Làm tiêu bản đúc cắt

SINH HỌC PHÁT TRIỂN
-------------------------------







SỰ TẠO NOÃN
VÀ TẠO TINH
Ở CHUỘT



Giáo viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Lai Thành
CN. Đặng Văn Đức
Sinh viên thực hiện: Nhóm chủ đề 1 – 2
Lớp K51B Công nghệ Sinh học

Nội dung
I. Mục đích và đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Chuột bạch với các đặc điểm:
Sinh sản nhanh, số lượng sản phẩm sinh dục nhiều
Dễ nuôi trong phòng thí nghiệm , dễ thao tác.
Là một đối tượng
nghiên cứu lớn
đặc trưng cho
động vật có vú
trong sinh học



Mục đích và đối tượng nghiên cứu
Mục đích:
Nắm được các bước làm tiêu bản đúc-cắt
Quan sát cấu tạo nang trứng, tinh hoàn và ống sinh tinh
Phân biệt được các loại tế bào ở nang trứng, tinh hoàn
Nắm được sự tạo noãn, tạo tinh ở chuột nói riêng và động vật có vú nói chung



II. Cơ sở lý thuyết
1. Sự tạo tinh
1. Sự tạo tinh
Cấu tạo tinh hoàn:
Chia thành nhiều tiểu thùy,
chứa các ống sinh tinh
Giữa các ống sinh tinh là nhu
mô của tinh hoàn


Cấu tạo ống sinh tinh
Bao bọc bởi màng đáy
Thành ống là biểu mô sinh tinh, có 2 loại tế bào:


Tế bào thể là tế bào Sertoli
Các tế bào sinh dục

Các dòng tế bào tạo tinh


Các dòng tế bào tạo tinh
Sự tạo tinh là quá trình tạo tinh trùng từ tế bào sinh dục nguyên thuỷ

Tế bào sinh dục nguyên thuỷ được bao quanh bởi tế bào Sertoli

Tế bào sinh dục nguyên thuỷ sẽ phân chia và chuyển thành dạng tinh nguyên bào A1

Tinh nguyên bào A1 phân chia tạo thành tinh nguyên bào A2, rồi A3, A4



Các dòng tế bào tạo tinh
Tinh nguyên bào trung gian phân chia thành tinh nguyên
bào B
Mỗi tinh bào I sẽ tạo ra 2 tinh bào II, tinh bào II giảm phân lần
2 cho ra 4 tế bào con đơn bội hoàn toàn gọi là tinh tử
Tinh tử biệt hoá thành tinh trùng.


2. Sự tạo trứng
Cấu tạo 2 buồng trứng: gồm phần tuỷ và phần vỏ

Tế bào trứng (noãn bào)
Tế bào trứng là một tế bào toàn năng, đồng thời có tính chuyên hóa cực cao với một chức năng duy nhất là cho cơ thể mới.
Noãn hoàng: các chất dự trữ trong trứng
Trứng chuột và động vật có vú thuộc loại vô noãn hoàng
Lớp tế bào chất dưới vỏ: chứa các phân tử actin dạng cầu và nhiều hạt vỏ
Các màng trứng
Màng trứng thứ nhất: màng noãn hoàng
Màng trứng thứ hai: tạo bởi các tế bào nuôi, các nang bào
Màng trứng thứ ba: sản phẩm tiết của đường dẫn trứng
Ở động vật có vú còn có vành phóng xạ bao quanh trứng

Các loại nang trứng
Các loại nang trứng
Nang trứng nguyên thủy:
Được tạo ra trong buồng trứng của thai
Một noãn bào ở giữa, xung quanh có một lớp tế bào nang dẹt có nguồn gốc từ trung bì trung gian.

Nằm xen kẽ trong mô kẽ buồng trứng, gần biểu mô mầm, noãn bào trong nang có đường kính nhỏ

Các loại nang trứng

Nang trứng phát triển:
Nang trứng đặc:
Nang bậc 1:tế bào nang hình hộp hoặc hình trụ, xuất hiện lớp màng sáng
Nang bậc 2: nang bào phát triển thành 2, rồi nhiều lớp; màng sáng dày và rõ, vỏ nang hình thành 2 lớp: tế bào đa giác bên trong và tế bào dạng sợi bên ngoài


Nang trứng chín (bao Graaf): kích thước rất lớn, là xoang chứa dịch với rất nhiều enzym, AMP vòng, hormone và các phân tử khác; có vành phóng xạ, nhân noãn bào rất lớn (bóng phôi)

Các loại nang trứng
Nang trứng có hốc: xuất hiện xoang chứa dịch khi có 5-7 lớp nang bào, kích thước nang lớn, vỏ nang khá dày

III. Quy trình thí nghiệm
25/04: Quan sát tiêu bản
22/04: Cắt mẫu và gắn lên lam
18/04: Đúc parafin
17/04: Tẩm parafin
16/04: Loại nước, làm trong mẫu
14/04: Cố định mẫu và rửa nước
23/04: Nhuộm tiêu bản và gắn lamen
Ngày thứ nhất (14/04): Cố định mẫu và rửa nước
Ngày thứ ba (16/04): loại nước và làm trong mẫu
Loại nước: chuyển qua cồn nồng độ từ thấp đến cao
Làm trong mẫu: đưa xylen vào để loại cồn
Ngày thứ tư (17/04/2008): Tẩm parafin
Chuyển mẫu vào parafin, parafin đúc
Bảo quản mẫu trong tủ ấm ở 58-60 độ C

Ngày thứ năm (18/04): Đúc parafin
Khuôn đúc là đĩa petri có tráng glyceryl
Parafin đúc chuẩn bị như hôm trước, đun nóng chảy

Ngày thứ năm (18/04): Đúc parafin
Dùng panh hơ nóng chỉnh mẫu để lát cắt là thẳng đứng
Nhúng mẫu vào nước lạnh để parafin biệt hoá đồng đều
Ngày thứ chín(22/04/2008):
Cắt mẫu và gắn lên lam
Ấn định 21/04 cắt mẫu nhưng phải lùi lại vì mẫu bị hỏng
Ngày thứ chín(22/04/2008):
Cắt mẫu và gắn lên lam
Cắt mẫu thành hình khối, gắn lên đế dao






Chỉnh độ dày 40 μm, cắt bỏ
phần parafin bao bọc đầu mẫu
Ngày thứ chín(22/04/2008):
Cắt mẫu và gắn lên lam
Điều chỉnh độ dày lát cắt 7 μm, cắt mẫu thành băng dài
Gỡ băng cắt, đưa vào bát nước, đun nhẹ để dãn phẳng
Ngày thứ chín(22/04/2008):
Cắt mẫu và gắn lên lam
Chuẩn bị albumin: lòng trắng trứng đánh kĩ, hớt bỏ bọt, trộn glyceryl (1:1),lọc, thêm một vài tinh thể thymol
Bôi albumin lên lam kính để cố định tiêu bản vào lam
Dùng lam vớt lát cắt trong bát nước, điều chỉnh cân đối
Bảo quản tiêu bản trong tủ ấm ở 37 độ C
Ngày thứ mười (23/04):
Nhuộm tiêu bản và gắn lamen
Loại parafin: chuyển mẫu qua xylen (2 lần x 45’), cồn-xylen, cồn nồng độ thấp dần (3-5’), rửa bằng nước
Dùng phương pháp nhuộm kép Hematoxylin và Eosin: nhuộm Hematoxylin 15-20’, rửa nước, cho qua dung dịch biệt hoá 1-2”, rửa nước rồi nhuộm tiếp eosin 1x

Ngày thứ mười (23/04):
Nhuộm tiêu bản và gắn lamen
Loại nước, làm trong tiêu bản: chuyển nhanh tiêu bản qua cồn nồng độ cao dần, cồn-xylen, xilen 1, xylen 2 (1-2’)
Ngâm tiêu bản trong xylen 2 cho tới khi gắn lamen

Ngày thứ mười (23/04):
Nhuộm tiêu bản và gắn lamen
Dùng bôm Canada để kết dính lamen vào tiêu bản
Gắn lamen, đẩy bọt khí (nếu có) ra bằng xylen
Dán nhãn, đặt trong tủ ấm 37 độ C trong 2-3 ngày
Ngày thứ mười hai (25/04): Quan sát tiêu bản
Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở độ phóng đại lớn
IV. Kết quả và thảo luận
Mỗi nhóm đã làm được 12 tiêu bản lát cắt tinh hoàn / buồng trứng chuột để quan sát
1. Tiêu bản lát cắt tinh hoàn
Các ống sinh tinh
Tiêu bản lát cắt tinh hoàn
Cấu tạo ống sinh tinh
Tiêu bản lát cắt tinh hoàn
Các dòng tế bào tạo tinh
Tiêu bản lát cắt tinh hoàn
Tiêu bản lát cắt tinh hoàn
Tiêu bản lát cắt tinh hoàn
Tiêu bản lát cắt buồng trứng
Phần vỏ
Nang trứng
Phần tủy
Buồng trứng với các nang trứng trong phần vỏ và phần tuỷ
Nang trứng nguyên thủy, nang đặc bậc hai và nang có hốc
Nang trứng có hốc
Nang trứng đặc bậc hai
Xoang chứa dịch
Tiêu bản lát cắt buồng trứng
Nang trứng đặc bậc một và nang trứng có hốc
Tiêu bản lát cắt buồng trứng
Nang trứng bậc hai
Nang trứng bậc một
Nang trứng có hốc
Nang trứng bậc một
Nang trứng đặc bậc hai
Tiêu bản lát cắt buồng trứng
Màng sáng
Nang bào
Nhân trứng
Noãn bào
Màng sáng
Nang bào
Nhân trứng
Noãn bào
Nang trứng có hốc
Tiêu bản lát cắt buồng trứng
Nang trứng có hốc
Xoang chứa dịch
IV. Kết luận
Đã nắm được quy trình làm tiêu bản đúc cắt
Hiểu được cấu tạo các loại nang trứng trong buồng trứng, các dòng tế bào tạo tinh ở tinh hoàn chuột và phân biệt chúng,
Hiểu thêm quá trình tạo noãn, tạo tinh ở chuột nói riêng và động vật có vú nói chung.
Đây là những quá trình đặc biệt thú vị và đóng vai trò vô cùng quan trọng đối với sinh vật, phục vụ cho mục đích cuối cùng của sinh vật: bảo tồn và duy trì nòi giống.