Lý thuyết thực tập Nuôi cấy mô

Lý thuyết Thực tập Chuyên ngành Di truyền - SHPT

Nuôi cấy mô thực vật
NỘI DUNG
Vấn đề 1: Định nghĩa, mục tiêu và ứng dụng
Vấn đề 2: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật và trang thiết bị
Vấn đề 3: Sự vô trùng
Vấn đề 4: Nhu cầu dinh dưỡng của mô cấy
Vấn đề 5: Pha dung dịch mẫu – Pha môi trường nuôi cấy
Vấn đề 6: Chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Vấn đề 7: Lựa chọn mẫu cấy và các phản ứng của mẫu cấy
Vấn đề 8: Cấy chuyền
Vấn đề 9: Các chất ức chế, sự nhiễm trùng và phương pháp xử lí
Vấn đề 1: Giới thiệu chung về nuôi cấy mô thực vật
Định nghĩa
Cơ sở khoa học
Mục tiêu
Ứng dụng
I. Định nghĩa
I. Định nghĩa
I. Định nghĩa
I. Định nghĩa
I. Định nghĩa
I. Định nghĩa
I. Định nghĩa
I. Định nghĩa
I. Định nghĩa
I. Định nghĩa
Tử diệp
B. Trụ thượng diệp,
C. Trụ hạ diệp
D. Cuống lá
E. Lá
F. Đối chứng
I. Định nghĩa
Nuôi cấy mô thực vật là phương pháp tách rời một bộ phận sạch của cây (mô, tế bào…) đem nuôi cấy trong môi trường thích hợp và cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng tuyệt đối để chúng tiếp tục phân bào rồi biệt hóa thành mô, cơ quan (cụm chồi, chồi…) và phát triển thành cây mới.
Mô, tế bào thực vật (rễ, thân, lá…)
Nuôi cấy vô trùng
Cây hoàn chỉnh
I. Định nghĩa
II. Cơ sở khoa học
Tế bào thực vật có các đặc điểm:
Tế bào, mô thực vật là một phần của cơ thể thực vật nhưng chúng vẫn có tính độc lập.
Nếu tách 1 tế bào hay 1 số tế bào đem nuôi cấy trong môi trường thích hợp và có đủ chất dinh dưỡng thì chúng có thể biệt hóa thành mô, cơ quan và phát triển thành cây hoàn chỉnh.
Tế bào thực vật có tính toàn năng
II. Cơ sở khoa học
Tế bào thực vật có khả năng phân hóa để đảm nhận các chức năng khác nhau và phản phân hóa tế bào để trở về dạng phôi sinh tiếp tục phân chia.
Tế bào phôi sinh
Quá trình phân hóa
Tế bào chuyên hóa
(rễ, thân, lá)
Quá trình phản phân hóa
Sơ đồ sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Sơ đồ sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Tế bào hợp tử
Tế bào phôi sinh
Tế bào chuyên hóa
Tế bào phôi sinh
Tế bào chuyên hóa
Quá trình phân hóa
Quá trình
phản phân hóa
Cây hoàn chỉnh
Cây hoàn chỉnh
Nuôi cấy mô TB
II. Cơ sở khoa học
Tạo quần thể lớn và đồng nhất trong thời gian tương đối ngắn
Tạo được nhiều cây con từ mô hoặc cơ quan của cây (lóng thân, phiến lá, hoa, hạt phấn, chồi phát hoa…)
Làm sạch mầm virus bằng cách cấy mô phân sinh ngọn
Cải biến giống cây trồng bằng đa bội hóa mô cấy, gây đột biến nhân tạo, cấy tế bào trần…
III. Mục tiêu
III. Mục tiêu
IV. Ứng dụng
Nhân giống vô tính (nhân giống sinh dưỡng, vi nhân giống)
Tạo cụm chồi trực tiếp
Tạo cụm chồi gián tiếp từ callus
Tạo phôi sinh dưỡng
Nhân giống hữu tính
Vấn đề 2: PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT VÀ TRANG THIẾT BỊ
Gồm có 3 phòng:
Phòng chuẩn bị mẫu
Phòng cấy
Phòng nuôi
I. Phòng chuẩn bị mẫu
I. Phòng chuẩn bị mẫu
I. Phòng chuẩn bị mẫu
Autoclave xách tay
Autoclave phòng thí nghiệm
I. Phòng chuẩn bị mẫu
I. Phòng chuẩn bị mẫu
I. Phòng chuẩn bị mẫu
II. Phòng cấy
Không cửa sổ
Vách không trực tiếp với bên ngoài
Có máy điều hòa
Đèn huỳnh quang, đèn UV
II. Phòng cấy
Tủ cấy m?t c?a
Tủ cấy hai c?a
III. Phòng nuôi
Nhiệt độ: 22 – 25oC
Ánh sáng: 2800 – 3000lux, thời gian chiếu sáng: 16 – 18 giờ sáng/ngày
Máy điều hòa
Kệ nuôi cấy
Độ ẩm không khí 70%
III. Phòng nuôi
Đảm bảo vô trùng
Chịu nhiệt;
Cho ánh sáng đi qua
Lưu giữ độ ẩm
đảm bảo tiểu
khí hậu
Đảm bảo thông khí với
môi trường bên ngoài
Bình nuôi
Một số dụng cụ, trang thiết bị cho phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật
Một số dụng cụ, trang thiết bị cho phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật
Bình tam giác
Hộp vuông
Bình trụ
Túi nuôi cấy,
ống nghiệm
Khác
Các loại bình nuôi
Đảm bảo vô trùng
Sử dụng nhiều lần
Rẻ tiền
Lưu thông với bên ngoài
Thoáng khí
Các loại nút
bình nuôi
Nút màng polyethylen chịu nhiệt
Nút bông
Cao su chịu nhiệt
Nhựa chịu nhiệt
Một số dụng cụ, trang thiết bị cho phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật
PIPETMAN
BÌNH ĐONG, Ống đong
CÂN KỸ THUẬT
CÂN PHÂN TÍCH
MÁY ĐO PH
Kính hiển vi
Kính LÚP
TỦ ẤM
TỦ NUÔI
MÁY LẮC
BỒN Ổn nhiệt
DỤNG CỤ THUỶ TINH
BẾP TỪ
LÒ VI SÓNG
DAO VÀ KẸP KIM LOẠI
Các muối vô cơ
Các chất hữu cơ
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Vitamin
Cồn
Hóa chất khử trùng
Đường
Agar
Một số hóa chất cần cho phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật
Vấn đề 3: SỰ VÔ TRÙNG
Ý nghĩa của sự vô trùng
Các phương pháp vô trùng
I. Ý nghĩa của sự vô trùng
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin..rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm,khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi.
Sự vô trùng là điều kiện cần thiết để thành công trong việc nuôi cấy mô thực vật
Vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn
Vô trùng bằng nhiệt độ ẩm autoclave
Vô trùng bằng hóa chất
Vô trùng bằng đèn UV
Vô trùng bằng màng lọc
II. Các phương pháp vô trùng
1. Vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn
Dùng hơ miệng bình môi trường và dụng cụ cấy (dao, kẹp)
Để đèn cồn cháy suốt quá trình thao tác trong tủ cấy
II. Các phương pháp vô trùng
2. Vô trùng bằng nhiệt độ ẩm autoclave
Điều kiện hấp khử trùng: 1atm và 103oC / 1,3atm và 121oC
Thời gian tối ưu: 15 – 20 phút
Đối tượng hấp:
Môi trường nuôi cấy, nước cất: Thời gian khử trùng thay đổi tùy theo lượng mội trường trong bình
Dao, kẹp, đĩa petri, cốc thủy tinh (becher), bông gòn
Bình mẫu bị nhiễm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc…
II. Các phương pháp vô trùng
Một số loại nồi khử trùng thông dụng
KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG
2. Vô trùng bằng nhiệt độ ẩm autoclave
II. Các phương pháp vô trùng
2. Vô trùng bằng nhiệt độ ẩm autoclave
II. Các phương pháp vô trùng
- Châm nước
- Xếp dụng cụ vào nồi
- Đóng nắp
- Khĩa van x? hoi, van di?u �p, van x? nu?c
- Nâng nhiệt
- Xả hơi để đuổi không khí (khi đạt 0,5 atm hay 0,5 kg/cm2)
- Tiếp tục nâng nhiệt cho đến nhiệt độ cần khử trùng là 121oC (1 atm hay 1 kg/ cm2)
- Giữ ổn định nhiệt độ trên đến khi hết thời gian khử trùng.
- Tắt điện hoặc nguồn cung cấp nhiệt.
- Để cho áp suất trong nồi trở về không hoặc xả hơi thật chậm
- Mở nắp nồi.
- Để 10 - 15 phút (cho sấy khô giấy gói hoặc nút bông)

2. Vô trùng bằng nhiệt độ ẩm autoclave
II. Các phương pháp vô trùng
CÁCH TIẾN HÀNH
Cồn 90o, 70o: Làm biến tính protein
→ Diệt vi khuẩn, nấm nhưng không diệt bào tử
NaClO, Ca(ClO)2 → Javel
→ Oxy hóa của Cl → Phát hủy vách tế bào → Diệt vi khuẩn
CuSO4, AgNO3, HgCl2…
→ Kim loại nặng đều có tính kháng khuẩn mạnh
→ Cơ chế: Ức chế sự sao chép DNA của vi khuẩn
Chất hoạt động bề mặt: Tween 20; 80
→ Giảm sức căng bề mặt để các chất dễ dàng xuyên vào bên trong mẫu → Rửa mẫu
3. Vô trùng bằng hóa chất
II. Các phương pháp vô trùng
3. Vô trùng bằng hóa chất
II. Các phương pháp vô trùng
Tùy loại mẫu và kích thước mẫu mà thay đổi nồng độ và thời gian khử mẫu
Mở đèn UV trước khi cấy khoảng 15 – 30 phút
Khử trùng không khí trong phòng cấy hoặc tủ cấy
4. Vô trùng bằng đèn UV
II. Các phương pháp vô trùng
Lý do phải khử trùng bằng màng lọc.
Nguyên tắc khử trùng bằng màng lọc.
Ưu diểm: nhanh, không thay đổi thành phần môi trường
Nhược điểm: đắt, rât khó ứng dụng cho các dung dịch có độ nhớt cao...
KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG
5. Vô trùng bằng màng lọc
II. Các phương pháp vô trùng
Vấn đề 4: NHU CẦU DINH DƯỠNG CỦA MẪU CẤY
Yếu tố hóa học
Yếu tố vật lý
I. Yếu tố hóa học
Nước
Muối khoáng
Đường
Vitamin
Amino acid
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Các phức chất tự nhiên
Thạch
Độ pH của môi trường
1. Nước
Nước cất hoặc nước khử ion
I. Yếu tố hóa học
Vai trò:
Vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ
Thành phần không thể thiếu của nhiều enzyme
Cân bằng áp suất thẩm thấu, duy trì thế điện hoá của thực vật
2. Muối khoáng
I. Yếu tố hóa học
2. Muối khoáng
I. Yếu tố hóa học
Muối khoáng đa lượng: lớn hơn 30 mg/L
N; S; P; K; Mg; Ca.
Nitơ: NO3-, NH4+....
Lưu huỳnh: SO42-. Phospho: PO43-
Các muối khoáng
đa lượng
Các muối khoáng
vi lượng
Muối khoáng vi lượng: nhỏ hơn 30 mg/L
Fe; B; Mn; Cu; Zn; Co; I; Mo
Fe: Thường dùng với NaEDTA
Bo: Thiếu → Mô nuôi cấy hoá mô sẹo mạnh, mong nước, khả năng tái sinh kém
Mo: Trao đổi nitrogen
I. Yếu tố hóa học
Vitamin nhóm B – Bổ sung vào phần thiếu hụt của tế bào
B1 (Thiamin hydrocloride); B2: Riboflavin
B5 (Panthotenic acid); Biotin: Cần thiết cho phân bào.
B3 (Panthotenate de calcium), B6 (Pyridoxine HCl)
PP (acid nicotinic), Myo-Inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào
4. Vitamin
Mô thực vật chủ yếu sống bằng phương pháp dị dưỡng, có thể tổng hợp chất hữu cơ nhờ quang hợp.
Thường dùng đường sucrose, có thể dùng glucose
Fructose, malnose... kém hiệu quả.
Manitol, sorbitol: Dùng để ổn định áp suất thẩm thấu.
Các nguồn carbon khác kém hiệu quả
3. Nguồn cacbon
Malt extract: Dịch trích từ lúa đại mạch, rỉ đường, mạch nha
Bột chuối nghiền; Bột khoai tây nghiền
Dich chiết cà rốt, cà chua, khóm; Dịch chiết nấm men
Dich thuỷ phân casein, casein hydrolysat.
Các phức chất
tự nhiện
Nước dừa
Được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào
Thành phần phức tạp, không ổn định tuỳ theo mùa, độ tuổi của cây, nguồn gốc của cây
Tuy vậy có tác dụng rất tốt trong nuôi cấy mô tế bào
Thành phần hoá học: Kích thích sinh trưởng-kinetin, auxin, acid amin tự do, protein, peptid, đường, axit hữu cơ, myo-inositol …
I. Yếu tố hóa học
Amino acid
Kích thích sự tăng trưởng của tế bào
Nguồn cung cấp nitrogen
Các acid amin: Glycine…
I. Yếu tố hóa học
Auxin: Tự nhiên (AIA – Acid Indol Acetic), Nhân tạo (AIB, ANA, 2,4-D)
Cytokinin: Adenin, Kinetin, BA, BAP
Gibberellin (GA3, GA1, GA4, GA7)
Ethylene, Acid Abscisic (ABA)…
Chất điều hòa sinh trưởng
thực vật
Than hoạt tính
Kích thích tăng trưởng và biệt hóa: phong lan, hành, cà rốt, cà chua, trường xuân
Gây ức chế: thuốc lá, đậu
Tác dụng: Giảm độc tố bằng cách đào thải các hợp chất độc, cho phép tế bào sinh trưởng bình thường
Hút các hợp chất cản, chất điều hòa sinh trưởng hoặc làm đen môi trường
Giá thể
Thạch (Agar) là giá thể phổ biến
Là một loại polysacharide chiết xuất từ tảo.
Hoà tan ở trong 80oC.
ở 40oC trở về trạng thái gel- nửa cứng
Ngoài ra còn có một số chất giá thể khác như phytagel, agarose...
Nồng độ: 0.6 – 1%
pH MÔI TRƯỜNG
Là yếu tố cực kỳ quan trọng trong môi trường.
pH ảnh hưởng đến các yếu tố sau:
Sự tương tác giữa các chất, đặc biệt là trong quá trình khử trùng.
Rất quan trọng đối vơi việc thuỷ phân agar. pH càng thấp thì môi trường càng lỏng.
Ảnh hưởng đến các vitamin và các chất hữu cơ.
Trước khử trùng: pH = 5.5 – 5,7 (trừ các thí nghiệm đặc biệt).
Sử dụng KOH, NaOH để điều chỉnh độ pH.
Trong quá trình nuôi cây pH giảm dần (môi trường chua hoá)
I. Yếu tố hóa học
Ánh sáng
Đòi hỏi đối với nguồn sáng
Phát sinh cơ quan, hình thành cây
Cường độ
2800 - 3000 lux
Chu kỳ
chiếu sáng 16/24;
hoặc 18/24
Chất lượng
quang phổ: dải tần
230-780 nm
Bóng tối đối với
một số trường hợp
như tạo củ, tạo
callus
I. Yếu tố vật lý
Vai trò của ánh sáng
Kớch thớch
t?o di?p l?c
Cung cấp chất
dinh dưỡng cho cây
Ảnh hưởng đến
phát sinh hình thái
Khi tạo callus, tạo củ,
lưu giữ quỹ gen- cần cường độ
ánh sáng thấp
I. Yếu tố vật lý
Có cường độ chiếu sáng tương đối đồng đều cho một mục đích sử dụng.

Dùng ánh sáng lạnh để chống tăng nhiệt độ – thông dụng là đèn huỳnh quang.

- Sử dụng thiết bị tắt mở tự động để tắt bật ánh sáng theo chu kỳ định trước, thường là 16 giờ chiếu sáng/8 giờ tối.
Phương pháp bố trí ánh sáng trong
phòng thí nghiệm
I. Yếu tố vật lý
73
Vai trò của nhiệt độ: Duy trì sự phát triển bình thường của thực vật. Tuỳ theo mục đích người ta sử dụng các chế độ nhiệt độ khác nhau để sự sinh trưởng và phát triển của thực vật được tối ưu
Nhiệt độ
Nhiệt độ tối ưu thường dùng
22 – 25oC
Lưu giữ quỹ gen dùng
nhiệt độ thấp từ 4-20oC
Khi chuẩn bị cho
cây ra ngoài có thể tăng
dần nhiệt độ
I. Yếu tố vật lý
Phương pháp duy trì nhiệt độ phòng nuôi
Ở Xứ lạnh – chủ yếu phải
tăng nhiệt độ bằng sưởi,
Ở Việt Nam – phải giảm
nhiệt độ bằng điều hoà
Ưu điểm: diện tích sử dụng lớn, giá thành rẻ. Thường dùng cho các mục đích chung, sản xuất đại trà.
I. Yếu tố vật lý
75
Ưu điểm: Gọn nhẹ, có thể điều chỉnh các chế độ đặc biệt bổ sung cho buồng nuôi.
Nhược điểm: Giá thành cao
Phương pháp duy trì nhiệt độ sử dụng tủ nuôi
I. Yếu tố vật lý
Được duy trì nhờ bình nuôi. Thường là độ ẩm bão hoà
Độ ẩm
Trước khi đưa ra ngoài, giảm dần độ ẩm bằng cách:
Thay nút bằng nút giấy. Nút giấy cho phép độ ẩm thoát ra ngoài nhưng vẫn chống được nhiễm trong thời gian ngắn.
Mở hẳn nút 2-3 ngày trước khi đưa cây ra ngoài để độ ẩm gần với độ ẩm tự nhiên.
I. Yếu tố vật lý
Độ ẩm khoảng 70%
I. Yếu tố vật lý
Sự thoáng khí
Cây trong bình cấy cần một lượng oxygen để hô hấp.
Môi trường lỏng: Lắc hoặc quay cung câp oxygen. Nuôi cấy tế bào rời (100 – 150 vòng / phút). Nuôi cây chồi (1 vòng/phút).
Môi trường đặc: đặt sát mặt môi trường hoặc cắm vào thạch 1/3 mẫu vật.
Vấn đề 5: PHA DUNG DỊCH MẪU – PHA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Pha dung dịch mẫu
Pha môi trường nuôi cấy
I. Pha dung dịch mẫu (Pha dung dịch mẹ)
Dung dịch mẫu là dung dịch pha sẵn và bảo quản trong tủ lạnh.
Có nồng độ cao gấp 10 – 100 lần.
Thuận tiện khi pha môi trường.
Đảm bảo độ chính xác các thành phần hóa chất đủ với nồng độ thấp.
Tại sao phải pha dung dịch mẫu?
I. Pha dung dịch mẫu (Pha dung dịch mẹ)
Pha dung dịch mẫu của
MÔI TRƯỜNG
MURASHIGE & SKOOG (1962)
(MS)
Skoog IA, Skoog IB: Dung dịch chứa muối khoáng đa lượng
Skoog II, Skoog III: Dung dịch chứa muối khoáng vi lượng
CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG
Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là môi truờng White, Knop và Knudson C, Blaydes…
Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: điển hình là môi trường B5 của Gamborg …
Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình là môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962)…
Khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, nên thăm dò so sánh 3 loại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu phù hợp với loại môi trường nào nhất, sau đó điều chỉnh các thành phần dinh dưỡng.
II. Pha môi trường nuôi cấy
II. Pha môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường cấy đã được các nhà khoa học nghiên cứu.
Tùy đối tượng nghiên cứu có một môi trường nuôi cấy thích hợp
Môi trường nuôi cấy tùy thuộc vào:
Đối tượng nuôi cấy
Giai đoạn nuôi cấy
Mục đích nuôi cấy
Cân hóa chất chính xác.
Mỗi loại hóa chất phải dùng muỗng mút riêng.
Cho nước cất vào bình → Cho hóa chất vào tuần tự và khuấy đều → Thêm nước cất cho đủ thể tích.
pH chính xác (hiệu chỉnh bằng HCl 1N hoặc NaOH 1N)
Bổ sung agar → Đun → Cho vào erlen, ống nghiệm…
Hấp khử trùng
II. Pha môi trường nuôi cấy
CÁCH TIẾN HÀNH
Vấn đề 6: CHẤT ĐIỀU HÒA TĂNG TRƯỞNG THỰC VẬT
(GROWTH REGULATOR)
Vai trò của chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng
I. Vai trò của chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Bên cạnh các chất dinh dưỡng cần cho mô nuôi cấy, việc bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vật cũng cần thiết để:
Kích thích sự tăng trưởng, phát triển mẫu cấy.
Phân hóa cơ quan.
Cung cấp sức sống cho mô và các tổ chức.
Yêu cầu đối với chất điều hòa tăng trưởng thực vật tùy từng loại thực vật, loại mô và sự hiện diện chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh ở từng giai đoạn phát triển của mẫu cấy.
II. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng
Auxin
Cytokinin
Giberellin
Ethylen
Acid abscisic (ABA)
1. Auxin
Auxin được sản xuất ở đỉnh sinh trưởng chồi (chủ yếu), đỉnh sinh trưởng rễ…
Nồng độ thường dùng: 0,01 – 5mg/l
Auxin được sản xuất ở chồi ngọn → Di chuyển xuống chồi bên → Kích thích kéo dài thân → “Ưu thế ngọn”
Các dạng auxin:
Auxin tự nhiên: AIA (Acid Indol Acetic)
Auxin tổng hợp: AIB (Acid Indol Butyric); ANA (Acid α-Naphtyl Acetic); 2,4-D
II. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng
Phân chia tế bào
Tế bào phân chia chiều dọc
Ức chế tạo chồi bên
Liên quan đế sự phân hóa mô dẫn, tạo phôi soma
Nồng độ thấp: Kéo dài lóng thân, rễ, kích thích chồi bất định
1. Auxin
II. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng
Tác dụng của Auxin
Nồng độ cao:
Kích thích sự tạo sẹo tại vùng bị tổn thương
Nhân nhanh sinh khối mô sẹo
Kích thích sự tạo rễ bất định nhưng ức chế sự kéo dài rễ
Ức chế sự kéo dài lóng thân
1. Auxin
II. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng
Tác dụng của Auxin
Được tổng hợp từ rễ, di chuyển lên ngọn và tích tụ ở ngọn→ Trên đường di chuyển, nó phá vỡ “Ưu thế ngọn” và kích thích sự tạo chồi bên
Nồng độ sử dụng: 0,1 – 10 mg/l
Các dạng cytokinin:
Trong tự nhiên: Zeatin
Tổng hợp: BAP (BA – Benzyl Aminopurine), Kinetine, Adenine, TDZ (vừa có tính chất của auxin, vừa có tính chất của cytokinin)
2. Cytokinin
II. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng
Kích thích mau sự phân chia tế bào
Tế bào tăng trưởng theo đường kính
Ức chế sự tạo rễ
Phá ưu thế ngọn, kích thích tạo chồi bên → Ứng dụng nhân cụm chồi
2. Cytokinin
II. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng
Tác dụng của Cytokinin
Nồng độ thấp: Cảm ứng sẹo, tái sinh chồi
Nồng độ cao:
Tạo chồi bất định
Ức chế sự tổng hợp diệp lục tố
2. Cytokinin
II. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng
Tác dụng của Cytokinin
Tương tác giữa các nhóm Cytokinin và Auxin
Trong cơ thể thực vật các auxin và cytokinin không bao giờ tác dụng riêng rẽ mà luôn luôn tác dụng phối hợp.
Tác dụng phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát sinh, phát triển của tế bào.
Tỷ lệ A/C > 1 → Hình thành rễ
Tỷ lệ A/C < 1 → Phân hoá chồi
Tỷ lệ A/C = 1 → Mô sẹo.
Trao đổi chất của auxin ảnh hưởng đến trao đổi chất cytokinin và ngược lại
Vấn đề 7: LỰA CHỌN MẪU CẤY VÀ CÁC PHẢN ỨNG CỦA MẪU CẤY
Quy trình nuôi cấy mô thực vật
Yêu cầu của mẫu cấy
Khử trùng mẫu cấy
Cấy mẫu
Phản ứng của mẫu cấy
I. Quy trình nuôi cấy mô thực vật
I. Quy trình nuôi cấy mô thực vật
Gồm 4 bước chính:
Trích mẫu cấy vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo để mẫu cấy sống.
Kích thích mẫu cấy phát triển tạo mô sẹo hay tạo chồi.
Kích thích chồi tạo rễ.
Trồng cây con ra chậu
I. Quy trình nuôi cấy mô thực vật
Cây khỏe mạnh, phát triển tốt, không sâu bệnh.
Lấy các bộ phận non.
Mẫu được chọn có thể là: đốt thân, lá non, trái, cọng phát hoa, đỉnh sinh trưởng…
Kích thước không quá nhỏ, không quá lớn
II. Yêu cầu của mẫu cấy
II. Yêu cầu của mẫu cấy
III. Khử trùng mẫu
Loại bỏ những phần không cần thiết, mẫu càng nhỏ càng ít nhiễm
Rửa sạch dưới vòi nước
Rửa bằng xà phòng/savon
Rửa lại bằng nước cất
Lắc nhẹ qua Alcol 70o
Ngâm mẫu vào Hypo-Ca hoặc Javel (nồng độ, thời gian tùy mẫu cấy).
Rửa sạch Hypo-Ca hoặc Javel bằng nước cất
Loại bỏ phần mô bị chết
IV. Cấy mẫu
V. Phản ứng của mẫu cấy
Mỗi mẫu cấy có phản ứng khác nhau tùy thuộc:
Loại mô: Mô có tổ chức, mô không có tổ chức
Thành phần môi trường nuôi cấy
1. Mẫu cấy có tổ chức
Chồi ngọn, chồi bên (chồi ngủ, chồi bất định), đỉnh sinh trưởng
Có sự phát triển chồi, cụm chồi
Cây hoàn chỉnh
Tạo thể chồi (Protocrom)
Tạo phôi vô tính (phôi soma)
V. Phản ứng của mẫu cấy
Giúp mẫu cấy sống và tăng trưởng chồi → Kích thích chồi tạo rễ cây con → Cần auxin và gibberelin.
Nhân nhanh cụm chồi → Tách rồi các chồi → Cấy sang môi trường tăng trưởng → Tạo rễ
→ Cần 3 loại môi trường: Môi trường nhân chồi (cytokinin: số chồi tỉ lệ thuận với nồng độ cytokintin và tỉ lệ nghịch với chiều cao chồi), tăng trưởng (auxin, gibberelin), tạo rễ (auxin hoặc môi trường căn bản).
1. Mẫu cấy có tổ chức
V. Phản ứng của mẫu cấy
Mục đích
1. Mẫu cấy có tổ chức
V. Phản ứng của mẫu cấy
Cấy đỉnh sinh trưởng (Đỉnh sinh trưởng gồm vùng tận ngọn là sinh mô chờ đợi, vùng phân mô này phân cắt khi cấy bắt đầu trổ hoa) Mảnh cấy tốt nhất có hai phác thể lá.
Cấy đỉnh chồi: Cắt ngang phần ngọn thân, cấy vào môi trường → Giâm cành vi mô
Cấy mầm bên (mầm ngủ): Tạo một chồi hoặc cụm chồi không đều nhau
1. Mẫu cấy có tổ chức
V. Phản ứng của mẫu cấy
Dễ khử trùng
Môi trường cấy đơn giản và dễ thành công
Các cây con thường giữ đặc tính di truyền của cây mẹ
Lóng, lá, rễ, biêu bì, lá đài, cánh hoa, nhị đực…
Có thể phát triển chồi, cụm chồi trực tiếp
Qua trung gian: Tạo mô sẹo
Mô sẹo đặc: Tiếp tục tái sinh chồi, thể chồi, rễ…
Mô sẽo xốp: Sẽ bị thoái hóa dần (hóa nâu) rồi chết
Đặc biệt, hiện nay, nuôi cấy rễ được phát triển mạnh nhằm mục đích nhân sinh khối rễ, sau đó li trích thu nhận các hợp chất tinh dầu có giá trị
2. Mẫu cấy không có tổ chức
III. Phản ứng của mẫu cấy
2. Mẫu cấy không có tổ chức
III. Phản ứng của mẫu cấy
Mẫu cấy không có tổ chức
Tạo chồi, phôi sinh dưỡng và tiền củ trực tiếp trên mẫu cấy
Tạo chồi, phôi sinh dưỡng và tiền củ qua trung gian mô sẹo
Tạo chồi: Các tế bào ngoài mẫu cấy (tế bào biểu bì, tế bào nhu mô…) → Phản phân hóa → Phân cắt tạo khối sinh mô → Phân hóa chồi → Chồi bất định
2. Mẫu cấy không có tổ chức
a) Tạo chồi, phôi sinh dưỡng và tiền củ trực tiếp trên mẫu cấy
III. Phản ứng của mẫu cấy
Tạo phôi sinh dưỡng
2. Mẫu cấy không có tổ chức
a) Tạo chồi, phôi sinh dưỡng và tiền củ trực tiếp trên mẫu cấy
III. Phản ứng của mẫu cấy
Tạo phôi sinh dưỡng
Phôi sinh dưỡng là một khối tế bào giống sinh mô được bao bọc bởi một biểu bì riêng biệt không liên quan đến mảnh cấy hoặc mô sẹo, độc lập về mô học và sinh lý.
Phôi sinh dưỡng tạo ra từ tế bào dinh dưỡng có cơ cấu và hình thái giống phôi sinh dục.
Phôi sinh dưỡng có cơ cấu lưỡng cực (một đầu là sinh mô ngọn, đầu kia là sinh mô rễ) và hai cực tăng rtưởng đồng thời.
Sự thành lập phôi sinh dưỡng trải qua 3 giai đoạn liên tiếp: hình cầu → hình tim → hình thoi.
Tạo phôi sinh dưỡng
Tạo phôi sinh dưỡng
Cách thành lập phôi sinh dưỡng
A, B: Sư thành lập phôi sinh dưỡng trực tiếp từ mẫu cấy
C,D: Sự thành lập phôi sinh dưỡng gián tiếp từ mặt ngoài của mô sẹo
Tạo tiền củ (Protocroms)
Tạo tiền củ (Protocroms)
Tiền củ là một khối sinh mô hình cầu có lớp tế bào bao bọc, một tiền củ có thể nảy chồi tạo thành cụm tiền củ.
Một tiền củ → Cắt thành nhiều mảnh → Cấy chuyền → Mỗi mảnh tạo một tiền củ mới có nhiều đỉnh sinh trưởng trên bề mặt tiền củ
Có thể tạo trực tiếp trên mô cấy hoặc gián tiếp trên mô sẹo.
Tạo tiền củ (Protocroms)
Nơi vết cắt của mẫu cấy sẽ tạo sẹo khi hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nôi sinh cao.
Mô sẹo là khối tế bào không định hình gồm các tế bào gần giống nhau liên kết một cách lỏng lẻo mềm, bở rời, dễ tách và chưa biệt hóa, có cơ cấu không hoàn toàn đồng nhất, trên mặt ngoài hoặc trong có những khối sơ khởi.
Khối sơ khởi gồm các tế bào sinh mô kích thước nhỏ hơn tế bào mô sẹo → Sinh mô sơ lập → Tạo chồi, rễ.
Trong mô sẹo: Nhiều tế bào sinh mô xếp thành tượng tầng → Sinh mô hậu lập → Tạo mô libe – mộc.
2. Mẫu cấy không có tổ chức
a) Tạo chồi, phôi sinh dưỡng và tiền củ qua trung gian mô sẹo
III. Phản ứng của mẫu cấy
2. Mẫu cấy không có tổ chức
a) Tạo chồi, phôi sinh dưỡng và tiền củ qua trung gian mô sẹo
III. Phản ứng của mẫu cấy
2. Mẫu cấy không có tổ chức
a) Tạo chồi, phôi sinh dưỡng và tiền củ qua trung gian mô sẹo
III. Phản ứng của mẫu cấy
Mô sẹo nuôi cấy càng lâu hoặc cấy chuyền nhiều lần thì tế bào mô sẹo có khả năng biến dị do:
Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Mô sẹo phải tăng sinh → Vài tế bào lệch lạc phân cắt, nhất là ở giai đoạn anaphase → Tạo lệch bội, đa bội → Không giữ nguyên giống ban đầu
2. Mẫu cấy không có tổ chức
a) Tạo chồi, phôi sinh dưỡng và tiền củ qua trung gian mô sẹo
III. Phản ứng của mẫu cấy
Tỉ số biến dị tăng theo tần số cấy chuyền và tuổi của mô sẹo
Hai mục đích lưu ý khi nuôi cấy mô
Phải sử dụng mẫu cấy có tổ chức
Cấy trong môi trường thích hợp để tránh giai đoạn trung gian của mô sẹo
Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng trong mô cấy không quá cao
Không nên cấy chuền nhiều lần
1. Tạo cây con hoàn toàn giống cây mẹ
Đưa nhanh các loài cây hiếm, có giá trị ra thị trường
Cứu vãn các loài co nguy cơ tuyệt chủng
Lập ngân hàng giống
Sử dụng mẫu cấy nhỏ không có tổ chức (đã phân hóa) Phân cắt tạo mô sẹo hay phôi sinh dưỡng
Ưu điểm:
Nhân số lượng cây nhiều hơn
Tỉ lệ biến dị nhiều → Tạo nhiều cây con không giống nhau → Tạo được giống mới
Hai mục đích lưu ý khi nuôi cấy mô
2. Tạo cây con không giống cây mẹ
Vấn đề 8: CẤY CHUYỀN
Lý do cấy chuyền
Phương pháp
I. Lý do cấy chuyền
Sau một thời gian cấy dài ngày:
Mẫu cấy tăng kích thước chồi, tăng sinh khối (sẹo) → Chiếm ưu thế thể tích bình nuôi cấy.
Sự thoát hơi nước → Môi trường khô → Tăng nồng độ muối môi trường.
Thiếu Oxygen cho mô.
Giảm pH môi trường.
Sự biến dưỡng của mô bị biến đổi → Thành lập các chất độc → Ức chế sự tăng trưởng và phân chia tế bào.
II. Phương pháp
6 – 8 tuần cấy chuyền 1 lần.
Với mục đích giữ giống: Không được cấy chuyền nhiều lần trong thời gian dài (vì số lần cấy chuyền tỉ lệ thuận với sự biến dị).
Tạo mô sẹo, có sự thay đổi bộ NST tạo cây đột biến.
Mẫu cấy có biểu hiện không mong muốn phải lập tức cấy sang môi trường khác.
Vấn đề 9: CÁC CHẤT ỨC CHẾ, SỰ NHIỄM TRÙNG VÀ PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ
Sư hóa nâu, hóa đen
Sự hóa thủy tinh thể
Sự nhiễm trùng
I. Sự hóa nâu, hóa đen
Nguyên nhân: Do vài loại mô tiết vào môi trường các chất tự ức chế sự biến dưỡng của tế bào như phenol… → Ngoài ánh sáng, oxid hóa → Nâu, đen
Chất chống oxid hóa như PVP, acid scorbic, acid citric, cystein…
Giảm muối khoáng môi trường
Cấy chuyền liên tục đến khi môi trường không còn nâu
Cho than hoạt tính vào môi trường để hấp thu các chất độc…
I. Sự hóa nâu, hóa đen
Biện pháp xử lý
II. Sự hóa thủy tinh thể
Hiện tượng: Mẫu cấy mọng nước, trong suốt, mềm
Nguyên nhân:
Môi trường: Hàm lượng cytokinin quá cao → Ức chế sự tổng hợp lignin và cellulose → Vách tế bào mềm.
Môi trường lỏng hoặc nồng độ agar thấp, độ ẩm cao và NO3-/NH4+ thấp
Nội tại: Sự sản xuất ra ethylen trong nuôi cấy → Giảm sự phân hóa mô mộc và tổng hợp cellulose
Tăng nồng độ agar Giữ nước
Giảm cytokinin hoặc cho thêm than hoạt tính → Hấp thu cytokinin
Thay đổi thành phần muối vô cơ trong môi trường
II. Sự hóa thủy tinh thể
Biện pháp xử lý
III. Sự nhiễm trùng
Nguyên nhân:
Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối.
Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử vi khuẩn.
Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên môi trường.
Chọn mẫu cấy khỏe mạnh, phát triển tốt, không sâu bệnh
Thao tác khử trùng mẫu
Hệ thống lọc khí của tủ cấy
Người cấy
Môi trường cấy
Dụng cụ cấy
III. Sự nhiễm trùng
Biện pháp xử lý
Thank You !