KT tách và tinh sạch protein

Tính tan của protein
Tính tan của protein chịu ảnh hưởng mạnh của pH và nồng độ muối trong dung dịch.

ảnh hưởng của pH

Protein tan ít nhất ở pI do tương
tác tĩnh điện của phân tử với
dung môi là thấp nhất


ảnh hưởng của nồng độ muối

Salting in là hiện tượng tăng độ
hoà tan khi tăng nồng độ muối;
Salting out là hiện tượng giảm độ
hoà tan khi tăng nồng độ muối;
Kết tủa bằng muối ammon là phương pháp
thông dụng dựa trên hiện tượng salting out.
Solubility
Salt
concentration
Salting in
Salting out
Tinh chế Protein
Những phương pháp thường dùng trong tinh chế protein:
Sắc ký lọc gel;
Sắc ký trao đổi ion;
Sắc ký ái lực;
Sắc ký tương tác kỵ nước;
Xác định độ sạch và kích thước protein bằng điện di biến tính trên gel polyacrylamide (SDS- PAGE)

Sắc ký lọc gel (Rây phân tử)
Sự phân tách protein dựa trên kích thước phân tử:
Các hạt gel cấu tạo từ polymer của dextran (sephadex), agarose (Sepharose), polyacrylamide (Sephacryl hoặc BioGel P). Mỗi hạt gel đều có những mắt lưới to hay nhỏ phụ thuộc vào loạị gel. Trong quá trình sắc ký, các chất phân tử lớn sẽ chỉ di chuyển ở pha lỏng phía ngoài hạt gel, và sẽ nhanh chóng rút ra khỏi cột. Trong khi đó, các chất có kích thước nhỏ hơn sẽ chui qua các mắt lay vào bên trong hạt gel và sẽ với mức độ khác nhau tuỳ theo khối lượng và hình dạng của chúng, và sẽ ra khỏi cột gel chậm. Phân tử càng nhỏ càng phải len lách nhiều trong hạt gel, và càng ra chậm. Do vậy có thể coi việc tách các chất bằng gel Sephadex như một quá trình sàng lọc (rây) phân tử. Các phân tử đươc phân bố thụ động giữa thể tích kẽ (thể tích bên ngoài hạt gel- V0) và thể tích bên trong hạt gel (Vi), phụ thuộc vào khả năng chui được vào bên trong hạt gel của chúng. Nếu tổng thể tích của cột là Vt, thì: Vt = Vo + Vi


Độ hấp thụ UV
V0
Vi
Vt
Protein lớn
Protein nhỏ hơn
Sắc ký trao đổi ion
Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography) sử dụng tính chất tĩnh điện của protein cần tách. Trong quá trính sắc ký, các chất phân tử lớn tích điện sẽ được cố định qua các liên kết cộng hóa trị lên một chất giá không tan như cellulose hoặc polyacrylamide. Protein với điện tích trái dấu sẽ gắn với giá thể trong khi các protein khác bị rửa trôi khỏi cột. Sau khi rửa hết tạp chất, protein gắn với giá thể được chiết rút bằng lực ion cao (muối nồng độ cao), hoặc bằng các tác nhân khác như thay đổi pH.

Độ hấp thụ UV
Nồng độ muối tăng
sắc ký trao đổi ion
Các đặc tính tĩnh điện của một protein xác định loại nhựa trao đổi ion có tác dụng phù hợp. Về nguyên tắc đó là:
Protein tích điện dương nếu dung dịch có pH < pI, khi đó nó sẽ gắn với nhựa tích điện âm, hay còn gọi là cationit (cation exchanger);
Protein tích điện âm nếu dung dịch có pH > pI, khi đó nó sẽ gắn với nhựa tích điện dương, hay còn gọi là anionit (anion exchanger)
Lưu ý trên thực tế bề mặt protein có những vùng có điện tích khác với tổng điện tích của toàn bộ phân tử.








Ví dụ về cationit gồm: carboxymethyl (CM) và sulfopropyl (SP)
Ví dụ về anionit gồm: diethylaminoethyl (DEAE), quaternary amine (QAE)
Sắc ký áI lực
Sắc ký ái lực (affinity chromatography) sử dụng ái lực giữa cấu tử gắn (ligand) và protein cần tách. Cấu tử gắn thường được cố định qua các liên kết cộng hoá trị giá thể không tan như cellulose hoặc polyacryl-amide. Khi tiến hành sắc ký, protein cần tách sẽ gắn với giá thể trong khi các protein khác sẽ rửa trôi ra khỏi cột. Sau khi rửa sạch tạp chất, protein cần tách được phản hấp phụ bằng các chất cạnh tranh như cấu tử tự do, hay bằng các chất có khả năng phá vỡ tương tác. Trong số các ví dụ về tương tác protein- cấu tử có thể kể đến tương tác kháng nguyên- kháng thể, hay tương tác giữa Ni+ và nhãn poly-histidine.

Độ hấp thụ UV
Nồng độ cấu tử tự do
Tương tác kỵ nước
Sắc ký tương tác kỵ nước (hydrophobic interaction chromatography) dựa trên những mảng kỵ nước trên protein và tương tác của chúng với nhựa kỵ nước.
Ví dụ, phenyl sepharose là một loại nhựa kỵ nước mạnh thu được khi gắn cộng hoá trị nhóm phenyl với giá thể agarose. Trong quá trình sắc ký, những phân tử protein gắn với nhân phenyl nhờ tương tác kỵ nước. Những tương tác này là mạnh nhất trong dung dịch muối nồng độ cao. Do vậy quy trình thông thường của phương pháp là trước tiên gắn protein ở điều kiện nồng độ muối cao, sau đó chiết rút protein gắn bằng gradient muối ngược từ nồng cao xuống thấp.
Nồng độ muối giảm
Độ hấp thụ UV
S¾c ký giÊy