Enzyme xenluase

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
Bài thảo luận
ENZYME CELLULASE
GVHD: TS. Vũ Ngọc Bội
Nguyễn Thị Hoàng Nhạn
Phạm Tường Vy
Trần Nguyễn Hạ Huyền
Đoàn Vũ Trang Đài
Cao Thị Hòa
Nguyễn hoàng Hương Quỳnh
Huỳnh Trần Bích Ngọc
Phan Thanh Quang
Dương Quốc Chương
Nguyễn Minh Sơn
MỤC LỤC:
I. TỔNG QUAN:
Khái niệm.
Cơ chất
Nguồn gốc và Phân loại.
Cơ chế xúc tác
II. ENZYME endo – β 1,4 – glucanase:
1.Nguồn thu nhận
2.Đặc tính enzyme
3.Nuôi cấy
4.Thu nhận và tinh sạch
III. Ứng dụng:

Tổng quan về enzyme cellulase
1.Khái niệm:
Cellulase là một phức hệ enzyme xúc tác thủy phân cellulose thành cellobiose và cuối cùng là glucose.



Nguồn gốc
Được thu nhận từ các nguồn khác nhau:
Động vật: dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm…
Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì mạch đen…
Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…
Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật. Các chủng vi sinh vật thường sử dụng:
Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus…

Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…

Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus Subtilis, Bacillus pumilis…
Cơ chất cellulose
Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật ngoài ra còn có ở TB một số loài VSV, không có trong tế bào động vật.
Chúng là homopolymer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-glucose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside.
cellulose có cấu tạo sợi, cấu trúc không đồng nhất gồm vùng kết tinh và vùng vô định hình
Phân loại theo cơ chế xúc tác
Cơ chế xúc tác:
II. ENZYME endo – β 1,4 – glucanase:
Tính chất lý hóa của enzyme
Enzyme này hoạt động tốt nhất ở pH=5,5 và nhiệt độ 550C, bền ở 30-450C
Hoạt tính cao ở pH= 6
Các dung môi hữu cơ ít ảnh hưởng tới Enzyme này, trừ n- butanol
Các ion kim loại và EDTA nồng độ 4-12mM đều làm giảm hoạt tính enzyme.

2. Nguồn thu nhận:


Thu nhận từ chủng nấm Aspergillus oryzae (A.oryzae ).
Thuộc chi Aspergillus, họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm.
Môi trường nuôi cấy: môi trường MTK
3 ml môi trường khoáng (MTK):
Peptone: 0.1%
KH2PO4: O.2%
CaCl2.2H2O: 0,03%
(NH4)2SO4: 0.14%
MgSO4.7H2O: 0.03%
Cao nấm men: 0.1%
Dung dich muối: 1ml (gồm FeSO4: 18mM; MnSO4 6.6mM; ZnSO4.7H2O: 4.8mM; CoCl2: 15mM; )
pH 6.5 khử trùng
Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian
Chủng A.Oryzae VTCC-F-045 được nuôi cấy ttrong môi trường khoáng MTK ở 300C ,lắc 200 vòng/phút. Dịch enzyme được thu ở các thời gian khác nhau để xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase. Kết quả cho thấy hoạt tính enzyme đạt tối đa ở 120h(2,34U/ml).
Các chủng khác nhau thì thời gian tổng hợp endo-β-1,4-glucanase là khác nhau.


Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng
Bổ sung CMC ở các nồng độ khác nhau vào môi trường nuôi cấy chủng A.oryzae VTCC-F-045, lắc 200 vòng/phút sau 120h
Kết quả: với nồng độ là 1% CMC enzyme đạt hoạt tính cao nhất.
Ảnh hưởng của nguồn Carbon
Lactose được đưa vào môi trường nuôi cấy có nồng độ khác nhau nhưng ở nồng độ 0,4% enzyme được cảm ứng sinh tổng hợp cao nhất.
Ảnh hưởng của nitơ
Bột đậu tương được đưa vào môi trường với các nồng độ khác nhau sau 120h nuôi cấy nhận thấy rằng ở nồng độ 1% thích hợp nhất cho quá trình sinh tổng hợp enzyme này
Nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ tối ưu để chủng A.oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp enzyme endo-β-1,4-glucanase cao nhất là 280C.
Ảnh hưởng của pH
Mặc dù được nuôi ở các độ pH khác nhau nhưng pH=5.5 khả năng sinh tổng hợp enzyme là cao nhất.
Xác định hoạt độ enzyme:
Xác định theo phương pháp định lượng đường khử của Nelson/Samogi.
Đơn vị hoạt độ là lượng enzyme phân giải cơ chất CMC thành đường khử tương đương 1µl glucose trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm.
Xây dựng đường chuẩn
Glucose được pha trong 0,1M đệm Natri acetate, pH =5.0 với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 20-100µg/ml. 1ml dung dịch glucose chuẩn được đo ở bước sóng 660nm.
Đường chuẩn glucose
Ống thí nghiệm:
dung dịch CMC 0.5% : 0.5ml
đệm natri acetate 0.1M, pH=5
dịch enzyme: 0.5ml
Hỗn hộp được lắc đều và ủ 5 phút ở 500C sau đó bổ sung chất định lượng đường khử được tạo thành
Ống kiểm tra:
dung dịch CMC 0.5%: 0.5ml
Thêm các chất định lượng đường khử
dung dịch enzyme: 0.5ml
Lấy 1ml dung dịch cần định lượng đường khử ở ống nghiệm, thêm 1 ml hỗn hợp muối AB ->đun sôi cách thủy 20 phút, làm lạnh ở nhiệt độ phòng, thêm 1ml dung dịch adenomolybdate lắc đều đến khi hết bọt khí.
Ly tâm 8000 vòng/phút loại bỏ tủa cơ chất còn dư ->so màu ở bước sóng 660nm.
Mẫu đối chứng thay dung dịch định lượng đường khử bằng nước cất.
Đối chiếu với đồ thị đường chuẩn suy ra hàm lượng đường khử.
Quy trình thu nhận enzyme:
Nguồn thu nhận enzyme( A. oryzae VTCC-F-045)

Ly tâm

Dịch chiết

Kết tủa bằng (NH4)2SO4

Ly tâm

Enzym thô
Tinh sạch và thu nhận
Dịch enzyme thô

Ly tâm 10 phút ở 12500 vòng/phút

Dịch trong

Tủa muối amonium sulfat 65%

Thẩm tích loại muối

Qua cột Sephadex G100

Enzyme tinh sạch



40 ml dịch nổi sau khi ly tâm 10 phút 12500 vòng/phút được tủa bằng (NH4)2so4 65% và để ở 40C qua đêm.


Kết tủa thu được hòa với 0.1 M đệm acetate pH=5 và thẩm tích loại muối.Sau khi loại muối, hoạt tính E đạt 24,46U/mg Protein, độ sạch E đạt 1,6 lần so với dịch thô ban đầu.
Dịch tủa sau khi loại muối cho qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G-100. Cột có kích thước 2,6x 60 cm. Cột được cân bằng với đệm phosphate 50mM, pH = 7,5. Tốc độ chảy là 25ml/h. Thể tích mỗi phân đoạn được thu 2ml (thu 20 phân đoạn).

Hàm lượng protein và số đơn vị hoạt tính E được xác định trong mỗi phân đoạn.
Sắc kí đồ trên cột sephadex G100 cho thấy protein được phân tách thành 2 peak trong đó peak ở phân đoạn 10 cao nhất, hoạt tính 40,36U/mg protein.
Các phân đoạn có hoạt tính cao được điện di trên gel 12,5% polyacrylamide với chất chỉ thị phân tử. Sau điện di cho thấy peak 10 xuất hiện một băng đậm, M=36kDa.

Độ tinh sạch đạt được gấp 2,6 lần so với enzyme thô ban đầu

III.Ứng dụng
1.Trong công nghiệp sản xuất bột giấy
Trong giai đoạn nghiền cần bổ sung endo-β-1,4-glucanase để làm tăng khả năng nghiền và tiết kiệm 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học.
Việc bổ sung endoglucanase và hỗn hợp các hemicellulase, pectinase trước khi nghiền hóa học làm tăng khả năng khuếch tán của hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin

2.Trong công nghiệp chế biến thực phẩm
Ví dụ: sản xuất các loại nước quả và nước uống không cồn dựa trên việc trích li dịch quả
Bổ sung endoglucanase để tăng hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nước quả
Sản xuất bia:
Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase
trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều
kiện tốt cho tác động của protease và đường hóa.


3.Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi:

Nguồn thức ăn cung cấp năng lượng cho gia súc và gia cầm có chứa một phần polysaccharide gồm cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4 glucoside làm tăng độ nhớt trong ruột.
Vì thế,việc bổ sung cellulase trực tiếp vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng đồng hóa thực phẩm trong đường tiêu hóa động vật, tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật
4.Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol,amylase là thành phần chính trong quá trình thủy phân.
Tuy nhiên, việc bổ sung một số enzym như cellulase,hemicelluase sẽ phá hủy tế bào,giúp tăng lượng đường tạo thành và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase,dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu sẽ tăng
5. Ứng dụng trong nuôi cấy tế bào và tái tổ hợp gen:
Sử dụng cellulase để phá vỡ thành tế bào để tạo tế bào trần (protoplast), có ý nghĩa rất lớn trong việc tiến hành các kỹ thuật chuyển nạp gen:dung hợp tế bào trần tạo tế bào lai mang đặc điểm của cả tế bào bố mẹ.

THANKS FOR WATCHING