Nhap mon cong nghe sinh hoc

Giới thiệu về nuôi cấy tế bào động vật
Experimental Methods 2006
2
Mục tiêu
Sau khi học bài này, sinh viên có thể:
Thế nào là nuôi cấy mô và các kiểu nuôi cấy mô
Ứng dụng của nuôi cấy mô
Thuận lợi và bất lợi của mỗi kiểu nuôi cấy mô
Một số khái niệm cơ bản
Experimental Methods 2006
3
Experimental Methods 2006
4
Nuôi cấy mô là gì?
Nuôi cấy In vitro (duy trì và/hay tăng sinh) các tế bào, mô và các cơ quan
Các kiểu nuôi cấy mô
Nuôi cấy cơ quan
Nuôi cấy mô
Nuôi cấy tế bào
Experimental Methods 2006
5
Nuôi cấy cơ quan
Nuôi cấy phôi hay cơ quan tách khỏi cơ thể
Thuận lợi
Chức năng sinh lí bình thường được duy trì
Tế bào giữ trạng thái biệt hóa hoàn toàn
Bất lợi
Không thể nuôi cấy quy mô lớn
Phát triển chậm
Fresh explantation is required for every experiment.
Experimental Methods 2006
6
Nuôi cấy mô
Các mảnh của mô được phát triển trong môi trường nuôi cấy
Thuận lợi
Một số chức năng bình thường được duy trì
Có thể nuôi cấy quy mô lớn (nhưng khó tiến hành)
Bất lợi
Tổ chức ban đầu của mô mất
Experimental Methods 2006
7
Nuôi cấy tế bào
Mô được tách thành tế bào đơn, hầu hết là bằng enzyme, thành huyền phù tế bào được nuôi cấy in vitro như monolayer hay nuôi cấy huyền phù
Thuận lợi
Phát triển một dòng tế bào qua nhiều thế hệ
Có thể nuôi cấy quy mô lớn
Bất lợi
Tế bào mất một số đặc tính đã biệt hóa trong mô
EMP04
8
Experimental Methods 2006
9
Tại sao cần nuôi cấy mô?
Nghiên cứu
Vượt qua các vấn đề trong nghiên cứu như:
Các tác động của các mô xung quanh
Các biến đổi mà do các điều kiện của động vật
Giảm các động vật sử dụng
Sản xuất các sản phẩm thương mại
vaccine, antibody, hormone
Tế bào sử dụng cho cấy ghép

Experimental Methods 2006
10
Advantages of Cell culture
Advantages:
Absolute control of physical environment
Homogeneity of sample
Less compound needed than in animal models
Disadvantages:
Hard to maintain
Only grow small amount of tissue at high cost
Dedifferentiation
Instability, aneuploidy
11
Các kiểu nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy sơ cấp (Primary Culture)
Thu nhận trực tiếp từ các mô và nuôi cấy theo kiểu như
Sự phát triển ra của các mô trong nuôi cấy
Tách thành tế bào đơn (bằng enzyme hay cơ học)
Thuận lợi:
Thường giữ được nhiều các đặc tính đã được biệt hóa của tế bào in vivo.
Bất lợi:
Ban đầu hỗn tạp nhưng sau đó trở nên nổi trội ở các fibroblast
Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức
Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn
12
Nuôi cấy thứ cấp
Coy chuyền (or passage, or transfer) từ nuôi cấy sơ cấp
Cấy chuyền = quá trình thu nhận và tái nuôi cấy tế bào sau khi chúng gia tăng số lượng bản sao trong nuôi cấy
Thường chứa kiểu êế bào đơn
Có thể tăng sinh liên tục trong nhiều thế hệ
Có hai kiểu dòng tế bào khi nuôi cấy:
Dòng tế bào
Dòng tế bào liên tục
Các kiểu nuôi cấy tế bào
Experimental Methods 2006
13
Dòng tế bào
Có đời sống hạn định, lão hóa sau một số âần cấy chuyền nhất định (chừng 30 lần phần chia)
Thường là lưỡng bội và duy trì một số mức độ biệt hóa
Cần thiết để thiết lập một hệ thống ngân hàng Master và ngân hàng làm việc để duy trì những dòng này trong thời gian dài
Các kiểu nuôi cấy tế bào
Experimental Methods 2006
14
Dòng tế bào liên tục
Có thể tăng sinh không hạn định
Chúng thường là những tế bào chuyển dạng:

Tế bào từ khối u.
Nhiễm với các viral oncogenes
Xử lí hóa chất (chemical treatments).
Bất lợi của những dòng này là giữ lại rất ít các đặc tính in vivo.
Experimental Methods 2006
15
Chuyển dạng (Transformation) Và Chuyển nhiễm (Transfection)
Chuyển dạng
Cảm ứng thay đổi kiểu hình ban đầu thông qua ưự thay đổi DNA và sự biểu hiện gen
Tốc độ phát triển
Kiểu phát triển (loss of contact inhibition)
Hình thành sản phẩm chuyên biệt
Kéo dài tuổi thọ
Mất khả năng bám dính
Chuyển nhiễm
Đưa DNA vào trong tế bào (like viral DNA)
Experimental Methods 2006
16
Khởi sự một nuôi cấy
Mô
Nuôi cấy tế bào sơ cấp
Dòng tế bào
Dòng tế bào liên tục
Phân tách
Cấy chuyền
Hạn định số lượng
Không hạn định số lượng
Bảo quản
Bảo quản
Experimental Methods 2006
17
Hình dạng tế bào khi nuôi
Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở 2 dạng chính:
Phát triển huyền phù (như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào)
Dòng tế bào thu từ máu (leukaemia, lymphoma)
Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi.
Tế bào thu từ các mô rắn (lungs, kidney), endothelial, epithelial, neuronal, fibroblasts
Hela-Epithelial
MRC5-Fibroblast
SHSY5Y-Neuronal
BAE1-Endothelial
Experimental Methods 2006
18
Special types of Cell culture
Cells in the culture can be grown to adopt in vivo characteristic
Histotypic culture
Single cell lineage
Organotypic culture
Multiple cell lineages
Experimental Methods 2006
19
Sinh học của tế bào nuôi cấy
Sự phát triển và tăng trưởng của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc:
Trạng thái tự nhiên của tế bào
Môi trường nuôi cấy
Cơ chất tế bào bám
Thành sinh lí và sinh lí của môi trường nuôi
Thành phần của phase khí
Nhiệt độ nuôi
Tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền
Experimental Methods 2006
20
Chu kì tế bào
M
Mitosis
G1
Gap1
G2
Gap2
G0
S
Synthesis
G1 check point
cell big
environment suitable
G2 check point
DNA replicated
cell big
environment suitable
Metaphase check point
chromosome align on spindle
Experimental Methods 2006
21
Chu kì tế bào
Interphase:
Nhìn chung kéo dài từ 12-14 giờ trong mô động vật có vú
Tế bào đang tổng hợp RNA,tạo protein và phát triển về kích thước
Gap 0 (G0): tế bào thoát ra khỏi chu kì tế bào và không phân chia
Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích thước, tổng hợp RNA và protein, có 1 G1 Checkpoint
S Phase: sự nhân đôi DNA xảy ra
Gap 2 (G2): tế bào sẽ tiếp tục phát triển và sản xuất các protein mới. Có 1 G2 Checkpoint
 Mitosis hay M Phase:
Sự phát triển và tổng hợp protein ngừng
Tế bào chia thành 2 tế bào giống nhau.
Mitosis thường xảy ra từ 1-2 giờ
Có Checkpoint trong giữa kì của Mitosis (Metaphase Checkpoint) để đảm bảo tế bào hoàn thành xong sự phân chia.
Experimental Methods 2006
22
Các nhân tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh tế bào
Kích thích sự tăng sinh
Mật độ thấp (leaves the cell with free edge)
Các tín hiệu từ môi trường: các nhân tố phát triển
Ức chế sự tăng sinh
Giới hạn mật độ: mật độ tế bào cao
Kìm hãm tiếp xúc: tương tác tế bào
Các tín hiệu từ môi trường: p53 gene product
Experimental Methods 2006
23
Nhân tố ảnh hưởng đến sự biệt hóa
Sự biệt hóa tế bào là quan trọng cho các chức năng tế bào bình thường
Nhân tố kích thích sự biệt hóa tế bào:
Mật độ tế bào cao
Tương tác tế bào-tế bào và tương tác tế bào-chất nền
Chất cảm ứng: hydrocortisone, retinoid, matrix
Experimental Methods 2006
24
Các nhân tố ảnh hưởng đến tính bám dính
Sự bám dính tế bào là cần thêết cho sự tăng sinh và biệt hóa (signaling through cytoskeleton)
Các phân tử bám dính tế bào:
Tương tác tế bào-tế bào: CAMs, cadherins
Tương tác tế bào-chất nền: integrin, transmembrame proteoglycan
Phức hợp nối chặt (Tight junctional complex) trong tế bào biểu mô cho sự tương tác tế bào-tế bào.
Experimental Methods 2006
25
Các nhân tố ảnh hưởng đến sự bám dính
Sự phân tách bằng enzyme tiêu hủy các phân tử bám dính và chất nền ngoại bào
Hầu hết tế bào từ mô rắn phát triển dạng monolayer
Bề mặt bao phủ với Matrix kích thích sự tăng sinh và biệt hóa`
Experimental Methods 2006
26
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào
Tế bào thích hợp
Điều kiện thích hợp
Phase rắn
Cơ chất hay phase mà tế bào phát triển eg. glass, plastic, collagen, agar
Phase lỏnt
Các đặc tính sinh lí và lí hóa của thành phần môi trường nuôi
Phase khí
Nhiệt độ
Độ vô trùng của môi trường
Experimental Methods 2006
27
Pha rắn
Tế bào cần bám dính vào một giá thể để sinh trưởng và di chuyển
Dụng cụ phổ biến nâất là polystyrene plastic
Những cơ chất khác như glass, filter wells
Bề mặt có têể được xử lí với:
Phủ với cơ chất nền như Collagen, poly-l-lysine, matrigel
Lớp feeder: monolayer of supporting cells, perhaps promote cell growth and differentiation by cell contact and substance secreted
Neurons on glial cell feeder layers


Experimental Methods 2006
28
Phase lỏng
Thành phần của môi trường
Muối vô cơ
Cân bằng áp suất thẩm thấu
Điều hòa điện thế màng: sodium, potassium và calcium ions.
Cần thiết cho sự bám dính như enzyme cofactor.
Carbohydrate
Hầu hết chứa 4-20 mM glucose
Nguồn năng lượng: glycolysis
Experimental Methods 2006
29
Phase lỏng
Proteins and Peptides
Được sử dụng để thay thế hiện diện trong huyết thanh eg. transferrin, fibronectin
Amino acids
Quan trọng cho sự tăng sinh và biệt hóa
glutamine có thể đi vào chu trình Kreb’s cycle
Fatty Acids and Lipid
Quan trọng trong môi trường serum free media e.g. cholesterol and steroids cần thiết cho các tế bào đặc biệt.
Experimental Methods 2006
30
Phase lỏng
Vitamin
vitamins B cần thiết cho sự phát triển và sự tăng sinh
Tiền chất cho các co-factors
Vitamins thường sử dụng là thiamine, riboflavin and biotin
Trace Element
zinc, copper, selenium và tricarboxylic acid intermediates.
Selenium is a detoxifier và giúp tách các gốc O2 tự do
Experimental Methods 2006
31
Phase lỏng
Hệ đệm
Hầu hết các tế bào cần pH tối ưu: 7.2 - 7.4
Kiểm soát pH cần thiết cho nuôi cấy tối ưu:
Hệ thống đệm bicarbonate/CO2
Hệ đệm hóa chất: HEPES
Môi trường nuôi cấy thương mại như pH indicator
vàng (acid) hay hồng (alkali)
Áp suất thẩm thấu
Tương tự áp suất thẩm thấu 290 mOsm
Experimental Methods 2006
32
Phase lỏng
Huyết thanh
Nhân tố không xác định: albumins, growth factors và growth inhibitors
Gia tăng khả năng đệm
Tăng khả năng bám dính và trung hòa chất độc
Quan trọng cho các tế bào phát triển chậm hay khi nuôi mật độ thấp
Biến thiến từng mẻ
Huyết thanh bất họat nhiệt (incubation at 56ºC for 30 minutes) có thể giúp giảm rủi ro nhiễm
Experimental Methods 2006
33
Phase khí
Carbondioxide
Quan trọng cho hệ đệm
5-10% CO2
Sản xuất sản phẩm: pyruvate




Oxy
Hầu hết tế bào cần thiết phân áp oxy thấp
anaerobic glycolysis
Nồng độ oxy cao có thể gia tăng gốc O2 tự do
Experimental Methods 2006
34
Nhiệt độ
Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào loài
Nhiệt độ cơ thể mà tế bào được thu nhận
Nhiệt độ của của vùng mô thu nhận tế bào (skin temperature may be lower than the rest of the body)
Experimental Methods 2006
35
Kĩ thuật vô trùng
Vi sinh vật là vấn đề nguy hại chính trong nuôi cấy tế bào
Ngăn ngừa sự nhiễm:
Kháng sinh
Cải thiện điều kiện PTN
Kĩ thuật vô trùng
Bề mặt sạch và gọn gàng
Người “sạch”
Rửa tay
Nón, khẩu trang, găng tay
Hóa chất và môi trường
Dụng cụ nuôi cấy
Experimental Methods 2006
36
Đông lạnh dòng tế bào
The aim of cryopreservation is to enable stocks of cells to be stored to prevent the need to have all cell lines in culture at all times
Reduced risk of microbial contamination
Reduced risk of cross contamination with other cell lines
Reduced risk of genetic drift and morphological changes
Work conducted using cells at a consistent passage number
Reduced costs (consumables and staff time)
Đông lạnh dòng tế bào