Kỹ thuật điện di

Chương 2- Điện di
2.1 Nguyên tắc của phương pháp

dựa trên chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịch khi được đưa vào điện trường (H. 1).

Vì các phân tử trong điện trường chuyển động với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào:
điện tích,
hình d?ng,
kích thước,
phương pháp đã được phát triển mạnh để tách chúng.

Phương pháp khá đơn giản và nhanh, được sử dụng để phân tích và tách:
các phân tử rất lớn như protein và axit nucleic,
các phân tử tích điện khác nhỏ hơn như đường, axit amin, peptide, nucleotide, các ion đơn giản.

Các phương pháp phát hiện có độ nhạy cao đã được phát triển để ghi và phân tích các kết quả tách.
Cách tiến hành:

Đưa một lớp mẫu mỏng vào dung dịch được ổn định bằng một chất giá có cấu tạo nhiều khe hở (mạng lưới).

Dưới tác dụng của hiệu điện thế, các phân tử khác nhau trong mẫu sẽ di chuyển qua chất giá với vận tốc khác nhau.

Chất giá này là cần thiết vì dòng điện khi đi qua dung dịch điện di sẽ tạo nhiệt (là nhân tố gây ra sự khuếch tán) và trộn lẫn các băng khi thiếu môi trường tạo cân bằng.
Chất giá có thể được cấu tạo từ một số vật liệu khác nhau:

giấy,
acetate cellulose,
polyacrylamide,
agarose,
tinh bột.

Trong các gel polyacrylamide và agarose, chất giá còn có tác dụng sàng lọc (rây) lựa chọn theo kích thước để tách.

Các phân tử sau khi tách có thể được phát hiện dưới dạng các băng (vệt) ở các vị trí khác nhau trong chất giá bằng cách:

nhuộm
sử dụng phương pháp phóng xạ tự ghi,
được định lượng bằng cách quét (scan) trên mật độ kế,
gel được làmg khô để bảo quản lâu dài.
Gel polyacryamide và agarose (hình 1.2) là môi trường tạo ổn định hay sử dụng nhất trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu.

Gel thường được tạo thành ở dạng:
thỏi (trong ống),
bản
lá mỏng

để tách protein: gel polyacrylamide là chất giá thông thường nhất,
để tách axit nucleic: có thể dùng một trong hai loại gel kể trên tuỳ thuộc vào kích thước của các phân tử cần tách.

Việc lựa chọn chất giá và nồng độ (gel) ảnh hưởng lên sự tách dựa trên kích thước.
Trong phần lớn các máy điện di, gel được đặt giữa hai buồng chứa đệm để dòng điện được nối qua gel giữa chúng.

Mối tiếp xúc giữa đệm và gel có thể là tiếp xúc lỏng trực tiếp (H. 1.3 A, B, C) hoặc qua một băng giấy hoặc gel. (H. 1.3 D).


Gel ống đứng hoặc bản (H1.3 A, B) (có tiếp xúc đệm trực tiếp) là hiệu quả nhất về sử dụng điện trường.
Gel có thể có kích cỡ khác nhau, tuỳ thuộc vào mức độ cần tách và lượng mẫu.

Các gel ống phân tích thường được đổ trong các ống thủy tinh với đường kính trong 1- 5 mm và chiều dài 5- 25 cm.

Các gel ống chế phẩm có thể đến đường kính 10 cm để phù hợp với lượng lớn nguyên liệu.

Ngược lại, các gel trong ống mao dẫn (có đường kính 50- 100 ?m và dài 30- 100 mm) cho phép:

có độ phân giải rất cao
tách nhanh
cần một lượng mẫu rất nhỏ
Gel bản thường được đổ giữa một cặp bản kính.

Buồng đệm được tạo nên bằng cách tách hai bản kính giữa hai thanh spacer (tạo bề dày) ở hai đầu, sau đó trám các đầu và đáy gel để tạo buồng kín (H. 1.4).

Gel bản có kích thước từ 2,5 cm2 (giữa hai lamen của kính hiển vi) đến 30. 150 cm2 và độ dày từ <0,05 mm đến > 10 mm.
Các thông số dòng điện

Lực dẫn cơ bản của điện di là hiệu điện thế của hệ thống.

Vận tốc của phân tử tỉ lệ thuận với gradient hiệu điện thế xung quanh.

Có 2 phương trình điện cơ bản quan trọng trong điện di.

Thứ nhất là định luật Ohm:

V = IR hoặc
I = V/R

Định luật Ohm liên kết:
hiệu điện thế (V) đo bằng vôn (V),
dòng điện (I) đo bằng ampe (A),
điện trở (R) đo bằng ohm (?).
Phương trình cơ bản thứ hai trong điện di liên quan đến power, nó miêu tả lượng nhiệt thoát ra trong mạng;

P = VI hoặc

P = I2R hoặc

P = V2/ R

với P là công suất (power- đo bằng watt (W).

Lượng nhiệt này còn được biết đến như nhiệt đo bằng Joule.

Trong mạch điện di, điện thế và dòng điện được nguồn điện DC cung cấp, dây chì, điện cực, đệm và gel là những resistor đơn giản.
Nguồn điện dùng cho điện di giữ một thông số (hoặc dòng, hiệu điện thế, hoặc công suất) cố định.

Tuy nhiên, điện trở của mạch không cố định trong quá trình chạy.

Điện trở đệm giảm cùng với sự tăng của nhiệt độ do nhiệt (Joule).

Điện trở cũng thay đổi khi vùng ion đệm ngắt quãng chuyển động qua gel , trong trường hợp của SDS- PAGE ngắt quãng, điện trở tăng khi chạy.

Phụ thuộc vào đệm và thông số nào được giữ nguyên, nhiệt Joule của gel có thể tăng hoặc giảm trong thời gian chạy (B. 1... ).
- Đệm và pH

Protein là các chất lưỡng tính, do vậy có thể tích điện âm hoặc dương, vì chúng có chứa cả hai loại gốc acid và base.

Axit nucleic không phải lưỡng tính và tích điện âm ở đa số đệm điện di (do bản chất axit mạnh của các nhóm phosphate của bộ khung).

Đa số điện tích protein có được là từ sự ion hoá (phụ thuộc pH) của các nhóm carboxyl và amino của mạch bên:

- COOH ? COO- + H+

- NH2 + H+ ? NH3+
His- một a.a kiềm yếu cũng có chứa điện tích gần pH trung tính.

Vì những nhóm này có thể chuẩn độ trên vùng pH điện di bình thường, điện tích thực (net) của 1 protein được xác định bằng pH của môi trường xung quanh, số và loại a.a mang nhóm carboxyl và amine.

Mỗi protein đều có pI riêng (như Hb của người là 7,07, ?-lactoglobin là 5, 34, casein bò là 4,7).

Trong một dung dịch có pH lớn hơn pI, protein có điện tích âm (thực) rõ rệt và sẽ di động về cực dương (anode) trong điện trường.
Còn nếu pH nhỏ hơn pI thì sẽ ngược lại.

Để tách protein bằng điện di dựa trên sự di động của các phân tử khác nhau, pH dung dịch cần được giữ ổn định để duy trì điện tích và từ đó là độ di động của protein.
Do vậy, vì sự điện ly nước tạo ra H+ ở anode và OH- ở catode, dung dịch điện di cần phải được đệm hoá.
- Tác động của nhiệt lên quá trình tách

Sự điều khiển nhiệt là then chốt trong mỗi bước của điện di.
Ví dụ, sự polymer hoá của acrylamide là 1 phản ứng toả nhiệt và nhiệt toả ra có thể gây ra sự đối lưu dẫn đến không đồng đều trong kích thước mạng lưới trong gel (đặc biệt đối với gel nồng độ cao).

Nhiệt độ cao có thể gây ra nhiều vấn đề:

nhiệt quá cao có thể khiến gel agarose bị tan (chảy) ra, bản kính bị vỡ, hoặc gây hư hại đến thiết bị điện di
các protein có thể bị biến tính và bất hoạt.
có thể khắc phục các hiện tượng trên bằng cách sử dụng các thiết bị làm lạnh.
- Chất giá

Gel agarose và polyacrylamide là những cấu trúc có liên kết ngang giống như bọt biển.

Mặc dù chúng chứa đến 99% nước, kích thước mạng lưới của chúng giống với kích thước của protein và axit nucleic.

Vì các phân tử bị hiệu điện thế buộc phải chuyển động qua gel, các phân tử lớn sẽ đi chậm hơn các phân tử nhỏ.

Đối với 1 gel nhất định, những phân tử nhỏ hơn kích thước do gel quy định sẽ không bị chậm lại và chuyển động gần giống như trong dung dịch tự do.

Ngược lại, những phân tử lớn hơn giới hạn quy định của gel sẽ không chui vào bên trong gel được.
Có thể tạo ra gel với kích thước mạng lưới (độ liên kết) để tạo thành rây phân tử bằng cách chọn nồng độ thích hợp của gel.

Kích thước mạng lưới của gel phụ thuộc vào phần trăm chất rắn trong gel, và đối với polyacrylamide là lượng liên kết ngang và tổng lượng polyacrylamide sử dụng.
- Gel agarose:

Agarose là dẫn xuất polysaccharide từ agar (thạch) có độ tinh khiết cao.

Có rất nhiều loại agarose, khác nhau về:
độ điện môi,
nhiệt độ nóng chảy,
độ cứng
độ trong.

Để sử dụng cho mục đích sinh học, quan trọng là EEO thấp và trong ở nồng độ cần dùng.
Agarose thường được cung cấp dưới dạng bột khô.

Khi cho vào đệm sôi, nó sẽ tan và giữ được trạng thái lỏng cho đến khi tạo gel ở nhiệt độ được hạ xuống khoảng 40oC.

Khi đã đông, gel sẽ ổn định ở nhiệt độ thấp hơn.
(Có những loại agarose đặc biệt có nhiệt độ nóng chảy và tạo gel thấp hơn đáng kể, cho phép thu lại mẫu từ gel sau khi tách và xử lý tiếp tục bằng enzyme nếu cần).

Kích thước mạng lưới và đặc tính sàng lọc phụ thuộc vào nồng độ agarose trong gel.

Nồng độ càng cao, mạng lưới càng nhỏ.

Thường nồng độ thích hợp cho sử dụng là từ 0,4% đến 4% (w/v).
- Đặc điểm của điện di trên gel agarose:

ứng dụng để để tách và phân tích AND

Lựa chọn hệ thống đệm, nồng độ gel, điều kiện chạy (dòng điện, thời gian, nhiệt độ...) thích hợp

Sử dụng EtBr và tia UV để phát hiện các băng ADN trên gel.
- Điện di trên gel polyacrylamid

Điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS- PAGE): tách protein dựa trên KLPT (MW).

Khi tách bằng SDS PAGE, sự di động được xác định không phải do điện tích của chuỗi polypeptide, mà do khối lượng phân tử (MW).

SDS (sodium dodecylsulfate) là một chất tẩy anion gây biến tính protein bằng cách bao quanh bộ khung polypeptide khiến phân tử duỗi thẳng.

Mỗi phân tử SDS sẽ cung cấp hai điện tích âm, các phân tử protein sẽ được tích điện tỉ lệ với khối lượng phân tử của chúng
SDS-PAGE
Trong điện di biến tính trên gel polyacrylamide (điện di có chất khử), độ di động của các phân tử được xác định không phải bằng điện tích của protein, mà bằng khối lượng phân tử của chúng.

SDS (sodium dodecylsulfate) là 1 chất khử anionic gây biến tính protein bằng cách bao quanh khung polypeptide và tích điện âm cho nó tỉ lệ với chiều dài của mạch.

Khi được xử lý bằng SDS và chất khử, các protein đều có dạng hình cầu tích điện âm với cùng số điện tích trên 1 đơn vị chiều dài.
Độ phân giải của SDS-PAGE là rất lớn: các phức hợp có thể được tách thành hàng trăm vệt (băng - band) trên gel.

Vị trí của băng dọc theo giếng cho biết giá trị gần đúng về kích thước và lượng protein trong mẫu (căn cứ vào độ bắt màu sau khi nhuộm ), dựa vào đó có thể đánh giá về:

độ sạch,
mức độ biểu hiện,
điện chuyển miễn dịch,
chuẩn bị phân tích trình tự,
tạo các kháng thể nhờ SDS-PAGE.
Có hai kiểu hệ thống đệm trong điện di: liên tục và ngắt quãng (discontinuous).

Hệ thống liên tục chỉ có 1 gel tách duy nhất và sử dụng cùng 1 loại đệm cho gel và để chạy điện di.


Trong điện di ngắt quãng (Ornstein và Davis, 1964), 1 lớp gel có mạng lưới lớn (loãng hơn) gọi gel cô được đổ lên trên lớp gel tách.

Mỗi lớp có 1 loại đệm riêng, và khác với đệm chạy.

Tuy hệ thống đầu (liên tục) dễ chuẩn bị hơn, ít bị tủa mẫu và bị ngưng tập khi chạy hơn, nhưng phương pháp sau lại cho độ phân giải cao hơn nhiều.
Trong điện di ngắt quãng, độ di động của 1 protein (số đo tốc độ của 1 phần tử tích điện trong điện trường) là trị số trung bình giữa:
độ di động của ion đệm trong gel cô (leading-ion dẫn, đi trước) và
độ di động của ion trong buồng điện di trên (trailing-ion- được kéo theo sau).

Khi điện di bắt đầu, các ion và protein bắt đầu di động vào gel cô.

Protein được cô đặc lại trong 1 vùng rất mỏng, giữa ion dẫn và ion được kéo theo, và tiếp tục di động trong gel cô cho đến khi đến được gel tách.

Ngược lại, chỉ có 1 độ cô đặc tối thiểu với hệ thống liên tục và các protein được tách thành 1 vùng cũng rộng gần bằng độ dày của mẫu lúc ban đầu trong giếng, dẫn đến độ tách của các băng rất kém.
Figure 4.7 Electrophoresis- The loading of samples
Figure 4.8 Electrophoresis
The protein bands after treating the gel with Coomassie blue stain.
Figure 4.9 Estimating the molecular weight of a protein.

The electrophoretic mobility of a protein on an SDS polyacrylamide gel is related to its molecular weight, Mr.
- Điện di phân vùng đẳng điện protein

Giới thiệu chung

-Điện di hai chiều (2D-PAGE)

Giới thiệu chung

ứng dụng của 2D-PAGE

Isoelectric focusing
is a procedure used to determine the isoelectric point (pI) of a protein (Figure ). A pH gradient is established by allowing a mixture of low molecular weight organic acid and bases (ampholytes) to distribute themselves in an electric field generated across the gel. When a protein mixture is applied, each protein migrates until it reaches the pH that matches its pI. Proteins with different isoelectric points are thus distributed differently throughout the gel (Tab ).


Two dimensional electrophoresis

The combination of these two different electrophoretic methods in two-dimentional gels permits the resolution of complex mixture of proteins (Fig ) and with more sensitivity. Two-dimentional electrophoresis separate proteins of identical molecular weight that difer in pI, or vice versa
Two dimensional electrophoresis

has several aims:
Proteins separated by electrophoresis are then identified by affinity- or immunoelectrophoresis according to Laurell (1966)…
Part of the fractions of a complex protein mixture are separated by one method and then further purified by a second method based on other separation principles in order to prevent the interference of irrelevant proteins.
Mixture of proteins are separated so that the physico-chemical parameters, such as pI and the molecular weight, can be read on the 2D electropherogram as on a coordinate system. Complex mixture of proteins such as cell lysare or tissue extract should be completely fractionated into indivudual proteins so as to obtain and overall picture of the protein composition and to enable location of indivudual proteins.
For these methods, the first-dimentional runs are carried out in gel rods or strips and loaded onto the second-dimentional gels. A flat-bed gel can also be cut into strips after the first separation and transferred onto the second gel. In most cases the first-dimentional gel must be equilibrated in the buffer for the second-dimentional run to recharge the protein, for example to unfold the secondary and tertiary structure and to form a micelle with SDS.

High resolution 2D electrophoresis (O`Farrell and Klose (1975)) (now a "classic" method), the first dimention is isoelectric focusing in presence of 8 or 9 M urea -close to the saturation limit- and a non-ionic detergent such as Triton X-100 or Nonidet NP-40. The second dimention is and SDS electrophoresis. The separation parameter of the first-dimentional run- the pI- is indipendent of the molecular weight which is the separation parameter of the second dimentional run
The result of the separate is a pattern of spots. According to to the Cartesian coordinate system, the following standard is accepted: from left to right- increasing pI, from bottom to top- increasing molecular weight. These two dimentional protein maps afford the highest resolution of all the methods at the moment. Autoradiography of labelled proteins and silver stainning are used most often.
The use of immobilized pH gradient (IPG-Dalt) for the first- dimentional run has increased the reproducibicity of the pattern and allows to detect the basic proteins. Even extremely wide immobilized pH gradients, e.g. pH 2.5 to 11, can be used, in order to separate nearly all possible cellular products in a single two-dimentional map.
Evaluation of 2D patterns is performed with a computer. The pherogram are therefore converted into digital signal with densitometer, high resolution desk top scanners or video cameras. With the appropriate evaluation software the data are processed for qualitative and quantitative analysis.
Figure 4. 10
Two-dimentional electrophoresis
Figure 4. 10 (con’t)
Two-dimentional electrophoresis
Antibody microarray
(„Protein Chip“)
Proteome analysis
Proteome analysis
2D Electrophoresis
Principle
Silver stained 2D gels
Proteome analysis
Protein annotation by mass spectroscopy
Kỹ thuật chuyển thấm protein (Western blot) và kết tủa miễn dịch

1. Nêu khái niệm chung và nguyên tắc của các phương pháp chuyển thấm (blot): Southern (cho AND), Northern (cho ARN), và Western (cho protein).

2. Các loại màng và thiết bị cần thiết

3. Chuyển protein từ gel SDS-PAGE sang màng

4. Hệ thống chuyển dùng bồn chứa

5. Hệ thống chuyển bán sấy

6. Các phương pháp phát hiện kháng thể

7. Phát hiện protein tổng số trên màng chuyển: giới thiệu các phương pháp phát hiện các chất trên màng thấm: lai bằng mẫu dò (với axit nucleic), kháng thể đặc hiệu (với protein), sử dụng đồng vị phóng xạ...