Enzyme protease

GVHD : Ts. Huỳnh Ngọc Oanh
Sv thực hiện :
Huỳnh Hoàng Huy 60901001
Cao Thị Mỹ Phương 60902029
Lê Kim Tài 60902310
Nguyễn Thị Thanh Tân 60902381
Nguyễn Quý Toại 60902846
Nguyễn Đức Trung 60902979
Lê Hoàng Khoa 60901228
PROTEASE
Tổng quan về Protease
Định nghĩa
Nhóm enzyme protease (peptide– hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-) trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các acid amine.
Phân loại và đặc điểm
Dựa vào vị trí cắt liên kết khi xúc tác
Dựa vào pH hoạt động
Dựa vào vị trí cắt liên kết khi xúc tác
Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.

Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
Dựa vào vị trí cắt liên kết khi xúc tác
Endopeptidase
+Aminopeptidase
+Carboxypeptidase
Exopeptidase
+Serin proteinase
+Cysteine proteinase
+Aspartic proteinase
+Metallo proteinase
Exopeptidase

Serin proteinase:là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme.
Cysteine proteinase:Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động.
Aspartic proteinase:hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Metallo proteinase: nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn.


Dựa vào pH hoạt động
* Protease acid: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhưng ít thấy ở vi khuẩn.
* Protease trung tính: có pH 7-8 như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa.
* Protease kiềm: có pH 9-11.
Nguồn thu nhận
Từ thực vật
Từ động vật
Từ vi sinh vật
Nguồn thực vật
Nguồn động vật
Nguồn vi sinh vật
Ứng dụng
Tách chiết và tinh sạch enzyme Protease

1. Tách chiết :
- Enzyme : nội bào , ngoại bào.
- Phương pháp phá vỡ tế bào :
Biện pháp cơ học : nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa (homogenizator)
Vật lý : sóng siêu âm
Hóa học : dung môi hữu cơ như butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate

Chiết

Phương pháp
Nước cất
Dung dịch đệm thích hợp
Dung dịch muối trung tính.
Yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý : nhiệt độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 50C).
Một số chất điện ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl2, CaCl2.
Tinh sạch enzyme
Phương pháp kết tủa
Loại bỏ bước đầu protein tạp
Cơ sở : sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ muối xác định
Các loại muối có thể được dùng là (NH4)2SO4, Na2 SO4, MgSO4 ...
(NH4)2SO4 : ổn định , rẻ , phổ biến, độ hòa tan lớn

Một số phương pháp tinh sạch

Phương pháp sắc ký
Đảm bảo độ đồng nhất
Sắc ký lọc gel : dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng và phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra
Phương pháp tách hệ hai pha nước
Phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia các enzyme trong suốt quá trình tinh sạch protein
Cơ sở : dựa vào sự phân bố khác nhau của hỗn hợp trong dung dịch hai pha không hòa tan vào nhau
THU NHẬN VÀ TINH SẠCH
SERINE PROTEASE
TỪ TRÙN QUẾ
Serine protease
Nhóm protease có Ser – His - Asp tại trung tâm hoạt động
Có ở mọi giới sinh vật: vsv cổ, virus, prokaryote, eukaryote
Gồm hơn 280 gốc acid amin
M = 20.000 -27.000 Da
pH otp = 7 – 11

Serine protease
4 nhóm nhỏ:
+ chymotrypsin: His-Asp-Ser
+ subtilisin: Asp-His-Ser
+ carboxypeptidase Y: Ser-Asp-His
+ Clp protease: Ser-His-Asp
ở người do tuyến tụy tiết ra dạng tiền enzyme
Tham gia vào nhiều quá trình sinh lý quan trọng
Cơ chế xúc tác
4 bước:
Gắn với cơ chất
Tấn công bằng tác nhân ái nhân
Proton hóa
Thủy phân liên kết ester
Gắn với cơ chất
Tấn công bằng tác nhân ái nhân
Proton hóa
Proton hóa
Thủy phân liên kết ester
Chất ức chế
Chất ức chế
Diisopropyl fluorophosphate (DPF)
Phenylmethylsulfony fluoride (PMSF)
=> Alkyl hóa không thuận nghịch gốc serine
ứng dụng
Company Logo
www.themegallery.com
Trùn quế
I. Trùn quế và đặc tính của trùn quế
Tên khoa học: Perionyx excavatus
Chi Pheretima
Họ Megascocidae (họ cự dẫn)
Ngành ruột khoan.
- Kích thước tương đối nhỏ
-Dài khoảng 10 – 15 cm,
- thân hơi dẹt
Màu từ đỏ đến màu mận
Hai đầu hơi nhọn.
Cơ thể có hình thon dài nối với nhau bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một vành tơ.
Đặc tính sinh lý
Trùn quế rất nhạy cảm ánh sáng và nhiệt độ.
Nhiệt độ thích hợp nhất với Trùn quế nằm trong khoảng từ 20 – 30 độ C
Môi trường thích hợp : Ẩm ướt , pH ổn định(7.0 – 7.5).
Phổ thức ăn khá rộng(rác đang phân hủy, phân gia súc, gia cầm…)..
Trong tự nhiên, Trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, gần cống rãnh, hoặc nơi có nhiều chất hữu cơ dễ phân hủy và thối rửa
Sự sinh sản và phát triển
Trong điều kiện sống thích hợp có thể tạo ra từ 1.000 –1.500 cá thể /năm.
Trùn mới sinh nhỏ như đầu kim có màu trắng, dài khoảng 2 – 3mm, sau 5 – 7 ngày cơ thể chúng sẽ chuyển dần sang màu. Khoảng từ 15 –30 ngày sau, chúng trưởng thành và bắt đầu xuất hiện đai sinh dục; từ lúc này chúng bắt đầu có khả năng bắt cặp và sinh sản
Kỹ thuật nuôi trùn quế
Chuẩn bị khu nuôi
Chuẩn bị thức ăn
Thả giống
Nhiệt độ
Độ ẩm
Độ chiếu sáng
Không khí
pH
Giun quế sinh trưởng và sinh sản tốt nhất ở nhiệt độ từ 25-280C(Lofs-Holmin (1995) )
Độ ẩm thích hợp nhất đối với giun quế từ 60-70% (Ewards, CA. (1983)
Khối lượng chất nền ban đầu
Thả giống
Che đậy ổ nuôi
Cho ăn và chăm sóc
Tươi nước
Chống nóng lạnh
Chống thiên địch
Chăm sóc nuôi dưỡng
hàm lượng O2 và CO2có trong không khí ảnh hưởng đến sinh trưởng, sinh sản của giun chủ
Giun quế có thể sống và sinh sản tốt trong ngưỡng pH từ 7-8(dùng quỳ tím để kiểm tra)
- Tơi xốp, không dính, có dinh dưỡng và sạch
- Dùng phân bò hoặc phân của các loài nhai lại khác làm chất nền là tốt nhất
- Không dùng các loại lá cây có chứa dầu, có mùi thơm, có chứa chất đắng… để làm chất nền.
Giun được chọn làm giống phải khoẻ mạnh, phản xạ nhanh, không sử dụng những con yếu ớt, dị tật.
Dùng tấm chiếu hoặc bao tải đay phủ lên bề mặt chất nền là tốt nhất
cứ 3-4 ngày lại cho giun ăn một lần
thu hoạch
-Phương pháp thu hoạch bằng ánh sáng
-Phương pháp nhử mồi
NGHIÊN CỨU
THU NHẬN VÀ TINH SẠCH SERINE PROTEASE
TỪ TRÙN QUẾ
Bố trí thí nghiệm
Trùn quế
Thu nhận serine protease thô
Sắc kí trao đổi ion trên cột Unosphere Q
Sắc kí tương tác kỵ nước trên cột phenyl sepharose
Sắc kí lọc gel trên cột sepharose 12
Serine protease tinh sạch
pH
Nhiệt độ
Bền
Tối ưu
Bền
Tối ưu
Thu nhận serine thô
Trùn quế
Rửa sạch
Nghiền nhuyễn
Nước cất
0.02% natri azide
Ủ
Nhiệt độ phòng
10 ngày
Trích ly
Ly tâm
4oC
10000 vòng / 30 phút
Tủa protein
Acetone ( 1 : 2)
Serine protease thô
Sắc ký trao đổi ion
Serine protease thô
Hòa tan
Cột sắc ký Unosphere Q
(1.5 x 40 cm)
Dd đệm tris-HCl
20mM pH 8.5
PMSF 1mM
Gel Unosphere Q
Dd đệm tris-HCl 20mM pH 8.5
+ PMSF 1mM
0.8 ml/phút
Rửa sạch
1 ml/phút
Gradient NaCl
0 -0.45 M
Protein phân đoạn I
Sắc kí tương tác kị nước
Protein phân đoạn I
Cột phenyl sepharose
(1.5 x 30 cm)
Gel Phenyl Sapherose
Dd đệm tris-HCl 20mM pH 8.5
+ PMSF 1mM
+ Amonium sunfat (AS) 30%
1 ml/phút
Rửa sạch
1 ml/phút
Gradient AS
30% - 0%
Protein phân đoạn II
Sắc kí lọc gel
Protein phân đoạn II
Thẩm tích
Cột sắc ký Sephasose 12
+
Hệ thống sắc kí tự động Biologic HR
Dd đệm tris-HCl
20mM pH 7.5
+ NaCl 0.15 M
+PMSF 1mM
0.5 ml/phút
Đông khô
Serine protease tinh sạch
Xác định nhiệt độ tối ưu
Serine protease
tinh sạch
Hòa tan
Ủ
Nhiệt độ tối ưu
Đệm phosphate 50 mM pH 7.5
Nồng độ
1mg/ml
Đo hoạt tính
So sánh
Xác định nhiệt độ bền
Serine protease
tinh sạch
Hòa tan
Đệm phosphate 50 mM pH 7.5
Nồng độ
1mg/ml
Ủ
Nhiệt độ bền
Đo hoạt tính
So sánh
Ổn định
10 phút
Xác định pH tối ưu
Serine protease
tinh sạch
Hòa tan
Ủ
pH
tối ưu
Đo hoạt tính
So sánh
Nhiệt độ phòng
30 phút
Xác định pH bền
Serine
tinh sạch
Hòa tan
Ủ
pH bền
Đo hoạt tính
So sánh
Đưa về
pH =7
4oC
16 giờ
Kết quả
Protease (serine protease) ở trùn quế có khả năng thủy phân fibrin tốt hơn trong casein
Hoạt tính thể hiện cao nhất ở phân đoạn FIII-3
Kết quả
Nhiệt độ tối ưu : 60 – 65oC
Độ bền nhiệt của enzyme sau 3h:
Bền : dưới 50oC
Giảm 10 – 30% : 55oC
Giảm 98% : 60 – 65oC
Gần như mất hoạt tính : 70oC
Kết quả
pH tối ưu : pH 7 và pH 11
Bền và ổn định : pH = 4 -12
 Enzyme bền trong khoảng pH tối ưu của chúng
Kết luận
Serine protease từ trùn quế có nhiệt độ tối ưu 60-650C, pH tối ưu 7-11
Serine protease từ trùn quế có hoạt tính cao hơn casein, thể hiện mạnh nhất ở phân đoạn FIII-3
Cần những nghiên cứu thêm để so sánh giữa protease trùn quế với protease các loài trùn đất khác.
Cần khảo sát thêm các điều kiện tối ưu để ứng dụng trong quy mô công nghiệp.
www.themegallery.com
Thank You !
Thẩm tích