Marker DNA _Microsatellites (Simple Sequence Repeat - SSR)

KỸ THUẬT DI TRUYỀN
PHƯƠNG PHÁP Simple Sequence Repeat(SSRS)
Nhóm gồm: NGÔ NGỌC TUYỂN MSSV:61003165
NGUYỄN THỊ HÀ MSSV:61003040
NGUYỄN NGỌC THÙY LINH MSSV:60903048
I. Khái niệm về phương pháp SSRs
Microsatellites(SSR) , còn được gọi là sự lặp lại trình tự đơn giản (SSRS) hoặc lặp đi lặp lại song song ngắn (STRs), được lặp đi lặp lại trình tự từ 2-6 cặp base của DNA
ADN Microsatellite

ADN Microsatellite gồm những khối nhỏ các đoạn lặp đơn giản , còn gọi là yếu tố lặp trình tự đơn giản ( Simple sequencing repeats – SSR )
Khối các đoạn lặp 2 Nu là phổ biến nhất ( 0,5% genome ) : trong đó lặp cặp CA/GT là phổ biến và có tính đa hình cao, cặp AT/TA và cặp AG/TC thì phổ biến còn cặp CG/GC thì hiếm gặp.
Khối các đoạn lặp 1 Nu : trong đó lặp A và T thì rất phổ biến còn lặp G và C thì rất hiếm.
SSRS có thể được khuếch đại để xác định phản ứng dây chuyền polymerase (PCR) quá trình, bằng cách sử dụng chuỗi duy nhất
DNA liên tục bị làm biến tính ở nhiệt độ cao để tách các sợi đôi, sau đó làm lạnh để cho phép ủ mồi và phần mở rộng của trình tự nucleotide thông qua SSRS
Quá trình này cho kết quả nhìn thấy trên gel agarose hoặc polyacrylamide , chỉ một lượng nhỏ DNA cần thiết cho việc khuếch đại bởi vì theo cách này thermocycling tạo ra một sự gia tăng theo cấp số nhân trong phân đoạn nhân rộng.
quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân
quá trình trượt lỗi trong quá trình sao mã
II. Cơ chế đột biến hình thành
Microsatellites
Trong đó quá trình trượt lỗi lúc sao chép là chủ yếu và nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trượt của phân tử ADN mới tổng hợp mà phân tử enzyme polymerase không nhận biết được. Sự trượt lỗi này tạo ra một chỗ phình nhất thời mà có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc là có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn
Cơ chế trao đổi chéo trong giảm phân
Trong quá trình giảm phân, sự trao đổi chéo giữa các NST không tương đồng đã tạo nên những đoạn có trình tự lặp của các microsatellite thay đổi.
Trong đó có 1 NST tăng chiều dài đoạn lặp ( NST A ) và một NST giảm chiều dài
đoạn lặp ( NST B )
Sự trượt lỗi của enzym ADN polymerase trong quá trình sao chép làm tăng hoặc giảm chiều dài đoạn lặp
III. Các loại SSRs
Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6lần) chúng ta có (di nucleotide repeat) tri nucleotide loại di nucleotide được tìm thấy nhiều ở động vật có vú chủ yếu là GT/AC, ở thực vật là AA/TT, AT/TA.
Chúng có thể phân ra 3 loại ( hoàn hảo không có sự ngắt quãng trong trình tự phối hợp và ngắt quãng bao gồm kết hợp nhiều loại lặp lại, ngắt quãng bị chèn bởi một hoặc nhiều base. Như hình vẽ

CACACACACACA(Hoàn hảo)
CACACACAGAGAGA(Phối hợp giữa CA và GA)
CACATTCACACATTCATT(Ngắt quãng, chèn TT)
Những đoạn DNA lặp lại ngẫu nhiên trong hệ gen của cơ thể sống được phân làm 3 loại chính.

1.Satellites là đoạn trình tự lặp lại 1 lần mà có thể cấu tạo tới vài phần trăm của genome . Satellites thường tập trung ở vùng tâm động của nhiễm sắc thể do đó nó it khi được sử dụng trong phân biệt kiểu gen của các cá thể mà được sử dụng nhiều trong quá trình lập bản đồ gen ở gần vùng tâm động.
2. Minisatellites có mặt tại hàng trăm hoặc hàng nghìn vị trí khác nhau trên gennome mà ở đó một đơn vị lặp lại từ 10 bp cho tới 0,5-30 kb. Để phát hiện ra minisatellite người ta có thể dùng phương pháp mẫu dò phóng xạ. Những thông tin này có thể tạo nên thông tin đặc biệt riêng cho từng cá thể như kiểu "dấu vân tay" ở người. Nó được sử dụng để xác định quan hệ trong gia đình và nguồn gốc của các mẫu vật.
3. Microsatellite là các đoạn lặp lại ngắn 2-6 bp và kích thước mỗi locus là 20-100 bp. Microsatellite được ứng dụng nhiếu hơn cả vì nó đơn giản hơn, phân bố đều trên genome. Các thông tin về đa allen của một locus cũng như trên nhiều locus cùng một lúc có thể được phân tích một cách đơn? giản và nó có thể đủ lớn cho các phương pháp thống kê để đưa ra nhiều thông tin bổ ích về cấu trúc quần thể, hệ phả, khoa học hình sự,
Microsatellite có tính đa hình rất cao (đa hình theo chiều dài) là những allen đồng trội nó có các tính chất cần thiết cho một marker.
Tần số đột biến lớn, nó tuân theo định luật menden, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể có thể xác định được bằng PCR từ một lượng DNA rất nhỏ.
III. phương pháp xác định Microsatellite(SSRs)
Để tìm và xác định Microsatellites ta có một số các thủ tục xác định như sau:
Cắt nhỏ ADN genome bằng các enzym giới hạn.
Phân tách các đoạn ADN bằng điện di trên gen thạch agarose 1%, phân tách các đoạn từ 300- 500bp
6. Chuyển vào một vector sequencing.
3. Chuyển lên màng lai (nylon membral) theo nguyên tắc southernblot.
4. Dùng các mẫu dò là các đoạn ADN đã được đánh dấu cho lai ghép với màng lai, các mẫu dò là các trình tự ADN tương ứng với trình tự Microsatellite mà chúng ta quan tâm.
5. So sánh và khôi phục các vạch AND tương ứng với Microsatellite mà chúng ta quan tâm
7. Sequencing và xác định SSR cũng như trình tự ADN nằm ngoài trình tự SSR, đây là vùng để thiết kế mồi.
8. Tổng hợp mồi và kiểm tra sự đa hình của Microsatellite. kích thước của các alen chỉ khác nhau từ hai nucleotide trở lên mặt khác trong quá trình tổng hợp PCR, polymeraza có thể tạo thêm hoặc có thể bỏ sót một đơn vị lặp lại một nucleotide A nữa. Do vậy để xác định kích thước các alen đòi hỏi quá trình điện di phải dùng gel có độ phân tách cao
Tạo microsatellite(ssrs) mồi
Nếu biết được vị trí cụ thể của bộ gen, ví dụ như trong một exon của một gen, mồi có thể được thiết kế bằng tay.
Mồi SSR ngẫu nhiên có thể được phát triển bởi các phân đoạn nhân bản ngẫu nhiên của DNA từ các loài đầu mồi.
Các phân đoạn này ngẫu nhiên được đưa vào một plasmid hoặc vi khuẩn vector ,sau đó được cấy vào vi khuẩn ecoli.
IV. phương pháp phát hiện Microsatellite(SSRs)
Phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ

* Phương pháp hiệu quả và xuất phát điểm phải dùng đó là dùng đồng vị phóng xạ.
* Người ta có thể đánh dấu phóng xạ vào một đầu của primer (mồi) (end-labelling) hoặc trộn lẫn một trong bốn thành phần nucleotide A,T,G,C. được đánh dấu ( incorporation-labelling)
* Phương pháp (end-labelling) thường được dùng hơn vì nó có nhiều ưu điểm hơn.
* Phương pháp dùng đồng vị phóng xạ ngày nay rất ít được sử dụng vì nguy hiểm đến sức khoẻ con ngươì và việc xử lý chất thải
Phương pháp phát hiện không dùng đồng vị phóng xạ
Bản gen điện di huỳnh quang
Sắc phổ
Nhờ những tính chất của một marker, Microsatellite được áp dụng trong nhiều lĩnh vực như lập bản đồ gen người, động vật...., nghiên cứu về di truyền loài người những gen liên quan đến bệnh di truyền, xác định hệ phả, hình sự...
V. Những ứng dụng của Microsatellite(SSRs)
trong việc xác định cấu trúc quần thể (đặc biệt là các quần thể tự nhiên) từ các loài khác nhau như vi sinh vật, thực vật, động vật có vú, côn trùng,chim....
Đặc biệt là việc xác định cấu trúc xã hội và liên kết giữa các cá thể, cấu trúc quần thể của các loài có nguy cơ bị thu hẹp hoặc phát triển, xác định mức độ đồng huyết của quần thể, xác định các vị trí liên quan đến các tính trạng số lượng(QTL) có ảnh hưởng đến sản lượng sữa, tỷ lệ mỡ sữa, tỷ lệ và sản lượng protein sữa,
* Trong chuẩn đoán bệnh:
- Vì ADN Microsatellite thay đổi về chiều dài trong sự phát triển của một số bệnh ung thư, chúng là những marker rất hữu ích trong việc dò tìm, phát hiện ung thư sớm. Bởi vì tính đa hình của chúng hữu ích trong sự nghiên cứu các liên kết để định vị những Gen chiụ trách nhiệm về nhiều sự mất trật tự di truyền học
* Nghiên cứu quần thể :
- ADN Microsatellite có thể được sử dụng để phát hiện ra thay đổi đột ngột trong quần thể, hiệu ứng của sự phân đoạn quần thể và sự tương tác của những quần thể khác nhau. Microsatellite hữu ích trong sự nhận ra của những quần thể phôi thai và quần thể mới
VI. Nhược điểm của phương pháp SSRs
Nhược điểm của phương pháp này là quá trình thiết kế mồi đắt, mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho mỗi locus đa hình. Để xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn ADN của genom có chứa SSRs.
Tài liệu tham khảo

Molecular biology Robert F. Weaver University of Kansas – Lawrence 2th Edition.
Giáo trình Công nghệ Sinh học phân tử - Nguyên lý và ứng dụng của ADN tái tổ hợp.NXB KHKT 2007.
www.en.wikipedia.org
www.google.com
www.ncbi.nml.nih.gov
And others websites and materials.
THE END