Nguyên lí công nghệ gen

Những nguyên lý về công nghệ gen
Công nghệ gen còn được sử dụng với nhiều tên gọi khác nhau: kỹ thuật gen, kỹ thuật di truyền, công nghệ DNA tái tổ hợp.
Công nghệ gen là thuật ngữ chỉ tập hợp nhiều kỹ thuật nghiên cứu gen, bộ gen và các thao tác trên gen nhằm điều chỉnh, biến đổi gen hoặc tạo ra các gen mới.
Công nghệ gen được thực hiện dựa trên một số nguyên lý cơ bản sau:
Những yếu tố cần thiết trong công nghệ gen.
Các yếu tố cần thiết để việc thực hiện các thao tác trong kỹ thuật gen có hiệu quả, cần có các yếu tố cơ bản: chuẩn bị gen cần tách dòng (RNA, DNA tinh sạch), yếu tố vận chuyển (vector tách dòng, vector biểu hiện), hệ thống tế bào chủ, các loại enzym cần thiết (enzym giới hạn – restruction enzyme; nuclease; ligase; polymease…). Ngoài ra còn đòi hỏi một số thiết bị, hóa chất cần thiết.


H1. Sơ đồ vector tách dòng là Ti plasmid
Nguyên lý công nghệ gen.
1. Các bước chủ yếu của kỹ thuật gen.
Kỹ thuật gen gồm nhiều giai đoạn khác nhau, có thể chia thành các bước cơ bản sau:


H2. Sơ đồ các bước chủ yếu của kỹ thuật gen

B1: Tách chiết, tổng hợp DNA từ sinh vật cho (DNA tách dòng, DNA xen, DNA mục tiêu…) và DNA vector (thường dùng plasmid hoặc phage)
B2: Cắt cả 2 loại DNA bằng cùng 1 enzym giới hạn để tách đoạn DNA mục tiêu và mở vòng plasmid.
B3: Gắn nối DNA mục tiêu và DNA vector để tạo phân tử DNA tái tổ hợp (vector tái tổ hợp).
B4: DNA tái tổ hợp được chuyển và duy trì vào tế bào chủ (thường là vi khuẩn) => gọi là biến nạp.
Có thể sử dụng các phương pháp khác nhau để thực hiện kỹ thuật biến nạp (sốc nhiệt, xung điện, súng bắn gen…), đồng thời tạo các điều kiện môi trường thích hợp để vector tái tổ hợp tồn tại và được nhân lên cùng tế bào chủ.
Nhờ đặc tính sinh sản rất nhanh của vi khuẩn, phân tử DNA tái tổ hợp được nhân lên thành vô số bản sao.
B5: Sàng lọc các dòng tế bào mang vector tái tổ hợp: các tế bào chủ tiếp nhận DNA tái tổ hợp được phát hiện và chọn ra.
B6: Kiểm tra sự biểu hiện của gen tách dòng trong tế bào chủ, thông thường sử dụng khảo nghiệm miễn dịch.
2. Các nguyên tắc kỹ thuật gen cơ bản.
Nguyên tắc chọn vector tách dòng.
- Dựa vào kích thước và bản chất của đoạn DNA cần tách dòng làm căn cứ để chọn vector.
Vd: Nếu cài đoạn DNA vó nguồn gốc từ procaryota (vi khuẩn, vi nấm…) có thể dùng plasmid, cosmid, phage… làm vector tách dòng.
Nếu cài đoạn DNA có nguồn gốc từ Eucaryota thì cần chọn vector tách dòng là phage, NST nấm men, virus…
- Cũng cần chú ý tới sự tương đồng các vị trí cắt đặc hiệu của enzym giới hạn giữa đoạn DNA ngoại lai và vector tách dòng phải bổ sung với nhau. Tức là cả DNA ngoại lai và vector tách dòng phải được cắt đặc hiệu bằng cùng 1 loại enzym giới hạn.
- Vector tách dòng phải thích hợp với tế bào chủ, có khả năng tái bản trong tế bào chủ, tạo số lượng bản sao lớn nhưng không gây ảnh hưởng đến hoạt động của tế bào chủ.
- Vector tách dòng phải có trình tự điều hòa tạo thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ.
- Vector tách dòng phải có gen chỉ thị (chỉ thị màu hoặc chỉ thị kháng sinh) dễ nhận biết để dễ chọn ra các vector tái tổ hợp.
- Vector tách dòng phải tạo nên tỉ lệ vector tái tổ hợp cao
b. Nguyên tắc tạo vector tái tổ hợp (DNA tái tổ hợp).


H3. Các bước tạo vector tái tổ hợp
Tạo vector tái tổ hợp là thực hiện gắn nối gen cần tách dòng vào vector tách dòng.
Quy trình tạo vector tái tổ hợp:
B1: Chuẩn bị nguyên liệu, gen tách dòng tinh sạch được nhân lên bằng PCR
B2: Nối gen cần tách dòng với vector bằng phản ứng nối gen với các thành phần phản ứng thích hợp.
B3: Hỗn hợp các thành phần phản ứng được ủ qua đêm ở nhiệt độ 16o C. Sau đó tiến hành điện di với thang DNA chuẩn để kiểm tra kết quả tạo vector tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp cần được giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ lạnh sâu: -80o C đến -85o C để tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ có thể được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như: sốc