Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG NÔNG NGHIỆP
Chuyên đề: Kỹ thuật nuôi cấy meristem và tạo cây sạch bệnh virus

Nhóm 2: 1.Phạm Thanh Hà
2.Nguyễn Thị Thu Hằng
Kỹ thuật nuôi cấy meristem (nuôi cấy đỉnh sinh trưởng)
1. Khái niệm
Đỉnh sinh trưởng là phần chóp của búp lá hoặc thân
cây nơi có thể sinh ra những phần mới từ đó, đỉnh
sinh trưởng thường mềm yếu rất mẫn cảm với ánh
sáng, nó chứa rất nhiều Auxin, nơi diễn ra trao đổi
chất rất mạnh
Kỹ thuật nuôi cấy meristem (hay còn gọi là nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng) là sử dụng mô phân sinh ngọn với
3-4 tiền phát khởi lá, tức là các đỉnh sinh trưởng có
kích thước từ 0,1– 0,15mm tính từ chóp sinh trưởng.
2. Nuôi cấy
2.1 Mục đích
Khử trùng mẫu đỉnh chồi
Khảo sát sự tái sinh cây trực tiếp từ nuôi cấy dỉnh chồi
Khảo sát sự thành lập protocorm từ nuôi cấy đỉnh chồi
2.2 Nuôi cấy phát triển thành cây trực tiếp

a, Nguyên vật liệu
Đoạn thân non của cây

b, Môi trường nuôi cấy
Môi trường MS bổ sung BA 2ppm và NAA
0,2ppm
c, Tiến hành
Các cành mẫu non lấy từ vườn ươm về được cắt bỏ
hết lá, cắt thành đoạn 2-3cm, cho vào bécher
Rửa sạch cành mẫu bằng nước xà phòng loãng,
sau đó rửa sạch xà phòng bằng nước máy
Đưa cành mẫu vào tủ cấy vô trùng, ngâm trong cồn
70% trong 2-3 phút
Rửa sạch cồn bằng nước cất vô trùng 1 lần
Xử lý mẫu bằng Ca(OCl)2 6% trong 10 phút sau đó
thay bằng dung dịch Ca(OCl)2 5% trong 5 phút
Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 6-7 lần cho
hết mùi javel
Cành mẫu được cắt bỏ cuống lá và 2 đầu của phần
thân đã bị chất khử trùng tẩy trắng. Chia cành mẫu
thành các đốt 1cm.
Cắm các đốt vào môi trường muôi cấy đã chuận bị,
cho phần cuống lá hướng lên trên, chồi ngủ phải nằm
trên mặt thoáng của môi trường
Nuôi mẫu trong điều kiện sáng 2000lux/16h/ngày ở
250C

Lá mầm
Chóp đỉnh sinh trưởng
Chồi lá nách
Vòm tăng trưởng
Mô phân sinh
Hình: Đỉnh sinh trưởng
3. Nuôi cấy sinh trưởng cây địa lan
Năm 1962 George Morel lần đầu tiên thành công
trong việc nuôi cấy mô địa lan.
Phương pháp nuôi cấy:
Chọn cây giống và mô phân sinh
Chuẩn bi mô để nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy
Chồi non tách từ cây mẹ ngoài vườn ươm
Chồi non tách sơ bộ các lớp lá bao ngoài trước khi khử trùng
Phương pháp lấy mẫu và nuôi cấy invitro cây địa lan
C. Tách đỉnh sinh trưởng dưới kính lúp trong điều kiện vô trùng
D. Protocorm và chồi non hình thành sau 6-8 tuàn nuôi cấy
E. Chồi non phát triển sau 6 tuần nuôi cấy có 2-3 lá, cao khoảng 4cm
F. Chồi non hình thành rễ sau 6 tuần nuôi cấy
4. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây khoai tây
Morel Martin (1955) là những người đầu tiên dùng
phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để thu được
cây khoai tây không chứa virus.
Phương pháp nuôi cấy:
Trồng khoai tây vào đất, khi mầm cao 15cm lấy phần ngọn 6-8cm cắm vào đất bùn đã vô trùng.
Sau 3-4 tuần cắt bỏ ngọn mầm để thúc các chồi nách phát triển.
Khi cây có nhiều lá,cắt đoạn và nhân lên nhiều cây, đồng thời đưa ra chuẩn đoán virus trên cây chỉ thị.
Sau khi đã chắc chắn không còn virus trên khoai tây, các ống nghiệm được đưa vào nhân giống
II. Tạo cây sạch bệnh virus
1. Cơ sở khoa học
Làm sạch virus là việc phải giải phóng các
thực vật bị nhiễm virus khỏi virus.
Các phương pháp làm sạch virus
- Xử lí nhiệt và hóa chất.
- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và chọn lọc bằng
phương pháp thử virus.
2. Nguyên lý
Nuôi cấy đỉnh phân sinh là nuôi cấy các mẫu nhỏ
của đỉnh chồi lên môi trường dinh dưỡng thích hợp để
chúng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh. Phần mô
thường được dùng là vòm phân sinh (meristem dome)
cộng thêm cặp lá đầu tiên.
Mức độ hữu hiêu của quá trình làm sạch virus đối
với thực tiễn phụ thuộc vào những yếu tố sau:
Khả năng xử lý nhiệt
Khả năng nuôi cấy đỉnh phân sinh
Phương pháp thử virus có độ chính xác cao
Hệ số nhân giống vô tính cây khá cao
Trồng các vật liệu sạch bệnh ban đầu dưới điều kiện cách ly tốt, tránh được tái nhiễm
Mức độ (diện tích) cho phép cung cấp đủ cây giống mới trong mỗi năm
3. Một số phương pháp làm sạch Virus
Có hai phương pháp là xử lý nhiệt và
nuôi cấy đỉnh phân sinh
3.1 Xử lý nhiệt
Quá trình xử lý nhiệt được coi như là biện pháp làm
sạch bệnh có cơ sở thực tiễn. Với giả thiết chung là
virus bị ức chế sinh sản ở nhiệt độ từ 34-400C. Quá
trình sinh trưởng của thực vật trong khi xử lý nhiệt
cũng bị ức chế nhưng ít hơn vì thế những bộ phận
Vừa được sinh trưởng thường sạch hoặc nghèo virus.
Tỷ lệ sạch bệnh của mẫu phụ thuộc vào thời gian xử
lý nhiệt độ tới hạn và phụ thuộc vào khả năng chịu
nhiệt của giống. Xử lý nhiệt có tác dụng tốt với đa số
trường hợp, song đôi khi mô tế bào của cây nhiễm
virus nhưng không bị loại trừ ở nhiệt độ cao do chủng
virus vẫn có khả năng sinh sản ở nhiệt độ này.
3.2 Nuôi cấy đỉnh phân sinh
Phối hợp xử lý nhiệt với nuôi cấy đỉnh phân sinh là
phương pháp rất thuận lợi bởi vì thông qua xử lý nhiệt
quá trình sinh sản của virus trong chồi ngọn bị ức chế
mạnh và thông qua quá trình phân hóa đỉnh phân sinh
tính sạch virus sẽ được đảm bảo với độ xác suất cao
và sử dụng môi trường Murashige-Skoog hoặc White.

3.3 Biện pháp bổ trợ
Xử lý hóa chất: Là sử dụng hoá chất mà đó là
những dẫn xuất halogen tiền thân của sự trao
đổi chất axit nucleic.


4. Quy trình làm sạch virus
Nuôi cấy mô phân sinh
Cấy trong môi trường thích hợp
Xác định virus
Xử lý nhiệt độ cao
Xử lý nhiệt độ tiếp
Xử lý hóa chất
Điều kiện nuôi cấy thích hợp
Tái sinh cây
Trồng trong vườn ươm
Cây sạch bệnh
Xét nghiệm virus bằng:
Cây chỉ thị
Kính hiển vi điện tử
Ghép
Huyết thanh, elisa
Người sử dụng
Duy trì sự sạch bệnh (thanh lọc, cách ly)
Nhân bằng nhiều phương
Cây bị nhiễm bệnh
5. Kết quả trong thực tiễn sản xuất
5.1 Tạo các giống cây sạch bệnh
a, Cây khoai tây
Khoai tây là cây trồng ở Châu Âu được nhân giống
vô tính và bị virus phá hoại nhiều nhất. Người ta tạo ra
các giống cây sạch bệnh bằng quy trình thử virus và
trồng ở các khu vực sạch bệnh để tránh tái nhiễm
thông qua các loài rệp lá. Quy trình sử dụng chủ yếu
là giết các cây thảo có thể truyền bệnh vào củ khoai
tây. Quy trình này có thể nâng cao hiệu suất thông
qua xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Giống khoai tây sạch bệnh, virus
b, Cây hoa
Ở đối tượng cây hoa chỉ gặp những cây nhân
giống vô tính thường bị bệnh virus trong khi bước
đầu người ta chỉ tập trung làm sạch bệnh ở những
cây hoa có ý nghĩa kinh tế quan trọng (ví dụ: hoa
cúc,  hoa anh túc, hoa thủy tiên...). Hiện nay,
người ta bắt đầu nuôi cấy các loài hoa khác. Xử lý
nhiệt kết hợp với nuôi cấy đỉnh phân sinh được sử
dụng để làm sạch virus ở hoa anh túc và hoa cúc.
Cây hoa lan và hoa đồng tiền sạch bệnh, virus
c, Cây ăn quả
Cây ăn quả thường bị  virus phá hoại một cách
mạnh nhất. Các thể virus gây bệnh không những lan
truyền khi nhân giống vô tính mà cả khi nhân giống
bằng hạt. Quá trình xử lý nhiệt đối với cây ăn quả đến
nay thường được tiến hành chủ yếu ở những đoạn
cành mà các mắt của chúng sẽ được xử dụng để
ghép sau này.
Cây dâu tây sạch bệnh virus
5.2 Kiểm định tính sạch bệnh virus
Có một số phương pháp xét nghiệm virus được áp
dụng cho một số loại cây ví dụ như:
Xét nghiệm bằng cây chỉ thị.
Phương pháp thử huyết thanh.
Xét nghiệm bằng lai phân tử.
Xét nghiệm bằng kính hiển vi.
Kiểm định tính sạch virus.
5.3 Duy trì tính sạch bệnh
Vấn đề quyết định cuối cùng đối với thực tiễn nông
nghiệp liên quan tới thời gian duy trì được cây trồng
sạch virus.
Để tạo điều kiện cho các xí nghiệp sản xuất công
nghiệp cây giống thu được những thành tích to lớn
hơn nữa thì việc đầu tư hàng năm cho công tác chống
bệnh virus trở nên cần thiết. Trong trường hợp nhân
giống vô tính in vitro thì việc làm sạch virus càng phải
được coi là điều kiện trước tiên.