Một số thuốc thử thông dụng

MỘT SỐ THUỐC THỬ THÔNG DỤNG

Thuốc thử Barfoed: Thuốc thử này trông giống thuốc thử Benedict nhưng hơi khác một chút . Dung dịch được chuẩn bị bằng cách hòa tan 70g Đồng acetat monohydrat với 9ml axít acetic băng trong nước sau đó đưa vào bình định mức 1lít rồi thêm nước cho đến vạch định mức, dung dịch có thể sử dụng trong thời hạn một năm.
 
Khi 1ml dung dịch thuốc thử này được đun nóng với 5 giọt chất mẫu, kết quả dương tính đối với monosacarit là sự hình thành kết tủa đỏ gạch tồn tại trong vòng 5 phút. Còn disacarit nhìn chung không thấy phản ứng xảy ra sau 10 phút đun nóng với thuốc thử. Kết tủa sẽ không đóng váng như khi thử với thuốc thử Benedict.
Thuốc thử Benedict: Chúng tôi thường dùng thuốc thử bán trên thị trường vì nó có tính ổn định cao hơn dung dịch pha chế trong phòng thí nghiệm. Hiện nay ở Việt Nam chưa thấy xuất hiện thuốc thử này, thường nếu muốn mua bạn phải nhập khẩu. Dung dịch pha chế trong phòng thí nghiệm được phân ra hai loại, một là dung dịch thô dùng cho phân tích định tính, hai là dùng cho phân tích định lượng:
Với dung dịch thô tiến hành như sau: trước hết hòa tan 100g Na2CO3  và 173g Natri Citrat dihydrat trong 850ml nước, khuấy đều và cho từ từ dung dịch  của 17.3 g Đồng sulfat trong 100ml nước. Sau đó thêm hỗn hợp vào bình định mức 1lít và thêm nước đến vạch chỉ định, thuốc thử có thể sử dụng lâu dài.
Trong 600ml nước nóng hòa tan các chất sau:
-         200g Natri citrat (C6H5Na3O7)
-         75g Natri cabonat
-         125g Kali thiocynat
            Trong 100ml nước hòa tan
-         18g CuSO4.5H2O
Khi các dung dịch đã nguội trộn chúng với nhau và khuấy đều sau đó thêm 5ml  dung dịch Kali 
            Ferocyanit rồi thêm nước vào cho đủ 1lít.
Khi 1ml dung dịch thuốc thử được đun nóng với 5 giọt chất mẫu trong một cốc nước, dấu hiệu tích cực khi kiểm tra sự có mặt của đường khử là hình thành kết tủa trong 5 phút. Khoảng biến màu từ xanh lá cho đến vàng rồi chuyển qua màu cam sau đó là màu đỏ gạch tùy thuộc vào hàm lượng đường khử có trong chất mẫu; với một mẫu chứa 1% glucose thì màu của kết tủa thường là đỏ gạch.
Thuốc thử Bial: Hòa tan 3 g orcinol (C7H8O2) trong 500 mL axít  HCl đậm đặc, thêm 2,5 ml dung dịch feric clorua hexahydrat 10% và hòa tan hỗn hợp thành 1lít với nước và lúc này HCl xấp xỉ 6M. Thuốc thử chỉ bền trong vòng vài tuần, nhưng tôi chưa thử để lâu hơn, bạn hãy thử xem sao. Thuốc thử Bial được pha chế theo cách cổ điển  được chuẩn bị trong 1lít HCl đậm đặc không pha loãng với nước. Dung dịch này phản ứng nhanh hơn (30-60 giây) nhưng kém bền so với thuốc thử pha chế bằng phương pháp nêu trên và hơi của HCl đậm đặc là cả một vấn đề nan giải. Và bạn cũng có thể dùng HCl 4M vẫn phản ứng tốt nhưng chậm  và cho màu yếu hơn.
Khi 1ml dd thuôc thử được đun nóng với 5 giọt chất mẫu trong một cốc nước thì dấu hiệu tích cực với pentose(phân tử đường chứa 5 cacbon) là sử đổi màu dung dịch từ xanh lá sang xanh da trời  trong chốc lát.
Thuốc thử Biuret:  Thêm 300ml dung dịch NaOH 10% về thể tích vào 500ml dung dịch chứa 0.3% đồng sulfat pentahydrat và 1.2% Kali  Tartrat (C4H4K2O6) khuấy đều rồi pha loãng thành 1lít dung dịch. Sau đó để dung dịch ở chỗ tối ngay để tránh thuốc thử bị biến tính.
·        Thuốc thử có thể dùng trong phân tích định tính và định lượng. Trong một phản ứng tiêu biểu một phần thể tích của mẫu được trộn với 2 phần thể tích của thuốc thử; tỉ số tối giản phụ thuộc vào nồng độ tối đa của protein mà bạn muốn phát hiện. Sự xuất hiện của protein sẽ cho ra màu tìm với bước sóng hấp thụ khoảng 550-555nm, chúng tôi thường đọc được ở 540nm.
Thuốc thử Bradford: Hòa tan 100mg  Coomassie Blue G-250 (C41H44N3NaO6S2) trong 50 mL  etanol 95%,  Thêm 100ml dung dịch axít photphoric 85%, và pha loãng đến 1lít. Thuốc thử cần được lọc ít nhất một lần, nếu thấy chưa hài lòng bạn có thể lọc 2 đến 3 lần khi thấy kết tủa xuất hiện trong duc dịch. Thuốc thử Bradford có bán trên thị trường với cấu trúc tương đối bền. Tôi nghe một số người nói rằng công thức của Sigma dùng 40ml metanol 4%  và 120ml photphoric axít 10%. Tôi đã thử nhưng không thấy gì tốt hơn phương pháp cổ điển cả. Người ta nói dung dịch này kém bền nhưng tôi đã dùng cả năm nay không thấy vấn đề gì.
·        Để định lượng protein hãy trộn 0.25ml mẫu với 2.5 ml thuốc thử Bradford. Sau 5 phút đo phổ