Nhân dòng đọc trình tự và biểu hiện trong P.pastoris một cDNA xylanase được phân lập từ Aspergillus awamoris

Hướng dẫn: Ths. Trịnh Đình Khá
Nhân dòng đọc trình tự và biểu hiện trong
Pichia pastoris một cDNA xylanase vừa
được phân lập từ Aspergillus awamoris
ĐẠI HỌC KHOA HỌC
Bô môn khoa học sự sống
Bài đăng trên tạp chí công nghệ sinh học Châu Phi, tháng 12 năm 2008
Thái Nguyên 2009
Giới thiệu về xylan và xylanase
Xylan là gì?

Là một thành phần của hemicelluloses mà cấu tử chính là các xylose.
Được coi là một loại polimer sinh học phổ biến (thứ 2 sau cellulose).
Xylanase là gì?

Một loại protein Enzyme
Xylanase xúc tác cho phản ứng nội thủy phân liên kết 1-4-β-xylosidic

Trong công nghiệp giấy
Trong công nghiệp thực phẩm
Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi (SEBphytase 2MG, Chế phẩm sinh học Trichoderma…)
…
Ứng dụng của xylanase
Hướng nghiên cứu về xylanase hiện nay
Tìm kiếm chủng mới có thể sản xuất xylanase

Nhân dòng và biểu hiện gen xylanase
Chủng giống
Aspergillus được thu thập
E.coli JM109 sử dụng như tế bào chủ nhân dòng
Pichia pastoris tế bào chủ nhân dòng và biểu hiện
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Các môi trường nuôi cấy
N
G
U
Y
Ê
N

L
I
Ệ
U

VÀ

P
H
Ư
Ơ
N
G

P
H
Á
P
Phân lập chủng sản xuất xylanase
Các chủng khác nhau bao gồm Aspergillus sp. SH-2016 được phân lập từ các mẫu đất, phương thức phân lập chi tiết thực hiện theo phương pháp đã được Abrusci mô tả (Abrusci, 2005).
N
G
U
Y
Ê
N

L
I
Ệ
U

VÀ

P
H
Ư
Ơ
N
G

P
H
Á
P
Phân lập gen

Chuẩn bị RNA tổng số thực hiện theo phương pháp của Chomozynsky và Sachi (1987)
Tổng hợp và khuếch đại cDNA
Nhân dòng gen và đọc trình tự
N
G
U
Y
Ê
N

L
I
Ệ
U

VÀ

P
H
Ư
Ơ
N
G

P
H
Á
P
N
G
U
Y
Ê
N

L
I
Ệ
U

VÀ

P
H
Ư
Ơ
N
G

P
H
Á
P
Kết quả đọc trình tự gen mã hóa xylanase
Các bước biểu hiện gen
Thiết kế vector biểu hiện
Thao tác với DNA và biến nạp
Tinh sạch và biểu hiện protein
Xác định hoạt độ của xylanase
N
G
U
Y
Ê
N

L
I
Ệ
U

VÀ

P
H
Ư
Ơ
N
G

P
H
Á
P
Thiết kế vector biểu hiện
Thực hiện phản ứng PCR với mồi xuôi có điểm nhận biết của EcoR I mồi ngược có điểm nhận biết của Xho I
Xử lý vector và sản phẩm PCR với enzyme EcoR I và Xho I. Sau đó nối bằng Lygase
Biến nạp vào E.coli
Tách plasmid từ E.coli đã tái tổ hợp thành công
Chuyển vào P.pastoris nhờ tạo lỗ bằng điện
N
G
U
Y
Ê
N

L
I
Ệ
U

VÀ

P
H
Ư
Ơ
N
G

P
H
Á
P
Thao tác DNA và biến nạp
Thao tác DNA, phân lập plasmid, và điện di trên gel agarose được thực hiện theo Sambrock (Sambrock, 2001).
Biến nạp vào E.coli được thực hiện theo Chung (Chung, 1989).
N
G
U
Y
Ê
N

L
I
Ệ
U

VÀ

P
H
Ư
Ơ
N
G

P
H
Á
P
Tinh sạch và biểu hiện protein
Chọn khuẩn lạc chuyển vào môi trường BMGY nuôi cấy qua đêm
Ly tâm 6000 vòng/10 phút thu tế bào
Chuyển sang môi trường BMMY (nuôi trong 3 ngày) được cảm ứng bằng methanol
Sau khi biểu hiện, dịch lên men lỏng được ly tâm ở 8000 vòng/10 phút ở 4°C thu dịch nổi lấy enzyme thô
Tinh sạch enzyme bằng cách sử dụng cột NI2±NTA

N
G
U
Y
Ê
N

L
I
Ệ
U

VÀ

P
H
Ư
Ơ
N
G

P
H
Á
P
Phân tích hoạt độ enzyme
(phương pháp dinitrosalisilic,Miller,1959)
Hỗn hợp phản ứng gồm: 1ml dịch xylan trong đệm nitrate 50mM, pH=5. Thêm vào 1ml enzyme
Ủ ở 50°C trong 30 phút
Xác định hoạt độ bằng quang phổ
N
G
U
Y
Ê
N

L
I
Ệ
U

VÀ

P
H
Ư
Ơ
N
G

P
H
Á
P

Dựa trên các đặc điểm hình thái sinh lý và
hóa sinh

Dựa trên kết quả phân tích trình tự gen ITS
rDNA
Nhận biết được chủng Aspergillus sp
SH-2016 (A. awamori)
KẾT QUẢ
K
Ế
T

Q
U
Ả
Cây phân loại
Thiết kế được vector biểu hiện

Biểu hiện và tinh sạch protein
K
Ế
T

Q
U
Ả
Biểu hiện được gen sinh xylanase trong Pichia pastoris
Tinh sạch được enzyme tái tổ hợp
K
Ế
T

Q
U
Ả
Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính của xylanase
K
Ế
T

Q
U
Ả
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của xylanase
K
Ế
T

Q
U
Ả
Ảnh hưởng của một số chất đến hoạt tính của xylanase
K
Ế
T

Q
U
Ả
Nhóm thực hiện :
Nguyễn Hải Chiều
Đoàn Thị Hoài
Trương Văn Hướng
Vũ Xuân Lãm
Đào Thanh Quyên
Hứa Đức Thái
Nguyễn Thị Thủy
Thank you for anttention !