Nuôi cấy mô tế bào thực vật

Chủ đề:

NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG IN VITRO
Lịch sử nuôi cấy
mô tế bào


-
Giai đoạn khởi xướng( 1898- 1930):
Haberlandt(1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thưc vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào dựa trên thuyết tế bào của Schleiden-Schwann

Giai đoạn nghiên cứu sinh lý(1930-1950):
Bắt đầu với công trình của White(1934) nuôi cấy thành công rễ cà chua trên môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose, dịch chiết nấm men
1935 Thimann đã phát hiện ra auxin(IAA) trong mô thực vật. Nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng IAA cùng các vitamin bổ sung vào môi trương nuôi cấy đã thu được kết quả tốt.
Những năm 1940 nhiều chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm IAA được tổng hợp thành công và được sử dụng nhiều trong nuôi cấy kết quả cho thấy chất này có tác dụng kích thích tạo mô sẹo, phân chia tế bào
Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái(1950-1960)
1954-1955 Skoog phát hiện kinentin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào.
1956 Skoog và Miller tìm hiểu ảnh hưởng của tỉ lệ Auxin/Cytokinin trong môi trường nuôi cấy đến sự hình thành cơ quan và tạo được chồi từ lá cây thuốc lá
1960 Bergman đã tái sinh tế bào đơn thuốc lá trong môi trường lỏng
Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô tế bào vào công nghệ sinh học thực vật(1960 đến nay)
1960 Cooking đã dùng enzym cellulase phân huỷ vỏ cellulose của tế bào thực vật thu được tế bào không vỏ gọi là tế bào trần
1968 Nakata và Tanaka tạo được cây thuốc lá đơn bội bằng cách nuôi cấy bao phấn
Từ 1977 Melchers dung hợp tế bào trần giữa khoai tây và cà chua thành công tạo ra cây lai khoai tây-cà chua
Từ năm 1980 hàng loạt nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học đã được công bố
Ngày nay nuôi cấy mô tế bào không những là cơ sở quan trọng của công nghệ sinh học hiên đại mà còn là công cụ quan trong trong chon tạo nhân giống, đóng góp cơ sơ ly luận mới cho sinh học hiên đại
KHÁI NIỆM
Nuôi cấy mô- tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm.
CƠ SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ- TẾ BÀO
Tính toàn năng :
- Tế bào bất kì của cơ thể simh vật nào cũng mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của sinh vật đó,khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cá thể hoàn chỉnh
Tùy từng tế bào, từng loại mô, từng thời kì sinh trưởng, phát triển mà các gen phù hợp hoạt động; các gen không cùng hoạt động như nhau trong các giai đoạn phát triển của cơ thể (do cơ chế điều hòa hoạt động của gen).
SỰ PHÂN CHIA, PHÂN HOÁ, PHẢN PHÂN HOÁ CỦA CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ-TẾ BÀO
Phân hóa: 1 tế bào,1khối tế bàophân hóa tạo mô cơ quan hệ cơ quan.
Phản phân hóa: khi các tế bào đã phân hóa thành các mô chức năng riêng biệt nhưng vẫn có thể quay về trạng thái chức năng phôi sinh ban đầu khi gặp điều kiện thuận lợi.
Sự trẻ hoá
- Khả năng ra chồi,rễ ở các thành phần khác nhau là rất khác nhau
- Trong nuôi cấy invitro các bộ phận non trẻ sẽ ra chồi,rễ tốt hơn các bộ phận trưởng thành
CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BẢO THÀNH CÔNG TRONG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ- TẾ BÀO THỰC VẬT:
Đảm bảo điều kiện vô trùng, phòng thí nghiệm phải chuyên hóa cao.
Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách.
Chọn mô cấy, xử lí mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.


Các điều kiện cần thiết của nuôi cấy mô - tế bào thực vật.
Phòng thí nghiệm.
B? trớ theo so d?:
Phũng chu?n b? v� gi? mụi tru?ng ? Phũng c?y ? Phũng nuụi cõy

Môi trường vật lý.
ánh sáng: Bao gồm:
+ Chất lượng ánh sáng
+ Thời gian chiếu sáng
+ Cường độ chiếu sáng
Nhiệt độ: Thích hợp nhất là 25 0C.
Môi trường hoá học
Hầu hết các loại môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều bao gồm:
Các loại muối khoáng đa lượng và vi lượng, nguồn cacbon, vitamin, các chất điều hoà sinh trưởng, các nhóm chất b? sung, ch?t d?n .





Các nguyên tố khoáng đa lượng.
-Nitơ (N): dạng NO-3 và NH+4 riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau
-Phốtpho (P): thường ở dạng ortophotphat hoặc đường phốtpho.
-Lưu huỳnh (S): ở dạng muối SO4-2 với nồng độ thấp
-Các ion Na+ và Cl- cần ở nồng độ thấp
Các nguyến tố khoáng vi lượng.
-Sắt (Fe): thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia
-Mangan (Mn): Thiếu Mn kém phân bào.
- Bo (B): Thiếu B trong môi trường gây nên biểu hiện như thừa auxin vì thực tế Bo làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm. Mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hoá mạnh, nhưng thường là loại mô sẹo xốp, mọng nước, kém tái sinh.

Cây in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, mặc dù dưới ánh sáng nhân tạo chúng có khả năng hình thành diệp lục và quang hợp nhưng bị hạn chế cho nên việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn các bon dưới dạng hữu cơ là bắt buộc, giúp cho tế bào phân chia và tăng sinh khối.
Tuỳ thuộc mục đích và sự đòi hỏi của từng hệ mô có thể dùng các loại đường khác nhau: Sucrose, Maltose, Glucose, Galactose và Lactose. Hàm lượng đường bổ sung vào môi trường nuôi cấy thường là 20 - 40 g/l.
Các vitamin.
Các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng nên phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin nhóm B.
- Vitamin B1 (thiamin) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi cacbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzym xúc tác quá trình oxy hoá khử cacbon ở axit hữu cơ. Nồng độ thường dùng từ 0,1- 10 mg/l.
- Vitamin B6 (piridoxin) tham gia vào thành phần các enzym khử cacbon và thay đổi vị trí nhóm amin trong các axitamin. Nồng độ dùng từ 0,1 - 1 mg/l.
Myo - inositol cần được bổ sung một lượng khá lớn từ 50 - 500 mg/l và tỏ ra có tác dụng rất rõ đến sự phân chia của mô.
Các chất bổ sung:
Bao gồm nước dừa,dịch chiết nấm men,chất độn.
Nguồn cacbon
Các chất điều hoà sinh trưởng
Chất điều hoà sinh trưởng gồm có các phytohormone và các chất điều chỉnh sinh trưởng tổng hợp nhân tạo.
Phytohormone là các chất hoá học được thực vật tổng hợp với một lượng rất nhỏ ở các bộ phận, cơ quan nhất định và được vận chuyển đến các cơ quan, bộ phận khác để điều hoà các quá trình sinh lý trong cây, đảm bảo mối quan hệ hài hoà giữa các cơ quan, bộ phận.
Auxin

Auxin - hormone kích thích thực vật sinh trưởng
Auxin được định nghĩa là chất có hoạt tính sinh học giống với IAA:
kích thích kéo dài các tế bào lá bao mầm và lát cắt thân cây tách rời.
cùng với cytokinin kích thích sự phân chia của các tế bào mô sẹo (callus culture).
kích thích hình thành rễ từ lá và thân cây tách rời.
kích thích một số hiện tượng sinh trưởng và phát triển khác tượng tự như hoạt tính của IAA.
Kích thích sự hình thành,sự sinh trưởng của quả và tạo qủa không hạt
Gây ra tính hướng động của cây,kìm hãm sự rụng lá,hoa,quả
Trong cây được tổng hợp ở mô non, đặc biệt lá đang phát triển và vùng đỉnh sinh trưởng
Hiện đã xác định được 136 GA, chúng có cấu trúc hoá học khác nhau song có đều có bộ khung gibberellase
GA được đặt tên theo thứ tự phát hiện: GA1, GA2,..., GAn, trong đó GA3 là loại được phân tích cấu trúc đầu tiên, đây cũng là loại GA có hoạt tính mạnh và được ứng dụng rộng rãi.
Gibberellin - chất điều hoà phân chia tế bào thực vật
Trao đổi gibberellin
Tổng hợp : Các GA bản chất là các acid diterpene được tổng hợp bằng con đường terpenoid trong lạp bào, sau đó được biến đổi hoá học trong lưới nội chất và tế bào chất cho tới khi hoàn thiện cấu trúc để trở thành dạng hoạt động
GA được tổng hợp
Trong phôi đang sinh trưởng, lá non, rễ non, quả non;
Chủ yếu trong lục lạp
Vận chuyển không phân cực trong xylem và phloem hay giữa các tế bào cạnh nhau
Có thể liên kết với đường (thường là glucose) trở thành dạng không hoạt động
GA khá bền vững trong cây, ít bị phân huỷ

Cơ chế
Sự sinh trưởng kéo dài của thân:
GA kích thích sự kéo dài của tế bào (không bằng cơ chế sinh trưởng acid như auxin), tuy nhiên trong thực tế GA luôn xuất hiện cùng auxin  có thể tác dụng kéo dài của GA phụ thuộc vào auxin.
GA kích thích sự phân chia tế bào bằng cách khởi động một số gene CDK (cyclin-dependent protein kinase) có vai trò trong điều hoà chu trình tế bào (chuyển tế bào từ pha G1 sang pha S).
Hiệu quả sinh lý
Kích thích sự sinh trưởng kéo dài của thân (được xác định do vai trò của GA1)
Sinh trưởng các đột biến lùn (thiếu gene chịu trách nhiệm tổng hợp enzyme trong con đường tổng hợp GA)
Hiệu quả sinh lý
Kích thích sự nảy mầm của hạt, củ
Kích thích sự vươn dài của các gióng cây họ lúa
Kích thích sự ra hoa
Ức chế phát triển hoa cái, kích thích phát triển hoa đực

Hiệu quả sinh lý
Cytokinin - chất điều hoà phân chia tế bào thực vật
Cytokinin được định nghĩa là những chất hoá học có hoạt tính giống với trans-zeatin
kích thích phân chia tế bào mô sẹo
kích thích hình thành rễ/chồi trong mô sẹo
làm chậm quá trình già hóa của lá
kích thích phát triển của lá mầm

Về cấu trúc, đa số cytokinin có dạng purine được thay thế N tại vị trí C6


Zeatin
cytokinin là những dẫn xuất từ tARN thực vật, chúng được tổng hợp trong hệ rễ, rồi được vận chuyển không phân cực trong xylem lên ngọn. Ngoài ra chúng còn được tổng hợp ở chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh…
cytokinin trong thực vật có thể ở dạng tự do hoặc liên kết, chúng nhanh chóng bị chuyển hoá nhờ các enzyme oxidase thành adenine rồi theo con đường chuyển hóa adenin để tái sử dụng trong cơ thể hoặc phân giải thành sản phẩm cuối cùng là urea.
Cytokinin được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan
Tác động phối hợp của Auxin và Cytokinin có tác dụng quyết định sự phân hoá của mô theo hướng tạo rễ
Điều hoà sự phân hóa cơ quan
auxin/cytokinin cao  kích thích ra rễ
auxin/cytokinin thấp  kích thích nảy chồi
Chọn vật liệu nuôi cấy
Tạo chồi
Khử trùng
Tạo rễ
Cấy cây vào môi trường thích ứng
Sơ đồ : quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô TB
1. Quy trình
Trồng cây trong vườn ươm
Bước 1
Bước 2
Bước 3
Bước 4
Bước 6
Bước 5
Quy trình tổng quát công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật in-vitro
- Đỉnh chồi, đỉnh rễ : là bộ phận non, dễ tham gia vào quá trình phân hoá và phản phân hoá tạo nên cơ thể mới.Thường ít nhiễm bệnh.

Bước 1: Chọn vật liệu nuôi cấy
Bước 2 : Khử trùng

Buồng khử trùng
Bước 2 : Khử trùng
- Mẫu và dụng cụ được tẩy rửa khử trùng.
- Cắt đỉnh sinh trưởng thành phần tử nhỏ, tẩy rửa, khử trùng ở buồng vô trùng.
VD:
- Vật liệu nuôi cấy tiến khử trùng với HgCl 0,1% và nước cất.
- Que cấy, ống nghiệm và giá thể.được khử trùng trong nồi hấp.
Bước 3 : Tạo chồi
Khối callus chuẩn bị tạo cây con
Cây con mới đang hình thành
Bước 3 : Tạo chồi
- Để cây có thể phát triển thân cành
- Cắm vật liệu nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung thêm xytokinin hoạt hoá tạo chồi.
Bước 4 : Tạo rễ
- Khi cây đạt tiêu chuẩn về chiều cao, số lá thì chuyển sang MT tạo rễ. Đó là MT dinh dưỡng thích hợp bổ sung chất KT auxin, IBA.

Tạo rễ
Bước 5 :Cấy cây vào môi trường thích ứng

- Chuyển cây sang MT thích ứng gần giống với MT tự nhiên về: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng...

- Không thể bỏ qua bước này được vì cây mới tạo ra rất yếu. Nếu trồng trực tiếp vào MT tự nhiên cây sẽ dễ nhiễm bệnh và chết.
Bước 5 :Cấy cây vào môi trường thích ứng
Bước 6: Trồng cây trong vườn ươm
- Cho cây thích ứng với MTSX.
- Khi cây đủ chiều cao, thân lá thì chuyển cây ra vườn ươm nhân nhanh SX.
Quy trình nhân giống Lan bằng nuôi cấy mô in-vitro
Các phương thức nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô thực vật trên môi trường cứng
Nuôi cấy huyền phù tế bào
Nuôi cấy mô tế bào thực vật trên môi trường cứng
Tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu mô nuôi cấy
Vật liệu nuôi cấy: Chủ yếu là những khối mô và cơ quan tách rời:mô phân sinh, đỉnh sinh trưởng,mảnh lá,..
Các bước tiến hành:
+ Lựa chọn vật liệu
+ Khử trùng vật liệu nuôi cấy
+ Cấy vào môi trường mẫu
+ Nhân nhanh chồi
+ Chuyển sang môi trường tạo rễ,tạo cây hoàn chỉnh

Tái sinh chồi gián tiếp qua
giai đoạn mô sẹo(callus)
Bao gồm các bước:
+Lựa chọn vật liêu
+Khử trùng vật liệu nuôi cấy
+Vào mẫu môi trường:
Không bật chồi trực tiếp
mà tạo mô sẹo hoặc protocom
Nhân nhanh mô sẹo hoặc protocom
Cho mô sẹo hoặc protocom tái
sinh tạo chồi
+Nhân nhanh chồi
+Tạo rễ tạo cây hoàn chỉnh
+Đưa cây ra môi trường ngoài
Nuôi cấy huyền phù tế bào
Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào chứa các tế bào và các khối tế bào, sinh trưởng phân tán trong môi trường lỏng Thường được khởi đầu bằng cách đặt các khối mô callus dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy). Nuôi cấy dịch huyền phù vì thế là sự tiến triển từ thực vật đến mẫu vật, tới callus, và cuối cùng tới dịch huyền phù. Nuôi cấy dịch huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối của tế bào thực vật so với nuôi cấy callus, do nuôi cấy dịch huyền phù có thể duy trì và được thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật được ngập chìm trong môi trường lỏng.




Các phương pháp nuôi cấy
huyền phù tế bào
+Nuôi cấy dịch thể tĩnh: Chỉ áp dụng với 1 số trường hợp nghiên cứu và 1 số thí nghiệm
+ Nuôi cấy dịch thể động: Mẫu nuôi cấy được thả trực tiếp vào môi trường dịch thể,song phải có biện pháp sục khí vào môi trường.Phương pháp này chủ yếu tạo mô sẹo và phôi soma
Có 2 phương pháp:
* Chìm liên tục ( tuần hoàn ): Mẫu nuôi cấy lúc nào cũng chìm trong dịch thể,phải dùng thiết bị khuấy từ
* Chìm không liên tục ( không tuần hoàn ) : Sử dụng hệ thống bập bênh
Xác định tốc độ sinh trưởng tế bào
+Xác định số lượng tế bào: Đếm dưới kính hiển vi
*Lấy 1 thể tích dịch thể nhất định có chứa tế bào
* Tách riêng rẽ các tế bào bằng dd cloromium trioxide ( 5-10% W/v ), đồng thời đun nóng ở 700C trong 5’-10’ đủ để gây ra sự phân tách các tế bào nhưng chưa làm phân huỷ tế bào,sau đó làm nguội và lắc mạnh
* Pha loãng huyền phù tế bào đến nồng độ phù hợp,nhuộm và đếm trong buồng đếm tế bào
Từ đó tính được số tế bào trong 1ml dd cấy
+ Xác định thể tích tế bào:
Lấy ngẫu nhiên 1 lượng thể tích nuôi cấy dd huyền phù sau đó đem ly tâm (thường 200 vòng/p ) trong 5’,thu lấy tế bào rồi đo thể tích của tổng khối tế bào
+Xác định khối lượng tế bào khô,tươi : Ứng dụng đẻ thu chất thứ cấp

Ý nghĩa khoa học
- Tạo ra 1 quần thể cây con đồng đều giữ nguyên đặc tính của cây mẹ
- Hệ số nhân nhanh cao
- Rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất và phát huy được hiệu quả kinh tế
- Nhân được số lượng cây lớn trong 1 diện tích nhỏ
- Đảm bảo các cây giống sạch bệnh
- Cây con được tạo ra nuôi cấy mô được trẻ hoá cao độ
- Thuận tiện và hạ giá thành vận chuyển
- Bảo quản cây giống thuận lợi
Ứng dụng trong thực tiễn
Nhân cây giống,tạo cây giống
Sản xuất chất thứ cấp
+ Chất thứ cấp ứng dụng trong công nghiệp
thực phẩm: chất tạo mùi,màu,chất ngọt
+ Chất thứ cấp ứng dụng trong dược phẩm:
ankanoid,steroid,các chất riêng lẻ khác ( ubiquinon,saponin ),các protein tái tổ hợp
Một số ứng dụng trong thực tiễn
Làm sạch virut qua nuôi cấy mô phân sinh đỉnh
*Nguyên lý:
- Nồng độ virut giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trưởng do:
+ virut không vận chuyển được trong mô phân sinh đỉnh
+ Các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sự sao chép thông tin di truyền cua virut
+ Hệ thống vô hiệu hoá virut ở mô phân sinh đỉnh mạnh hơn các vùng khác
+ Nồng độ auxin cao ngăn cản quá trình sao chép của virut
*Các kĩ thuật làm sạch virut in vitro
+ Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh : Bao gồm các phương pháp:
- Nuôi cấy mô phân sỉnh đỉnh kết hợp với xử lí ở nhiệt độ cao
- Nuôi cấy mô phân sỉnh đỉnh kết hợp với xử lí hoá chất
- Kĩ thuật vi ghép
Chọn dòng biến dị soma
Cơ sở chọn dòng biến dị soma: là chỉ tất cả các biến dị thể hiện ở các tế bào,mô nuôi cấy,cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô tế bào
Gồm 2 nhóm chính: Biến dị kiểu gen và biến dị kiểu hình
Các nguyên nhân gây biến dị dòng soma
+ Sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế bào nuôi cấy
+ Phương thức nhân giống in vitro
+ Loại và nồng độ chất điều hoà sinh trưởng sử dụng
+ Thời gian nuôi cấy và số lần cấy chuyển
Phương pháp chọn dòng biến dị soma
+ Chọn trực tiếp
+ Chọn gián tiếp
+ Chọn tổng thể