 10 Phút
Li tâm, lấy nước trong
Phễu chiết
10ml clorofooc
Lắc 10 Ph, để yên 15 Ph
Tách lấy tướng hữu cơ
Phễu chiết
2 ml NaOH 1N
4ml K2SO4.24H2O
20 ml nước cất
Lắc 30 Ph, để yên 25 Ph
Dung dịch nước
Pha dãy chuẩn
Mẫu streptomycin sunphat nồng độ 1 mg/ml
Dung dịch 0.1μg/ml
Dung dịch 0.5μg/ml
Dung dịch …μg/ml
Dung dịch 2.5μg/ml
Định mức 20ml
Định mức 20ml
Định mức 20ml
Định mức 20ml
Thủy phân bằng kiềm
Thủy phân bằng kiềm
Thủy phân bằng kiềm
Thủy phân bằng kiềm
Đun cách thủy
Đun cách thủy
Đun cách thủy
Đun cách thủy
2ml K2SO4.24H2O 2%
2ml K2SO4.24H2O 2%
2ml K2SO4.24H2O 2%
2ml K2SO4.24H2O 2%
Định mức 20ml
Định mức 20ml
Định mức 20ml
Định mức 20ml
Để im 20Ph
Để im 20Ph
Để im 20Ph
Để im 20Ph
Tiến hành đo
Tiến hành đo
Tiến hành đo
Tiến hành đo
Các bước:
+ Đặt sóng đo và bật máy chạy cho ổn định (5 phút);
+ Đo mật độ quang của mẫu chuẩn và mẫu phân tích ở bước sóng 525 nm bằng Cuvét có chiều dày 2 cm. Dùng mẫu trắng ở kênh so sánh làm mẫu so sánh và đo mỗi mẫu 3 lần;
+ Lập đồ thị đường chuẩn theo hệ toạ độ D – C. Trong đó D là mật độ quang của dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ C tương ứng ;
+ Xác định nồng độ Cx của chất phân tích theo đường chuẩn đã dựng được.
e. Tính kết quả
 
Hàm lượng của streptomycin trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau:
 
Tính bằng g/g
 
Trong đó:
a là lượng mẫu cân (ở đây a = 20 g)
V là thể tích pha mẫu (V = 20 ml)
Cx là nồng độ streptomycin xác định được theo đường chuẩn
Co = (Cx .V) / a
3. Phân tích tồn dư kháng sinh nhóm Quinolone trong tôm bằng phương pháp ELISA
Đối tượng: Tôm,…
Mẫu
Mẫu trắng: 5 kháng sinh thuộc nhóm quinolones gồm enrofloxacin, flumequin, norfloxacin, Ciprofloxacin và sarafloxacin ở dạng bột và đều là sản phẩm của Sigma-Aldrich
Mẫu gốc: 1 mg/ml: Hòa tan trong metalnon và NH4OH 2M. Dung dịch dùng củng cố mẫu được pha loãng từ dung dịch gốc (1 mg/ml) bằng nước cất. Hỗn hợp methanol/PBS (50/50) pH 7,4 (dung dịch PBS pH 7,4 là hỗn hợp 9 gam NaCl, 7,78 gam Na2HPO4.2H2O và 0,75 gam KH2PO4 pha trong 1 lít nước cất).
- Mẫu Phân tích
Mẫu tôm tại các vị trí khác nhau
Bỏ đầu và vỏ
Nghiền đồng nhất bằng máy moulinex
Lưu giữ ở âm 80°C.
Dụng cụ
Kít ELISA phân tích Quinolone
Hệ thống LC-MS/MS
Các tham số độ xác thực và độ mạnh của phương pháp được tính toán theo các công thức sau:
Độ xác thực (%) = X %100
Độ nhạy (%) = X %100
Độ đặc hiệu (%) = X %100
 Trong đó :
N là tổng số mẫu phân tích = N+ + N-
N+ là số mẫu thực sự dương tính (mẫu củng cố)
N- là số mẫu thực sự âm tính (mẫu trắng)
PA là số mẫu dương tính theo kết quả phân tích trong số N+ mẫu
FN là số mẫu âm tính theo kết quả phân tích trong số N+ mẫu
FP là số mẫu dương tính theo kết quả phân tích trong số N- mẫu
NA là số mẫu âm tính theo kết quả phân tích trong số N- mẫu
d. Tiến hành
Mỗi kít phân tích 20 mẫu đã bao gồm 2 mẫu trắng và 2 mẫu củng cố của mỗi kháng sinh đại diện.
Mẫu được chuẩn bị và tách chiết theo hướng dẫn kèm theo trong kít.
Sau khi đọc giá trị OD (mật độ quang) của các giếng trên khay ở bước sóng 450 nm, kết quả được tính toán nhờ vào công thức thiết lập trên Microsoft Office Excel 2003.
Từ kết quả khẳng định khả năng nồng độ quinolone trong tôm.
Kết quả
Kết quả có được so với đường chuẩn
Kết luận
Kít có khả năng phát hiện tốt các kháng sinh thuộc nhóm quinolone được thử ở nồng độ 0,7 ppb.
Khi áp dụng kít này để phân tích mẫu kiểm soát dư lượng kháng sinh thuộc nhóm quinolone, để có kết luận chính xác về nồng độ dư lượng và đặc biệt địnhdanh chính xác hợp chất quinolone, cần áp dụng các phương pháp khẳng định như phương pháp sắc ký lỏng khối phổ.
Phương pháp kiểm tra nhanh Chloramphenicol
Đối tượng: thủy hải sản, mật ong,…
Thiết bị:
Dụng cụ phát hiện nhanh dư lượng Chloramphenicol
Ống nhỏ giọt sử dụng một lần
Dụng cụ
Ngoài ra, ta còn dùng
+ Chất hút ẩm (một miếng cho mỗi gói).
+ Chất đệm PBST (một lọ cho mỗi bộ).
Xử lí mẫu
5g Mẫu
Ống li tâm 50 ml
10 ml ethyl acetate
Lấy 7 ml lớp ethyl acetate phía trên
Lắc trong vòng 5-10 phút
Bình cô quay, bay hơi ethyl acetate
Cặn
650C, Bình cô quay chân không
0,3 ml dung dịch PBST
Ống nghiệm
0,3 ml dung dịch n–hexane
Trộn đều trong 1 phút
100 μl lớp dung dịch ở dưới đem xét nghiệm
Ly tâm: 5 phút / 4000 rpm / nhiệt độ phòng (20 – 25°C / 68 – 77°F) trong phòng
kiểm nghiệm, hoặc bằng giấy lọc nếu như kiểm tại cảng thu mua.
Tiến hành
Đọc kết quả
Âm tính: Hai vạch
Vạch thử (T) bằng hoặc đậm hơn vạch chuẩn (C), cũng là vạch tham chiếu (R). Kết quả này cho biết hàm lượng Chloramphenicol trong mẫu thử dưới 0,1 ppb.
Dương tính: Hai vạch
Vạch thử (T) nhạt hơn vạch chuẩn (C), hoặc không thấy vạch thử. Kết quả này cho biết hàm lượng Chloramphenicol trong mẫu thử trên 0,1 ppb.
Kết quả sai: khi vạch chuẩn không xuất hiện.
Kết quả này có thể do lượng mẫu thử không đủ hoặc quy trình kỹ thuật thực hiện sai. Xem lại quy trình và làm lại xét nghiệm với một dụng cụ mới.
Hiệu suất
Độ nhạy: Tối thiểu là 0,1 ppb
Độ chính xác: 94.7% (Kiểm tra tại 1 địa phương*)
Độ tiện dụng: Thuận tiện hơn so với phương pháp ELISA.
Khuyết điểm: Chưa đo được chính xác nồng độ của Chloramphenicol.
(*)Một thử nghiệm đa trung tâm đã được thực hiện tại Bình Thuận để so sánh kết quả xét nghiệm thực hiện bằng Dụng cụ phát hiện nhanh dư lượng Chloramphenicol với kết quả xét nghiệm thực hiện bằng phương pháp tương đối thông dụng trên thị trường là ELISA
Phương pháp định lượng Sulfonamit trong sản phẩm thuỷ sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Ở đây, Sulfonamit bao gồm: sulfađiazin, sulfathiazol, sulfamerazin, sulfamethazin, sufamethoxypiriđazin, sulfacloropyriđazin, sulfađoxin, sulfamethoxazoll, sulfadimethoxin và sulfachinoxalin
Giới hạn phát hiện: 5mg/Kg
Đối tượng: Thủy sản
Dụng cụ:
Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang
Cột sắc ký pha đảo C18
Máy lắc
Máy ly tâm
Máy rung trộn mẫu
Ống ly tâm thủy tinh
Và còn các dụng cụ khác như:
- Máy nghiền đồng thể, tốc độ 6000 – 30 000 vòng/phút (KCH-1000).
- Bình khí nitơ tinh khiết 99,999 %.
- Pasteur pipet với quả bóp cao su.
- Pipet định mức 5 và 10 ml.
- Bình định mức dung tích: 10; 20; 25; 100; 500 và 1000 ml.
- Giấy lọc 0,45 mm.
- Cốc có mỏ dung tích 250 ml.
c. Hóa chất
- Axetonitril (CH3CN) dùng cho HPLC.
- Diclorometan (CH2Cl2) dùng cho HPLC.
- Metanol (CH3OH) dùng cho HPLC.
- Axeton dùng cho HPLC.
- Nước cất dùng cho HPLC.
- Axit phosphoric (H3PO4) đậm đặc dùng cho HPLC.
- Dinatri hyđro phosphat (Na2HPO4).
- Axit xitric.
- Natri hyđroxit (NaOH.
- Tác nhân tạo dẫn xuất fluorescamin (Fluram).
- Chuẩn các chất nhóm sulfonamit.
- Chuẩn nội sulfanilamit.
Dung dịch thử và dung dịch chuẩn
- Các dung dịch natri hydroxit
- Dung dịch axetonitril/H3PO4 pH = 6,0
- Dung dịch đệm xitrat 0,5 M, pH = 3,0
Dung dịch đệm cho sự tạo dẫn xuất
Dung dịch fluorescamin 10 mg/ml
Các chất thuộc nhóm sulfanilamit
Các dung dịch chuẩn
Pha động
Tiến hành
- Mẫu thử
200g Nguyên Liệu
Nghiền bằng máy nghiền đồng thể
10 ml axetonitril và 2,5 ml điclorometan
Lấy 5g mẫu
Ống ly tâm thủy tinh 25 ml
Lắc
10 Phút
Li tâm
Bình định mức 25ml(*)
Tách lấy tướng hữu cơ
Chiết
Định mức bằng Axetonitril
10 phút, 6000 vòng/phút.
Mẫu trắng: Ta làm như mẫu thử
Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi 100 ng/g: Thêm chính xác 500 ml dung dịch các chuẩn sulfonamit trung gian 1000 ng/ml vào 5g mẫu trắng.
Chuẩn bị dung dịch dựng đường chuẩn:
10ml dung dịch chuẩn sulfonamit
Ống nghiệm thủy tinh 15 ml
Bay hơi tới cặn khô
Nitrogen ở nhiệt độ 50oC trên bể điều nhiệt
A
Ống nghiệm chứa mẫu
Lọc
30 - 50 Phút, nhiệt độ phòng
10 ml dung dịch
Hệ thống HPLC
Giấy lọc 0.45nm
(A): 1 ml dung dịch đệm tạo dẫn xuất , 20 ml dung dịch chuẩn nội sulfanilamit 5 mg/ml và 0,2 ml dung dịch fluorescamin 10 mg/ml.
- Tạo dẫn xuất huỳnh quang
- Chương trình pha động:
Các thông số:
Tốc độ dòng:                  0,6 ml/phút.
Thể tích tiêm:                  10 ml.
Bước sóng kích thích:       l = 405 nm.
Bước sóng phát xạ:          l = 495 nm.
Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích
- Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm: Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5%.
- Ðộ thu hồi (R): Ðộ thu hồi được xác định cho mỗi lần chạy mẫu phải nằm trong khoảng 60 -70 %.
Kết quả
Hàm lượng sulfonamit có trong mẫu được tính theo công thức sau:
                         

Trong đó:     
M là hàm lượng sulfonamit có trong mẫu, tính theo mg/kg;
C là nồng độ của từng chất thuộc nhóm sulfonamit thu được, tính theo ng/ml;
V là thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử, tính theo ml;
W là khối lượng mẫu thử (5,0 g).
III. Nhận xét
- Để có thể hạn chế được các chất kháng sinh thì ta phải áp dụng tối đa các biện pháp phòng tránh các chất kháng sinh, mà đặc biệt nhất là cấm sử dụng dư chất kháng sinh trong nuôi trồng gia súc, gia cẩm, thủy hải sản Ngoài ra, phải tăng cường phổ biến thông tin, nâng cao năng lực của người nông dân trong vấn đề chăn nuôi, cũng như ý thức của người nông dân và doanh nghiệp nhằm phòng tránh trường hợp thực phẩm bị nhiễm quá nhiều thuốc kháng sinh, gây hại cho người tiêu dùng.
Cảm ơn thầy cô và các bạn đã chú ý theo dõi