Nucleic acids
Chia sẻ bởi Vũ Thị Thanh Tâm |
Ngày 24/10/2018 |
58
Chia sẻ tài liệu: Nucleic acids thuộc Bài giảng khác
Nội dung tài liệu:
Nucleic acids
và dòng thông tin sinh học
Nội dung:
Cấu tạo của các Nucleic acid
Sinh tổng hợp các nucleic acid
Phân giải nucleic acid
Một số kỹ thuật nghiên cứu
Kích thước genome của các loài khác nhau
I. Cấu tạo của các nucleic acid
Có 2 đường Pentose: ? ?-D Ribofuranose (?-D Ribose )
? 2- Deoxy ?-D Ribofuranose
(2-Deoxy ?-D Ribose )
DNA: 2-Deoxy ?-D Ribose ; RNA: ?-D Ribose
1.1. Thành phần hoá học
1.1.1. Đường Pentose
I. Thành phần hoá học
1.2. Base nitơ
1.2.1. Các base purin
Adenin, Guanin. DNA, RNA: A,G
1.2.2. Các base pirimidin
Cytosine, Thimin, Uraxil. DNA: C, T; RNA: C,U
* Base nitơ hiếm: Dẫn xuất Methyl của các base purin và pirimidin.
Hiện tượng hỗ biến của các base nitơ
1.1.3. Nucleoside
Nucleoside - N-Glycoside của các base nitơ
Liên kết N-Glycoside được hình thành giữa:
N9 của base purin với C1 của đường Pentose
N1 của base pirimidin với C1 của đường Pentose
1.1.4. Nucleotide
Nucleotide là
Este photphoric của các nucleoside
Figure 4.5: Ultraviolet spectra of ribonucleotides.
Data from A. L. Lehninger, D. L. Nelson, and M. M. Cox, Principles of Biochemistry, 2nd ed. (New York: Worth, 1993), p. 330, 12.10. © 1993, 1982 by Worth Publishers, Inc. Used with permission.
1.2. Cấu tạo của axit nucleic
1.2.1. Cấu tạo của DNA:
Phân tử DNA được tạo thành từ 2 mạch Polynucleotide. Mỗi mạch Polynucleotide được hình thành từ các mắt xích Deoxymononucleotide (dAMP, dGMP, dCMP, dTMP) liên kết với nhau băng liên kết Dieste photphoric
1.2.1.1. Cấu trúc bậc nhất
1.2.1.2. Cấu trúc bậc 2 (Mô hình J.Watson và F.Crick)
1.2.1.1. Cấu trúc bậc nhất
Là số lượng và trình tự sắp xếp các mắt xích Deoxyribonucleotide
Liên kết: Dieste photphoric được hình thành giữa axit photphoric với -OH ở C5` của một mononucleotide này với -OH ở C3` của mononucleotide bên cạnh.
Mạch Polinucleotide có cấu trúc mạch thẳng.
Cơ sở cho việc xây dựng Mô hình chuỗi xoắn kép:
Quy tắc Chargaff
Kết quả nghiên cứu về tinh thể DNA bằng phương pháp nhiễu xạ tia X của R. Franklin và M.Wilkins
a. Quy tắc E. Chargaff:
Trong DNA A = T, G = C (Hàm lượng Mol)
G + C khác với A + T: Nấm men nghèo G + C, vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis lại giàu G + C
=> Tỷ lệ các base purin so với các base pyrimidin là 1 : 1
1.2.1.2. Cấu trúc bậc hai (Mô hình Watson và Crick)
Tỷ lệ các base nitơ trong DNA
Liên kết hydro
Sự cặp đôi giữa các base nitơ ở hai mạch polynucletide
Comparison of the two major forms of DNA
So sánh 2 dạng A và B của DNA
Cấu trúc dạng B của DNA
Mô hình cấu tạo của DNA
Đường kính vòng xoắn: 2,37 nm
Một "bước" : 0,33 nm, 1 vòng xoắn hoàn hảo: 3,4 nm
10,4 bp tạo một vòng xoắn hoàn hảo, góc giữa 2 nucleotide kề nhau: 34,6o
Các lực:
Liên kết hidro
Hiệu ứng kỵ nước
Tương tác xếp chồng (Lực Van der Waals)
Tương tác giữa các nhóm tích điện
1.2. Cấu tạo của Nucleic acid
2.2. Cấu tạo của RNA
2.2.1. Cấu trúc bậc nhất: Số lượng và trình tự sắp xếp các mononucleotide trong mạch polynucleotide
Viết tắt: AGCUUGACC.
Liên kết: Dieste photphoric
2.2.2. Cấu trúc bậc 2, 3:
RNAt có cấu trình lá chẽ ba (Cloverleaf)
Cấu tạo của RNAt
Những cặp đôi không bình thường
Các dạng cấu hình của axit nucleic một mạch
Cấu trúc bậc 3 của RNAt
Structure of a small nuclear RNA (snRNA).
Câú tạo RNAs trong nhân (snRNA)
Host-induced restriction and modification.
2.3. Enzym cắt hạn chế (Restriction endonuclease)
1.4.1. Phân loại: 3 nhóm
Phản ứng Methyl - hoá
Phản ứng thuỷ phân
Cơ chế tác động của RNase A
RE nhóm I: Xúc tác cả p.ư. Methyl hoá và thuỷ phân trên 2 mạch
RE nhóm II: Xúc tác chỉ p.ư. Thuỷ phân
RE nhóm III: Xúc tác cả p.ư. Methyl hoá và thuỷ phân trên 1 mạch
Tính chất của RE của các nhóm I, II và III
1.4.2. Tính đặc hiệu của một số RE
1.4.3. ứng dụng RE:
Xây dựng bản đồ cắt hạn chế DNA (restriction map of DNA)
Là công cụ để phân lập và gắn gen
Cơ sở để so sánh các loài theo phương pháp RFLP (Random Fragment lengh Polymorphism)
Sự thuỷ phân DNA của Bacteriophage Lamda bởi 4 RE
II. Sinh tổng hợp các nucleic acid
2.1. Sinh tổng hợp DNA
2.2. Sinh tổng hợp RNA
Dòng thông tin di truyền
The flow of genetic information in a typical cell.
Tái bản
Phiên mã
Dịch mã
2.1. Sinh tổng hợp DNA (Tái bản - Replication)
Phương trình tổng quát
n dATP DNA làm khuôn dAMP
dGTP DNA Polymerase dGMP
dCTP dCMP + nPP
dTTP dTMP n
2.1.1. Cơ chế tái bản DNA
Ba kiểu tái bản DNA
Kiểu tái bản
Bảo thủ
Bán bảo thủ
Phân tán
Cơ chế tái bản bán bảo tồn
Thí nghiệm của Meselson & Stahl
2.1.2. Enzym tái bản
DNA Polymerase I: Sửa chữa DNA và tổng hợp 1 mạch DNA, cắt bỏ RNA mồi
DNA Polymerase II: Sửa chữa DNA SOS
DNA Polymerase III: Tổng hợp DNA
E.Coli chứa:
Các tế bào có nhân có 5 DNA Polymerase: 4 trong nhân, 1 trong ti thể
Cấu tạo dna polymerase III của E.coli
Cơ chế chuyển nhóm nucleotidyl (Nucleotidyl group- transfer reaction)
Sơ đồ chẽ ba tái bản (Replication fork) và hướng tổng hợp 2 mạch
2.1.3. Cơ chế tái bản
A model for initiation of E. coli DNA replication at oric.
a. Mở đầu quá trình tái bản
The Okazaki model.
b. Giai đoạn tổng hợp
Simplified view of a replication fork.
Chẽ ba tái bản
Schematic view of a replication fork.
c. Sinh tổng hợp mạch kế tiếp (Lagging - strand Synthesis)
Details of lagging strand synthesis
Chi tiết về tổng hợp mạch kế tiếp (Lagging Strand)
Sự tái bản ở tế bào có nhân thật:
E. coli:
Më ®Çu: Topoisomerase, Helicase cíi xo¾n, SSB protein chèng t¸i xo¾n, Primase – RNA polymerase tæng hîp RNA måi
DNA Polymerase: 3
Mét ®iÓm b¾t ®Çu t¸i b¶n
§o¹n Okazaki: 1000 – 2000 bp
Tế bào có nhân thật:
Nhiều enzym tham gia: Topoisomerase, Helicase, SSB protein, primase
DNA Polymerase: 4
Có nhiều điểm tái bản (TB nấm men - Hàng trăm, TB ruồi dấm - 6000, TB người - 20.000 - 30.000 điểm)
Đoạn Okazaki: 100 -
200 bp
Tốc độ tái bản: 1.000 - 1.500 nucleotide/ phút
2.1.4. Sửa chữa sai sót trong quá trình tái bản
Các hệ thống giảm sai sót gồm:
Cơ chế đọc sửa (Proofreading)
Hệ thống uracil-DNA N-glycosylase chống lại đột biến do sự khử amin hoá cytosine
Sự ổn định hoá học của DNA được đảm bảo:
Quá trình tái bản có độ chính xác cao phòng các sai sót xảy ra
Bằng các cơ chế sửa chữa sai sót trong quá trình tái bản
2.1.4.1. Đọc sửa
Quá trình tái bản xảy ra với tỷ lệ sai là 10-9 - 10-10
Chức năng đọc sửa do DNA Polymerase có hoạt tính 3`- exonuclease
Quá trình đọc sửa làm giảm sai sót xuống 100 lần
2.1.4.2.Hệ thống uracil-DNA N-glycosylase
Hệ thống gồm:
Uracil-DNA N-Glycosylase
Endonuclease
DNA Polymerase I
DNA Ligase
Các cơ chế sửa chữa khác:
1. Sửa chữa trực tiếp (Direct repair): Base bị lỗi của DNA được phục hồi cấu tạo bằng phương pháp hoá học
2. Cắt bỏ - Sửa Nucleotide (Nucleotide excision repair): Phần DNA chứa sai sót được cắt bỏ và thay thế bằng DNA bình thường,
3. Cắt bỏ - Sửa chữa base (Base excision repair): Bắt đầu bằng sự thuỷ phân liên kết glycosidic bond nối base bị lỗi với khung đường -phosphate của DNA
4.Sửa chữa tái tổ hợp (Recombinational repair): Xoắn kép DNA mới tái bản bị tái tổ hợp loại đi đoạn DNA bị lỗi.
5. Sửa lỗi sai bỏ qua (Mismatch repair (prokaryotic or eukaryotic)): Quá trình nhận biết các lỗi bỏ qua của DNA do các lỗi sai tái bản, tái tổ hợp không tương đồng hay sai sót gây cho 1 base của DNA và sửa chữa ngay lỗi sai.
Excision repair of thymine dimers by the UvrABC excinuclease of E. coli.
Base excision repair of thymine dimers.
Recombinational repair
PCR - Polymerase Chain Reaction
2.1.5. Ph?n ?ng nhân gen PCR
2.2. Quá trình phiên mã -
(RNA Transcription)
Phương trình tổng quát (Konberg):
n ATP DNA làm khuôn AMP
GTP RNA Polymerase GMP
CTP CMP + nPP
UTP UMP n
RNA mới
RNA Polymerase ở Eukaryote:
3 loại
RNA Polymerase I: Xúc tác phiên mã khoảng 60% RNA tổng số, chủ yếu là các RNAr (28S, 18S và 5,8S)
RNA Polymerase II: Xúc tác phiên mã khoảng 30% RNA tổng số, chủ yếu là các RNAm, một số RNAs
RNA Polymerase III: Xúc tác phiên mã khoảng 10% RNA tổng số, chủ yếu là các RNAt, RNAr 5S và một số RNAs khác (U1, U2, U3)
2.2.1. Enzyme phiên mã
RNA - Polymerase
Phản ứng do RNA Polymerase xúc tác
Giai đoạn mở đầu:
RNA - Polymerase
Trình tự mở đầu
Giai đoạn tổng hợp:
Yếu tố ? tách khỏi RNA - Polymerase
Tổng hợp: Gắn dần các gốc ribonucleotide vào 3`C-OH
Giai đoạn kết thúc:
Hai cơ chế: - Yếu tố Rho
- Tạo cấu trúc kẹp tóc
2.2.2. Các giai đoạn của phiên mã
Giai đoạn mở đầu gồm các bước 1 - 4
2.2.2.1. Mở đầu
Phức hợp Promoter đóng (-55 đến -5), DNA chưa mở xoắn
Phức hợp Promoter mở, DNA mở xoắn vài base (-10 đến -1)
Gắn pppPu vào
RNA Polymerase gắn vào DNA, trượt tự do
Conserved sequences in promoters recognized by E. coli RNA polymerase.
Trình tự mở đầu
Vùng -35
Vùng -10
Initiation and elongation steps of transcription by bacterial RNA polymerase.
2.2.2.2. Tổng hợp (Kéo dài)
Phức hợp Promoter mở
Quá trình kéo dài bắt đầu
The transcription bubble.
"Phồng" phiên mã
Rho factor (p)-dependent termination.
2.2.2.3. Kết thúc
Qúa trình phiên mã kết thúc bằng 2 cơ chế:
a. Yếu tố Rho
A model for factor-independent termination of transcription.
b. Kết thúc không phụ thuộc yếu tố Rho
2.2.3. Hoàn thiện sau phiên mã
2.2.3.1. Hoàn thiện RNAm
Gắn "mũ" đầu 5` - OH
Gắn đuôi PolyA
Cắt bỏ vùng không mã hoá (exon)
Figure 28.30: Overall structure of a fully processed eukaryotic message, including the cap site
Gắn "mũ" đầu 5`
A schematic view of the proposed mechanism for mRNA splicing
Cắt bỏ vùng không mã hoá của RNAm ở tế bào Eukaryote
A proposed model for the mechanism of splicing
Coding and noncoding regions of the hemoglobin gene.
Cắt bỏ vùng (Splicing) không mã hoá
Hemoglobin gene
α-Tropomyosin gene organization (rat) and seven alternative splicing pathways.
Cắt bỏ tương đối (alternative splicing )
a. Hoàn thiện sau RNAr ở E.coli (30S E.coli RNAr)
2.2.3.2. Hoàn thiện sau phiên mã RNAr và RNAt
Hoàn thiện của E. coli RNAt
A map of the lactose operon.
2.2.5. Điều hoà quá trình phiên mã
Configurations of the lactose operon.
Kiểu "đóng - mở"
Activation of the lac operon.
cAMP receptor protein
(Negative and positive control)
Điều hoà bằng cAMP
Điều hoà quá trình phiên mã của quá trình STH tryptophan
cAMP Receptor Protein (CRP)
Negative and positive control - The lac repressor--operator system keeps the operon turned off in the absence of utilizable -galactosides. An overlapping regulatory system (Figure 26.21) turns the operon on only when alternative energy sources are unavailable. E. coli uses glucose in preference to most other energy substrates. When grown in a medium containing both glucose and lactose, the cells metabolize glucose exclusively until the supply is exhausted. Then the lactose operon becomes activated in preparation for continued growth using lactose. This phenomenon involves a transcriptional activation mechanism, which occurs when glucose levels are low. Control is exerted through intracellular levels of cyclic AMP.
cAMP controls in E. coli - In E. coli, cAMP levels are low when intracellular glucose levels are high. Adenylate cyclase (the enzyme that catalyzes formation of cAMP) apparently senses the intracellular level of an unidentified intermediate in glucose catabolism. Hence, the current name for the regulatory process is catabolite activation. When glucose levels drop, as shown in Figure 26.21, cAMP levels rise and cAMP interacts with a protein called cAMP receptor protein (CRP). When it binds cAMP, CRP undergoes a conformational change. The change greatly increases its affinity for certain DNA sites, including a site in the lac operon adjacent to the RNA polymerase binding site. Binding of cAMP--CRP at this site protects a DNA sequence from -68 to -55, as shown in Figure 26.19. This binding facilitates transcription of the lac operon by stimulating the binding of RNA polymerase to form a closed-promoter complex.
The cAMP--CRP complex activates several different gene systems in E. coli, all of them involved with energy generation. They include operons for utilization of other sugars, including galactose, maltose, arabinose, and sorbitol, and several amino acids. Among the operons that have been analyzed, the DNA binding site of the cAMP-activated dimer varies considerably with respect to the transcriptional start point, suggesting that regulatory mechanisms involving this protein are complex.
The CRP - DNA Complex - The structure of the CRP-cAMP-DNA complex, as revealed by x-ray crystallography, shows how the protein binds to DNA. Each CRP subunit contains a characteristic pair of helices, called a helix-turn-helix structural motif (see Figure 28.23). It is found in several DNA-binding regulatory proteins, suggesting common evolutionary origins for this family of proteins. Analysis of the DNA - protein complex shows that CRP induces DNA to bend quite sharply when it binds. This bending may facilitate the initiation of transcription by bringing DNA sequences farther upstream into direct contact with the promoter or transcriptional start site.
The E. coli ara operon.
Ara Operon
Arabinose Operon
The arabinose operon features a
Arabinose Operon
The arabinose operon features a single protein which acts as both a positive and a negative transcriptional regulator, depending upon the binding of particular ligands (Figure 26.39).
Three structural genes are located in the arabinose operon--araB, araA, and araD. They encode enzymes that convert arabinose to xylulose-5-phosphate.
Regulation - The araC gene encodes a regulatory protein that binds to arabinose, the inducer of the operon. Binding of the AraC - arabinose complex at a site called araI activates transcription of the arabinose operon, but only when the cAMP - CRP complex (see here) is bound at an adjacent site. Thus, whereas the lac operon requires one protein to be bound and one to be dissociated for maximal transcription, the arabinose operon requires two proteins to be bound at adjacent sites.
When arabinose levels are low, the AraC protein acts as a repressor and binds to two operator sites, araO1 and araO2, as well as to araI. Binding to araO1 inhibits transcription of the araC gene itself. Thus, araC is autoregulated at the level of its own transcription. AraC molecules bound to araO2 and araI interact with each other to form a DNA loop. This structure causes repression of transcription of the araBAD genes.
Galactose Operon
The galactose operon (Figure 26.38) controls the utilization of galactose, one of the products of lactose cleavage by lac operon enzymes. The gal operon is regulated negatively by a repressor in a manner comparable to lac regulation, except that the repressor gene (galR) is unlinked to the structural genes.
Overlapping promoters - The gal operon contains two overlapping promoters (S1 and S2, Figure 26.38), leading to transcripts that are initiated just five nucleotides apart.
1. Transcription from the S1 promoter depends on the presence of the cAMP - CRP complex (see here).
2. The S2 promoter, is used when glucose is present.
The details of this dual regulation are not clear, but it is significant that galactose has a biosynthetic fate in addition to its role as an energy substrate. UDP-galactose is used in synthesis of cell wall lipopolysaccharide, so the second promoter may exist to ensure that UDP-galactose is available even when the cell is using glucose as its prime energy source.
III.Phân giải Nucleic acid
Sơ đồ phân giải Nucleic acid
3.1. Phân gi?i các base purine
a. Phân gi?i các base purine và sự hình thành uric acid
b. Sự phân giải uric acid thành NH3 và CO2
Sự tích luỹ dư thừa uric acid và bệnh gout
3.2. Sự phân giải các base pyrimidine
Sản phẩm:
Alanine
NH3
CO2
IV. Một số kỹ thuật nghiên cứu nucleic acid
6.1. Thu nhận DNA genome
6.2. Xác định trình tự nucleotide
6.3. Kỹ thuật nhân gen (PCR - Polymerase Chain Reaction)
6.4. Điện di trên gel agarose và xử lý hình ảnh sau điện di
và dòng thông tin sinh học
Nội dung:
Cấu tạo của các Nucleic acid
Sinh tổng hợp các nucleic acid
Phân giải nucleic acid
Một số kỹ thuật nghiên cứu
Kích thước genome của các loài khác nhau
I. Cấu tạo của các nucleic acid
Có 2 đường Pentose: ? ?-D Ribofuranose (?-D Ribose )
? 2- Deoxy ?-D Ribofuranose
(2-Deoxy ?-D Ribose )
DNA: 2-Deoxy ?-D Ribose ; RNA: ?-D Ribose
1.1. Thành phần hoá học
1.1.1. Đường Pentose
I. Thành phần hoá học
1.2. Base nitơ
1.2.1. Các base purin
Adenin, Guanin. DNA, RNA: A,G
1.2.2. Các base pirimidin
Cytosine, Thimin, Uraxil. DNA: C, T; RNA: C,U
* Base nitơ hiếm: Dẫn xuất Methyl của các base purin và pirimidin.
Hiện tượng hỗ biến của các base nitơ
1.1.3. Nucleoside
Nucleoside - N-Glycoside của các base nitơ
Liên kết N-Glycoside được hình thành giữa:
N9 của base purin với C1 của đường Pentose
N1 của base pirimidin với C1 của đường Pentose
1.1.4. Nucleotide
Nucleotide là
Este photphoric của các nucleoside
Figure 4.5: Ultraviolet spectra of ribonucleotides.
Data from A. L. Lehninger, D. L. Nelson, and M. M. Cox, Principles of Biochemistry, 2nd ed. (New York: Worth, 1993), p. 330, 12.10. © 1993, 1982 by Worth Publishers, Inc. Used with permission.
1.2. Cấu tạo của axit nucleic
1.2.1. Cấu tạo của DNA:
Phân tử DNA được tạo thành từ 2 mạch Polynucleotide. Mỗi mạch Polynucleotide được hình thành từ các mắt xích Deoxymononucleotide (dAMP, dGMP, dCMP, dTMP) liên kết với nhau băng liên kết Dieste photphoric
1.2.1.1. Cấu trúc bậc nhất
1.2.1.2. Cấu trúc bậc 2 (Mô hình J.Watson và F.Crick)
1.2.1.1. Cấu trúc bậc nhất
Là số lượng và trình tự sắp xếp các mắt xích Deoxyribonucleotide
Liên kết: Dieste photphoric được hình thành giữa axit photphoric với -OH ở C5` của một mononucleotide này với -OH ở C3` của mononucleotide bên cạnh.
Mạch Polinucleotide có cấu trúc mạch thẳng.
Cơ sở cho việc xây dựng Mô hình chuỗi xoắn kép:
Quy tắc Chargaff
Kết quả nghiên cứu về tinh thể DNA bằng phương pháp nhiễu xạ tia X của R. Franklin và M.Wilkins
a. Quy tắc E. Chargaff:
Trong DNA A = T, G = C (Hàm lượng Mol)
G + C khác với A + T: Nấm men nghèo G + C, vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis lại giàu G + C
=> Tỷ lệ các base purin so với các base pyrimidin là 1 : 1
1.2.1.2. Cấu trúc bậc hai (Mô hình Watson và Crick)
Tỷ lệ các base nitơ trong DNA
Liên kết hydro
Sự cặp đôi giữa các base nitơ ở hai mạch polynucletide
Comparison of the two major forms of DNA
So sánh 2 dạng A và B của DNA
Cấu trúc dạng B của DNA
Mô hình cấu tạo của DNA
Đường kính vòng xoắn: 2,37 nm
Một "bước" : 0,33 nm, 1 vòng xoắn hoàn hảo: 3,4 nm
10,4 bp tạo một vòng xoắn hoàn hảo, góc giữa 2 nucleotide kề nhau: 34,6o
Các lực:
Liên kết hidro
Hiệu ứng kỵ nước
Tương tác xếp chồng (Lực Van der Waals)
Tương tác giữa các nhóm tích điện
1.2. Cấu tạo của Nucleic acid
2.2. Cấu tạo của RNA
2.2.1. Cấu trúc bậc nhất: Số lượng và trình tự sắp xếp các mononucleotide trong mạch polynucleotide
Viết tắt: AGCUUGACC.
Liên kết: Dieste photphoric
2.2.2. Cấu trúc bậc 2, 3:
RNAt có cấu trình lá chẽ ba (Cloverleaf)
Cấu tạo của RNAt
Những cặp đôi không bình thường
Các dạng cấu hình của axit nucleic một mạch
Cấu trúc bậc 3 của RNAt
Structure of a small nuclear RNA (snRNA).
Câú tạo RNAs trong nhân (snRNA)
Host-induced restriction and modification.
2.3. Enzym cắt hạn chế (Restriction endonuclease)
1.4.1. Phân loại: 3 nhóm
Phản ứng Methyl - hoá
Phản ứng thuỷ phân
Cơ chế tác động của RNase A
RE nhóm I: Xúc tác cả p.ư. Methyl hoá và thuỷ phân trên 2 mạch
RE nhóm II: Xúc tác chỉ p.ư. Thuỷ phân
RE nhóm III: Xúc tác cả p.ư. Methyl hoá và thuỷ phân trên 1 mạch
Tính chất của RE của các nhóm I, II và III
1.4.2. Tính đặc hiệu của một số RE
1.4.3. ứng dụng RE:
Xây dựng bản đồ cắt hạn chế DNA (restriction map of DNA)
Là công cụ để phân lập và gắn gen
Cơ sở để so sánh các loài theo phương pháp RFLP (Random Fragment lengh Polymorphism)
Sự thuỷ phân DNA của Bacteriophage Lamda bởi 4 RE
II. Sinh tổng hợp các nucleic acid
2.1. Sinh tổng hợp DNA
2.2. Sinh tổng hợp RNA
Dòng thông tin di truyền
The flow of genetic information in a typical cell.
Tái bản
Phiên mã
Dịch mã
2.1. Sinh tổng hợp DNA (Tái bản - Replication)
Phương trình tổng quát
n dATP DNA làm khuôn dAMP
dGTP DNA Polymerase dGMP
dCTP dCMP + nPP
dTTP dTMP n
2.1.1. Cơ chế tái bản DNA
Ba kiểu tái bản DNA
Kiểu tái bản
Bảo thủ
Bán bảo thủ
Phân tán
Cơ chế tái bản bán bảo tồn
Thí nghiệm của Meselson & Stahl
2.1.2. Enzym tái bản
DNA Polymerase I: Sửa chữa DNA và tổng hợp 1 mạch DNA, cắt bỏ RNA mồi
DNA Polymerase II: Sửa chữa DNA SOS
DNA Polymerase III: Tổng hợp DNA
E.Coli chứa:
Các tế bào có nhân có 5 DNA Polymerase: 4 trong nhân, 1 trong ti thể
Cấu tạo dna polymerase III của E.coli
Cơ chế chuyển nhóm nucleotidyl (Nucleotidyl group- transfer reaction)
Sơ đồ chẽ ba tái bản (Replication fork) và hướng tổng hợp 2 mạch
2.1.3. Cơ chế tái bản
A model for initiation of E. coli DNA replication at oric.
a. Mở đầu quá trình tái bản
The Okazaki model.
b. Giai đoạn tổng hợp
Simplified view of a replication fork.
Chẽ ba tái bản
Schematic view of a replication fork.
c. Sinh tổng hợp mạch kế tiếp (Lagging - strand Synthesis)
Details of lagging strand synthesis
Chi tiết về tổng hợp mạch kế tiếp (Lagging Strand)
Sự tái bản ở tế bào có nhân thật:
E. coli:
Më ®Çu: Topoisomerase, Helicase cíi xo¾n, SSB protein chèng t¸i xo¾n, Primase – RNA polymerase tæng hîp RNA måi
DNA Polymerase: 3
Mét ®iÓm b¾t ®Çu t¸i b¶n
§o¹n Okazaki: 1000 – 2000 bp
Tế bào có nhân thật:
Nhiều enzym tham gia: Topoisomerase, Helicase, SSB protein, primase
DNA Polymerase: 4
Có nhiều điểm tái bản (TB nấm men - Hàng trăm, TB ruồi dấm - 6000, TB người - 20.000 - 30.000 điểm)
Đoạn Okazaki: 100 -
200 bp
Tốc độ tái bản: 1.000 - 1.500 nucleotide/ phút
2.1.4. Sửa chữa sai sót trong quá trình tái bản
Các hệ thống giảm sai sót gồm:
Cơ chế đọc sửa (Proofreading)
Hệ thống uracil-DNA N-glycosylase chống lại đột biến do sự khử amin hoá cytosine
Sự ổn định hoá học của DNA được đảm bảo:
Quá trình tái bản có độ chính xác cao phòng các sai sót xảy ra
Bằng các cơ chế sửa chữa sai sót trong quá trình tái bản
2.1.4.1. Đọc sửa
Quá trình tái bản xảy ra với tỷ lệ sai là 10-9 - 10-10
Chức năng đọc sửa do DNA Polymerase có hoạt tính 3`- exonuclease
Quá trình đọc sửa làm giảm sai sót xuống 100 lần
2.1.4.2.Hệ thống uracil-DNA N-glycosylase
Hệ thống gồm:
Uracil-DNA N-Glycosylase
Endonuclease
DNA Polymerase I
DNA Ligase
Các cơ chế sửa chữa khác:
1. Sửa chữa trực tiếp (Direct repair): Base bị lỗi của DNA được phục hồi cấu tạo bằng phương pháp hoá học
2. Cắt bỏ - Sửa Nucleotide (Nucleotide excision repair): Phần DNA chứa sai sót được cắt bỏ và thay thế bằng DNA bình thường,
3. Cắt bỏ - Sửa chữa base (Base excision repair): Bắt đầu bằng sự thuỷ phân liên kết glycosidic bond nối base bị lỗi với khung đường -phosphate của DNA
4.Sửa chữa tái tổ hợp (Recombinational repair): Xoắn kép DNA mới tái bản bị tái tổ hợp loại đi đoạn DNA bị lỗi.
5. Sửa lỗi sai bỏ qua (Mismatch repair (prokaryotic or eukaryotic)): Quá trình nhận biết các lỗi bỏ qua của DNA do các lỗi sai tái bản, tái tổ hợp không tương đồng hay sai sót gây cho 1 base của DNA và sửa chữa ngay lỗi sai.
Excision repair of thymine dimers by the UvrABC excinuclease of E. coli.
Base excision repair of thymine dimers.
Recombinational repair
PCR - Polymerase Chain Reaction
2.1.5. Ph?n ?ng nhân gen PCR
2.2. Quá trình phiên mã -
(RNA Transcription)
Phương trình tổng quát (Konberg):
n ATP DNA làm khuôn AMP
GTP RNA Polymerase GMP
CTP CMP + nPP
UTP UMP n
RNA mới
RNA Polymerase ở Eukaryote:
3 loại
RNA Polymerase I: Xúc tác phiên mã khoảng 60% RNA tổng số, chủ yếu là các RNAr (28S, 18S và 5,8S)
RNA Polymerase II: Xúc tác phiên mã khoảng 30% RNA tổng số, chủ yếu là các RNAm, một số RNAs
RNA Polymerase III: Xúc tác phiên mã khoảng 10% RNA tổng số, chủ yếu là các RNAt, RNAr 5S và một số RNAs khác (U1, U2, U3)
2.2.1. Enzyme phiên mã
RNA - Polymerase
Phản ứng do RNA Polymerase xúc tác
Giai đoạn mở đầu:
RNA - Polymerase
Trình tự mở đầu
Giai đoạn tổng hợp:
Yếu tố ? tách khỏi RNA - Polymerase
Tổng hợp: Gắn dần các gốc ribonucleotide vào 3`C-OH
Giai đoạn kết thúc:
Hai cơ chế: - Yếu tố Rho
- Tạo cấu trúc kẹp tóc
2.2.2. Các giai đoạn của phiên mã
Giai đoạn mở đầu gồm các bước 1 - 4
2.2.2.1. Mở đầu
Phức hợp Promoter đóng (-55 đến -5), DNA chưa mở xoắn
Phức hợp Promoter mở, DNA mở xoắn vài base (-10 đến -1)
Gắn pppPu vào
RNA Polymerase gắn vào DNA, trượt tự do
Conserved sequences in promoters recognized by E. coli RNA polymerase.
Trình tự mở đầu
Vùng -35
Vùng -10
Initiation and elongation steps of transcription by bacterial RNA polymerase.
2.2.2.2. Tổng hợp (Kéo dài)
Phức hợp Promoter mở
Quá trình kéo dài bắt đầu
The transcription bubble.
"Phồng" phiên mã
Rho factor (p)-dependent termination.
2.2.2.3. Kết thúc
Qúa trình phiên mã kết thúc bằng 2 cơ chế:
a. Yếu tố Rho
A model for factor-independent termination of transcription.
b. Kết thúc không phụ thuộc yếu tố Rho
2.2.3. Hoàn thiện sau phiên mã
2.2.3.1. Hoàn thiện RNAm
Gắn "mũ" đầu 5` - OH
Gắn đuôi PolyA
Cắt bỏ vùng không mã hoá (exon)
Figure 28.30: Overall structure of a fully processed eukaryotic message, including the cap site
Gắn "mũ" đầu 5`
A schematic view of the proposed mechanism for mRNA splicing
Cắt bỏ vùng không mã hoá của RNAm ở tế bào Eukaryote
A proposed model for the mechanism of splicing
Coding and noncoding regions of the hemoglobin gene.
Cắt bỏ vùng (Splicing) không mã hoá
Hemoglobin gene
α-Tropomyosin gene organization (rat) and seven alternative splicing pathways.
Cắt bỏ tương đối (alternative splicing )
a. Hoàn thiện sau RNAr ở E.coli (30S E.coli RNAr)
2.2.3.2. Hoàn thiện sau phiên mã RNAr và RNAt
Hoàn thiện của E. coli RNAt
A map of the lactose operon.
2.2.5. Điều hoà quá trình phiên mã
Configurations of the lactose operon.
Kiểu "đóng - mở"
Activation of the lac operon.
cAMP receptor protein
(Negative and positive control)
Điều hoà bằng cAMP
Điều hoà quá trình phiên mã của quá trình STH tryptophan
cAMP Receptor Protein (CRP)
Negative and positive control - The lac repressor--operator system keeps the operon turned off in the absence of utilizable -galactosides. An overlapping regulatory system (Figure 26.21) turns the operon on only when alternative energy sources are unavailable. E. coli uses glucose in preference to most other energy substrates. When grown in a medium containing both glucose and lactose, the cells metabolize glucose exclusively until the supply is exhausted. Then the lactose operon becomes activated in preparation for continued growth using lactose. This phenomenon involves a transcriptional activation mechanism, which occurs when glucose levels are low. Control is exerted through intracellular levels of cyclic AMP.
cAMP controls in E. coli - In E. coli, cAMP levels are low when intracellular glucose levels are high. Adenylate cyclase (the enzyme that catalyzes formation of cAMP) apparently senses the intracellular level of an unidentified intermediate in glucose catabolism. Hence, the current name for the regulatory process is catabolite activation. When glucose levels drop, as shown in Figure 26.21, cAMP levels rise and cAMP interacts with a protein called cAMP receptor protein (CRP). When it binds cAMP, CRP undergoes a conformational change. The change greatly increases its affinity for certain DNA sites, including a site in the lac operon adjacent to the RNA polymerase binding site. Binding of cAMP--CRP at this site protects a DNA sequence from -68 to -55, as shown in Figure 26.19. This binding facilitates transcription of the lac operon by stimulating the binding of RNA polymerase to form a closed-promoter complex.
The cAMP--CRP complex activates several different gene systems in E. coli, all of them involved with energy generation. They include operons for utilization of other sugars, including galactose, maltose, arabinose, and sorbitol, and several amino acids. Among the operons that have been analyzed, the DNA binding site of the cAMP-activated dimer varies considerably with respect to the transcriptional start point, suggesting that regulatory mechanisms involving this protein are complex.
The CRP - DNA Complex - The structure of the CRP-cAMP-DNA complex, as revealed by x-ray crystallography, shows how the protein binds to DNA. Each CRP subunit contains a characteristic pair of helices, called a helix-turn-helix structural motif (see Figure 28.23). It is found in several DNA-binding regulatory proteins, suggesting common evolutionary origins for this family of proteins. Analysis of the DNA - protein complex shows that CRP induces DNA to bend quite sharply when it binds. This bending may facilitate the initiation of transcription by bringing DNA sequences farther upstream into direct contact with the promoter or transcriptional start site.
The E. coli ara operon.
Ara Operon
Arabinose Operon
The arabinose operon features a
Arabinose Operon
The arabinose operon features a single protein which acts as both a positive and a negative transcriptional regulator, depending upon the binding of particular ligands (Figure 26.39).
Three structural genes are located in the arabinose operon--araB, araA, and araD. They encode enzymes that convert arabinose to xylulose-5-phosphate.
Regulation - The araC gene encodes a regulatory protein that binds to arabinose, the inducer of the operon. Binding of the AraC - arabinose complex at a site called araI activates transcription of the arabinose operon, but only when the cAMP - CRP complex (see here) is bound at an adjacent site. Thus, whereas the lac operon requires one protein to be bound and one to be dissociated for maximal transcription, the arabinose operon requires two proteins to be bound at adjacent sites.
When arabinose levels are low, the AraC protein acts as a repressor and binds to two operator sites, araO1 and araO2, as well as to araI. Binding to araO1 inhibits transcription of the araC gene itself. Thus, araC is autoregulated at the level of its own transcription. AraC molecules bound to araO2 and araI interact with each other to form a DNA loop. This structure causes repression of transcription of the araBAD genes.
Galactose Operon
The galactose operon (Figure 26.38) controls the utilization of galactose, one of the products of lactose cleavage by lac operon enzymes. The gal operon is regulated negatively by a repressor in a manner comparable to lac regulation, except that the repressor gene (galR) is unlinked to the structural genes.
Overlapping promoters - The gal operon contains two overlapping promoters (S1 and S2, Figure 26.38), leading to transcripts that are initiated just five nucleotides apart.
1. Transcription from the S1 promoter depends on the presence of the cAMP - CRP complex (see here).
2. The S2 promoter, is used when glucose is present.
The details of this dual regulation are not clear, but it is significant that galactose has a biosynthetic fate in addition to its role as an energy substrate. UDP-galactose is used in synthesis of cell wall lipopolysaccharide, so the second promoter may exist to ensure that UDP-galactose is available even when the cell is using glucose as its prime energy source.
III.Phân giải Nucleic acid
Sơ đồ phân giải Nucleic acid
3.1. Phân gi?i các base purine
a. Phân gi?i các base purine và sự hình thành uric acid
b. Sự phân giải uric acid thành NH3 và CO2
Sự tích luỹ dư thừa uric acid và bệnh gout
3.2. Sự phân giải các base pyrimidine
Sản phẩm:
Alanine
NH3
CO2
IV. Một số kỹ thuật nghiên cứu nucleic acid
6.1. Thu nhận DNA genome
6.2. Xác định trình tự nucleotide
6.3. Kỹ thuật nhân gen (PCR - Polymerase Chain Reaction)
6.4. Điện di trên gel agarose và xử lý hình ảnh sau điện di
* Một số tài liệu cũ có thể bị lỗi font khi hiển thị do dùng bộ mã không phải Unikey ...
Người chia sẻ: Vũ Thị Thanh Tâm
Dung lượng: |
Lượt tài: 2
Loại file:
Nguồn : Chưa rõ
(Tài liệu chưa được thẩm định)