Nuôi cấy tế bào trần và ứng dụng

2.5.NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN VÀ ỨNG DỤNG
2.5.1. khái niệm và kỹ thuật
tách tế bào trần thực vật
a. KN: Tế bào trần thực vật (protoplast) là tế bào đã được loại bỏ thành tế bào chỉ còn màng sinh chất bao bọc khối tế bào chất và nhân tế bào.
b. Tế bào trần được sử dụng trong nghiên cứu:
+ lai cùng loài hay khác loài
+ chuyển gen
+ có khả năng tạo màng tế bào nhanh chóng đây là cơ sở ngghiên cứu quá trình tổng hợp màng tế bào
c. Tách tế bào trần ( 2 cách : cơ học và enzym): sau đây là các bước cơ bản:
- Mẫu lá non được rửa sạch với vòi nước máy.sát trùng bằng cồn 70-75 độ sau đó rửa bằng nước cất 3 lần, sau đó khử trùng bằng Na-hypochlorit hay Ca-hypochlorit khảng 7-15 phút. Lá làm sạch lá bằng Clorox 10% trong 10 phút, rửa lại lá 3 lần bằng nước cất tiệt trùng
- Ngâm lá vào dung dịch mannitol 8-15% trong 45-60 phút để tế bào co nguyên sinh.
- Tách lớp biểu bì mặt dưới lá để enzym ngấm sâu vào nhu mô thịt lá.
- Cắt lá thành từng mảnh nhỏ, ngâm 1g lá trong đĩa petri. Dung dịch enzym gồm cellulase, hemicellulase,pectinase +manitol 13%. Đặt mẫu trong tối qua đêm (12-18 giờ, ở 25 độ) thu được hỗn hợp protoplast.
- Dịch protoplast ly tâm trong 5 phút, bỏ phần bã nổi lên trên,protoplast ở đáy. Rửa bằng 10ml dung dịch môi trường MS + Manitol 13%,thao tác thực hiện 3 lần.
d. Xác định mật độ protoplast và khả năng sống sót
Nhuộm protoplast bằng Fluorescein diacetate để xác định sự sống sót của protoplast. Số lượng protoplast được xác định bằng buồng đếm hồng cầu.
e. Nuôi cấy protoplast
2.5.2. Dung hợp tế bào trần và lai vô tính
a. Tự dung hợp
vì màng sinh chất của tế bào(-) do nhóm P và Protein nên các tế bào trần đẩy nhau nên không tự dung hợp. Do đó phải làm các rế bào trần tiếp xúc nhau nhờ PEG hay sốc điện.
b. Hóa dung hợp:
Sự hóa dung hợp có thể thực hiện với NaNO3 0,25M, PVA 15 %…nhưng tần số dung hợp thấp nên ít được sử dụng.
Virut Senday đã giảm hoạt tính là chất thường dùng hiện nay bằng cách cho giọt hỗn hợp 2 loại tế bào trần tiếp xúc từ từ với các giọt PEG 25- 50%
c.Điện dung hợp (tốtnhất):
Khi đặt hỗn hợp 2 loại tế bào trần trong 1 điện trường, các tế bào trần sẽ di chuyển, tiếp xúc nhau và xếp thành 1 chuỗi dài dưới lực điện trường
Sau đó dùng xung điện ngắn đẻ tạo vết đứt ở màng, sự dung hợp sẽ xảy ra tại nơi tiếp xúc.
Khi dung hợp tế bào trần với nhau thường có ba nguồn gen tham gia (nhân,ty thể,lạp thể). Có thể xảy ra các hiện tượng:
- chỉ dung hợp nguyên sinh chất và các cơ quan tử
- chỉ có sự dung hợp nhân
- có cả dung hợp nhân và tế bào chất
TH 1 -> các tế bào cybride. TH 2 và 3 ->tế bào lai thực thụ hybride.
Ứng dụng: bằng phương pháp lai tế bào đã thành công trong tạo cây lai từ hai loài thuốc lá khác nhau, cây lai giữa khoai tây và cà chua.
2.5.3. Biến nạp gen vào protoplast thực vật
Phương pháp đưa AND vào cơ thể và tế bào khác
- Phân lập AND bằng các phương pháp khác nhau: PCR,sử dụng enzym phiên mã ngược, tách gen bằng RE.
- Sử dụng các vector tự nhiên để biến nạp vào tế bào.
+ thể thực khuẩn bám vào thành tế bào đưa AND vào tế bào chủ, trong tế bào chủ AND của genom của phage biểu hiện và tổng hợp phage mới.
+ Plasmid: ngày nay người ta đã thiết kế được nhiều loại plasmid để đưa AND lạ vào tế bào.
Biến nạp gen vào protoplast thực vật
Các bước biến nạp:
Phân lập mARN của gen A: chọn loại tế bào và giai đoạn thích hợp mà ở đó quá trình sao mã sảy ra mạnh. Phân lập bawnngf các kỹ thuật: điện di,sắc ký.
tổng hợp gen invitro: bằng enzym phiên mã ngược thu được cADN
Sử dụng cADN đặc trưng làm phân tử đánh dấu để phân lập đoạn gen tương đồng trong thư viện genom
Gắn với vector: thường sử dụng các plasmid kháng kháng sinh để tiện lợi cho chọn sản phẩm biến nạp sau này. Dùng RE để mở vòng plasmid, enzym ligase để nối AND tạo thành AND tái tổ hợp.
Biến nạp AND tái tổ hợp vào tế bào: có các phương pháp sau:
+ biến nạp bằng hóa chất: chủ yếu dùng PEG (polyethylen glycol)
+ biến nạp bằng xung điện
+ biến nạp bằng súng bắn gen
+ biến nạp thông qua agrobacterium
họn lọc sản phẩm biến nạp : nuôi trên môi trường chọn lọc chứa kháng sinh đặc hiệu, chỉ những tế bào có plasmid mang gen kháng sinh có thể sống sót và phát triển,từ đó chọn được tế bào biến nạp thành công.
Đánh giá kết quả biến nạp và theo dõi số phận của các gen biến nạp theo các cách sau:
+ theo dõi biểu hiện của gen biến nạp
+ Phân lập và nhân gen biến nạp bằng kỹ thuiaatj PCR
+ Phân tích RFLP