Nuôi cấy tế bào trần

Nuôi cấy tế bào trần thực vật và ứng dụng
Khái niệm tế bào trần:
Tế bào trần thực vật (protoplas) là tế bào đã bị loại bỏ thành tế bào chỉ còn màng sinh chất bao bọc khối tế bào chất và nhân tế bào.
ÍCH LỢI CỦA TẾ BÀO TRẦN
Tế bào trần có khả năng tái tạo vách và cho phôi thể hệ.
Nuôi cấy tế bào trần sẽ mở ra 1 mô hình hấp dẫn để theo dõi quá trình sinh phôi thể hệ từ 1 tế bào cô lập. Đặc biệt biết được sự sắp xếp các sợi Xenluloz để xác định hướng kéo dài tế bào, vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia.
Thuận lợi cho sự nghiên cứu về sinh lí tế bào: tính thấm của màng, vận chuyển các chất hòa tan, ion, cơ chế hoạt động của hoocmon thực vật…
Tế bào trần có thể chịu các xử lí gây đột biến và được dùng để tạo ra các dòng tế bào có nguồn gốc đơn bào.
Tế bào trần thiết yếu cho sự lai thể hệ( dung hợp tế bào trần) và áp dụng các kĩ thuật chuyển gen( bơm AND, hóa thẩm, điện thẩm…)
Ứng dụng
- Lai cùng loài hay lai khác loài
- Chuyển gen
- Có khả năng tạo màng tế bào nhanh chóng  để nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp màng tế bào
- Quần thể tế bào trần được nghiên cứu như hệ thống các tế bào đơn
Phương pháp cơ bản để nuôi cấy tế bào trần
- Khử trùng lá
- Ngâm mẫu trong dung dịch thẩm thấu để tế bào co nguyên sinh
- Tách lớp mặt dưới lá
- Ngâm mẫu trong hỗn hợp enzym
- Tinh sạch tế bào trần
- Nuôi cấy tế bào trần trong dung dịch thích hợp
-
Ví dụ: phương pháp tách tế bào trần từ lá:
Lá non khử trùng bằng Clorox 10% (10’), rửa sạch bằng nước cất 3 lần
Ngâm vào dung dịch malniton 8 - 15 % (45 - 60’)  co nguyên sinh
Tách lớp biểu bì mặt dưới lá
Ngâm 1g lá trong dung dịch enzym phân hủy thành tế bào, bổ sung maniton 13% để trong tối qua đêm (12 – 18h, 25o)  Hỗn hợp protoplas
Li tâm (5’)  protoplas ở đáy, rửa sạch bằng 10ml MS + maniton 13% (tiến hành 3 lần)
Nuôi cấy protoplas
Phương pháp cấy chìm được sử dụng nhiều nhất
Dùng pipet hút 5ml dịch protoplas cho vào petri (chứa 5ml MS + maniton 13% + 1.5% agar , 4 oC ), đặt trong tối 25oC
Chất nguyên sinh được tổng hợp
10 – 15 ngày
Màng được tái sinh, tế bào phân chia hình thành mô sẹo
Bổ sung auxin
không auxin và maniton
Mô sẹo tăng sinh khối
Tạo phôi cây hoàn chỉnh
Thông thường, tế bào trần cần 1-2 ngày cho sự hình thành vách, 2-7 ngày cho các lần nhân đôi đầu tiên, 3-4 tuần cho sự tăng trưởng mô sẹo, sau đó 1-2 tháng để có phôi hình cầu, 1tháng nữa để có cây nảy mầm.
SỰ LAI THỂ HỆ BẰNG KĨ THUẬT DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN
Khái niệm:
Dung hợp là hiện tượng cắt đứt màng sinh chất nơi tiếp xúc giữa 2 tế bào trần khác loài do tác động của các nhân tố bên ngoài. Sau đó là sự tái tổ chức các màng ban đầu thành 1 và bao lấy tế bào chất và 2 nhân cha mẹ.
Ưu điểm: những tế bào trần (không vách) có thể dễ dàng dung hợp vào nhau thành tế bào lai mang vật chất di truyền của cả hai tế bào  Tái sinh thành cây lai vượt qua những khó khăn trong lai xa
CÁC HÌNH THỨC DUNG HỢP
Tự dung hợp:
Vì màng sinh chất của tế bào(-) do nhóm P và Protein nên các tế bào trần đẩy nhau nên không tự dung hợp. Do đó phải làm các tế bào trần tiếp xúc nhau nhờ photphopolietylenglicol (PEG) hay sốc điện.
Hóa dung hợp:
Sự hóa dung hợp có thể thực hiện với NaNO3 0,25M, PVA 15 %…nhưng tần số dung hợp thấp nên ít được sử dụng.
Virut Senday đã giảm hoạt tính là chất thường dùng hiện nay bằng cách cho giọt hỗn hợp 2 loại tế bào trần tiếp xúc từ từ với các giọt PEG 25- 50%
Điện dung hợp :
Khi đặt hỗn hợp 2 loại tế bào trần trong 1 điện trường, các tế bào trần sẽ di chuyển, tiếp xúc nhau và xếp thành 1 chuỗi dài dưới lực điện trường
Sau đó dùng xung điện ngắn để tạo vết đứt ở màng, sự dung hợp sẽ xảy ra tại nơi tiếp xúc.
Có 3 loại dung hợp
Dung hợp đối xứng: dung hợp 2 protoplas có nhân cùng ở mức bội thể
Dung hợp không đối xứng: tạo các thể lai tế bào chất( Cibride). Một trong 2 protoplas sẽ bị tiêu diệt nhân trước khi dung hợp
Chọn dòng tế bào
Dung hợp cả nhân và tế bào chất (lai sinh dưỡng chọn vẹn)
Xử lí đột biến protoplas hoặc đưa chúng vào tình trạng stress để thanh lọc nhằm chọn ra các dòng có tính chống chịu với điều kiện bất lợi
Biến nạp gen vào protoplas thực vật
*. Phương pháp đưa ADN vào cơ thể và tế bào khác.
+ Phân lập ADN bằng các phương pháp : PCR, sử dụng enzyme sao mã ngược, tách gene bằng RE.
+ Sử dụng các vecter tự nhiên để biến nạp vào tế bào :
- thực khuẩn thể (phage)
- plasmis
*. Biến nạp gene vào protoplass thực vật
Phân lập mARN của gene A
Tổng hợp gene invitro
cADN
Sử dụng cADN đặc trưng làm phân tử đánh dấu để phân lập ra đoạn gene tương đồng trong thư viện genome
Gắn gene với vecter
Biến nạp AND tái tổ hợp vào tế bào
Chọn lọc sản phẩm biến nạp
Đánh giá kết quả biến nạp và theo dõi số phận của gene biến nạp