Enzyme pro

Trường Đại học Nha Trang
Viện công nghệ sinh học và môi trường

: Thu nhận enzyme Protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae và ứng dụng trong chế biến nước tương
Semina
GVHD: TS. Vũ Ngọc Bội
SVTH: 1. Lê Thị Vân
2. Nguyễn Thị Thanh Trà
3. Nguyễn Thị Ngọc Bích
4. Vũ Thị Xuân
5. Nguyễn Thị Thu Huyền
6. Lại Nhật Linh
7. Nguyễn Quyết Thắng
NỘI DUNG
B. Ứng dụng trong sản xuất nước tương


A. Thu nhận enzyme Protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae .

A. Thu nhận enzyme Protease
Tổng quan về enzyme Protease

Quy trình thu nhận enzyme Protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae .
I. Tổng quan enzyme Protease
1.Giới thiệu chung

2.Phân loại protease

Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este (bromelin) và vận chuyển amino acid

- Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid

Giới thiệu chung
Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein:
H2N-CH-CO--NH-CH-CO--…--NH-CH-COOH

R1 R2 RX
H2O
H2N-CH-COOH + H2N-CH-CO--…--NH-CH-COOH
Protease
R1 R2 RX

Sản phẩm thủy phân là có thể là peptide, peptone, amino acid … tùy theo mức độ thủy phân.
2. Phân loại
Potease(peptidase)(E.C.3.4)


Exopeptidase(E.C.3.4.11-17) Endopeptidase(E.C.3.4.21-99)


Aminopeptidase Serine proteinase

Cystein proteinase
Cacboxypeptidas
Aspartic proteinase

Metallo proteinase

Cấu trúc không gian của protease
Protease có bản chất là protein, chỉ có các protein có cấu trúc bậc 4 mới thể hiện hoạt tính sinh học.


Cấu trúc không gian của protease được hình thành do các tiểu phần dưới đơn vị có cấu trúc bậc 3 liên hợp lại bằng các liên kết hydro, tương tác tĩnh điện, tương tác kị nước …
Trung tâm hoạt động của protease
Trung tâm hoạt động của protease thường bao gồm một tổ chức các nhóm định chức của amino aicd không tham gia tạo thành trục chính của sợi polypeptide.
Vd : nhóm – SH của Cys, -OH của Ser, Tys, ε- NH2 của Lys, -COOH của Asp,Glu, …
Trung tâm hoạt động của protease hai cấu tử bao gồm các nhóm ngoại ( vitamin, ion, kim loại)
II. Quy trình thu nhận enzyme Protease từ nấm mốc
Sơ lược về nấm mốc A.oryzae.

Quy trình thu nhận enzyme.
Phân lập nấm A.oryzae.
Lên men tạo enzyme Protease.
Thu nhận sản phẩm.
Sản xuất enzyme Protease tinh khiết.

1.Sơ lược về nấm mốc A.oryzae
Phân loại: A.oryzae thuộc.

chi Aspergillus
họ Trichocomaceae
bộ Eurotiales
lớp Eurotiomycetes
ngành Ascomycota
và thuộc giới nấm
(theo Kitamoto, 2002).
2. Đặc điểm
Nấm vi thể, nấm mọc và phát triển thành lớp mốc màu đen, vàng.

Cơ thể sinh trưởng là hệ sợi, phân nhánh có vách ngang chia sợi thành nhiều tế bào, sợi mảnh chiều ngang sợi khoảng 5 – 7µm.
Sinh sản bằng bào tử.

Giàu enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào: amylase, protease. Có khả năng thủy phân liên kết β-glucoside, endo-β-1,4-glucanase

Nấm mốc A.oryzae
2. Quy trình thu nhận Protease
Phân lập nấm mốc
Lên men tạo Protease
Tinh sạch enzyme
Thu nhận enzyme
2.1 Phân lập chủng nấm A.oryzae
đất

Nguồn phân lập thức ăn

trung tâm cung cấp nấm giống


phân lập trong điều kiện tự nhiên

Phương pháp phân lập trong điều kiện sản xuất

phân lập từ mẫu giống đã hỏng
Quy trình tạo mốc giống :

Mẫu được say nhuyễn , thêm nước cất, pha loãng ở các nồng độ thích hợp và nhân giống chọn lọc trên môi trường tổng hợp: MT Czapek bằng kĩ thuật cấy trang.

Saccharose : 30g
NaNO3 : 3g
K2SO4 : 1g
MgSO4 : 0,5g
KCl : 0,5g
FeSO4 : 0,1g
Nước cất: 1000ml (pH= 5-5,5)

Giống sau khi phân lập sẽ được cấy truyền sang bình tam giác
Môi trường nuôi nấm :
.Cám, ngô đã xay nhỏ, có thêt bố sung thêm trấu cho xốp.
. Độ dày khoảng 1- 2cm
. Đem hấp chín, để nguội 30 - 35̊C
. Cấy truyền giống từ ống nghiệm sang bình tam giác và nuôi 36 – 48 giờ nhiệt 30 - 35̊C
Giống nhân thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ.

2.2 Lên men tạo Protease ( sử dụng phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn)
Môi trường nuôi cấy
- Môi trường có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật, thành phần môi trường phải đảm bảo đủ chất dinh dưỡng cho sự phát triển bình thường của vi sinh vật và sự sinh tổng hợp enzyme.

- Thành phần chính của môi trường : C, N, H,O; ngoài ra còn các chất vô cơ : Mn, Ca, P, S, Fe…và các chất vi lượng khác.

- Để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường bổ sung các chất cảm ứng, các chất này thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp

a. Nguồn cacbon
Thường là các hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu pà glucid, có nhiều hợp chất là nguồn cacbon cho A. oryzae sinh enzyme protease có hoạt lực cao.
Vd: đối với A. oryzae sinh tổng hợp proteinase tác dụng của nguồn cơ chất có thể theo thứ tự:
fructose→saccharose→maltose→ glucose → arabinose → glactose
b. Nguồn nito
Nguồn nito sử dụng bao gồm hai nhóm: nito vô cơ và nito hữu cơ
Đối với A. oryzae trên môi trường có chứa nguồn nito hữu cơ thì khả năng sinh tổng hợp protease acid cao.
Môi trường bổ sung cả hai nguồn nito trên thì hoạt lực sinh enzyme tăng cao
Vd : môi trường có cám mì , bột đậu tương đã tách chất béo, có cả hai nguồn nito khả năng sinh protease của A. oryzae tăng 22-74%
b. Nguồn nito
Các amino acid có ảnh hưởng rõ rệt tới sự sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật, có thể cảm ứng hoặc ức chế

Vd: Gly, Ala, Met có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của chủng A. oryzae đột biến 251-90 đến 6 – 9 % và nguyên chủng A. oryzae 132-63 tới 7-24%
c. Nguồn nguyên tố khoáng và các chất khác.
Muối khoáng rất cần thiết cho sự phát triển bình thường của vi sinh vật và sự sinh tổng hợp enzyme

Vd: ion Mg(2+) có tác dụng trong quá trình sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao
Quy trình:
Chuẩn bị môi trường làm mốc trên khay:
- Nguyên liệu chính được sử dụng là cám và ngô đã được xay và bổ sung thêm trấu hoặc mạt cưa để tăng độ xốp giúp cho hệ sợi nấm phát triển tốt, tận dụng tối đa nguồn cơ chất.
- Trộn với nước theo tỉ lệ 80 – 90 trọng lượng so với nguyên liệu, sau khi trộn để khoảng 3-4 giờ cho ngô thấm đều nước, đem hấp khử trùng ( P=1-1,5 atm ở nhiệt độ 121°C trong 45-60 phút )
- Nguyên liệu sau khi hấp phải chín đều, độ ẩm còn lại 45-50% là vừa.

Trộn giống vi sinh vật :
- Nguyên liệu được rỡ ra và làm nguội nhanh đến khoảng 26 - 28°C thì tiến hành cấy giống hoặc rắc bào tử vào môi trường ủ thành đống vài giờ
- Tỉ lệ giống đưa vào nuôi cấy thường vào khoảng 0,5 – 2% so với khối lượng của môi trường hoặc cao hơn.
Kĩ thuật nuôi cấy:

- Sau thời gian ủ bào tử đã nảy mầm nhưng chưa thành sợi cần rải môi trường thành từng lớp mỏng 2- 3cm, và giữ cho nhiệt độ không quá 36 độ C.

- Đưa các khay vào phòng nuôi cấy đặt trên các giá đỡ được thiết kế sao cho không khí được lưu thông thường xuyên

- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho sợi nấm phát triển là 28 -32°C

- Thời gian nuôi cấy khoảng 60 giờ, nếu bào tử hình thành chậm thì có thể 70 – 72 giờ




Các giai đoạn phát triển của nấm mốc:
- Gđ 1:
. Sợi nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc sữa
. Khối môi trường còn rời rạc
. Enzyme mới bắt đầu hình thành

- Gđ 2:
. Kéo dài 14-18 giờ, toàn bộ bào tử đã phát triển thành hệ sợi
. Môi trường kết chặt lại, độ ẩm giảm dần, nhiệt độ môi trường tăng nhanh, quá trình đồng hóa diễn ra mạnh, lượng cơ chất giảm nhiều
. Enzyme protease được tổng hợp mạnh

- Gđ 3:
. Kéo dài 10 – 20 giờ
. Quá trình trao đổi chất yếu dần
. Bào tử được hình thành nhiều lượng enzyme tao ra ít.




-
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
Độ ẩm của môi trường:

- Độ ẩm ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trao đổi chất của nấm mốc, thiếu nước thì các quá trình thủy phân cơ chất của môi trường và sự sinh tổng hợp các hợp chất cần thiết không thể thực hiên.
- Độ ẩm tốt nhất cho sự hình thành enzyme của A. oryzae là 55– 60% độ ẩm thích hợp cho sự hình thành bào tử là 45%

Ảnh hưởng của không khí:

- A. oryzae là vi sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình thường khi có đầy đủ oxy. Vì vậy môi trường phải xốp và thoáng khí.
- Theo thực nghiệm trong quá trình nuôi cấy A. oryzae cứ cách 1 giờ môi trường cần 1,7 m3 không khí, nồng độ CO2 là 8%
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy:

- Hầu hết các chủng A. oryzae có cực đại sinh enzyme protease ở giờ thứ 36 – 42 của quá trình nuôi cấy.Thời gian nuôi cấy để thu được lượng protease cực đại thường được xác định bằng thục nghiệm.

- Thời gian nuôi cấy phải phù hợp tránh hiện tượng nấm sinh bào tử vì nó thường làm giảm hoạt lực của enzyme, với A. oryzae hoạt lực sinh enzyme thường kết thúc khi nấm bắt đầu sinh bào tử.

Ảnh của pH và nhiệt độ:

- pH thích hợp cho nấm mốc phát triển là môi trường acid yếu khoảng 5,5 -6

- Nhiệt độ cũng là một yếu tố hết sức quan trọng, ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của nấm mốc và sinh enzyme
Trong quá trình nuôi cấy cần giữ cho nhiệt độ môi trường trong khoảng 27 - 36 độ C
Nuôi cấy nấm mốc
Thu nhận sản phẩm

Kết thúc quá trình nuôi cấy ta tiến hành thu nhận chế phẩm enzyme protease, chế phẩm này được gọi là chế phẩm thô.
Có thể thu nhận chế phẩm enzyme vào cuối giai đoạn 2 vì ở giai đoạn này protease được tổng hợp mạnh.

Sang đến giai đoạn 3 thì lượng bào tử tạo ra nhiều, lượng enzyme tạo ra ít.
Sấy: để đảm bảo cho enzyme Protease không bị mất hoạt tính nhanh
Độ ẩm sau khi kết thúc quá trình sấy: 10%
Sấy ở nhiệt độ: 38oC – 40oC
Sấy ở nhiệt độ 60oC – 70oC sẽ làm bất hoạt enzyme protease của A.oryzae
Chế phẩm enzyme Protease thô gồm:
- Enzyme Protease và các loại enzyme khác
- Sinh khối tế bào nấm mốc, thành phần môi trường
- Nước có trong môi trường
Sấy:
Tinh sạch enzyme Protease
Nghiền nhỏ:
Mục đích:
- phá vỡ thành tế bào
- Làm nhỏ thành phần của chế phẩm enzyme thô
- Tạo điều kiện cho enzyme nội bào thoát ra ngoài
- Giúp các enzyme ngoại bào thoát ra khỏi thành phần tế bào dễ dàng hơn
Chất trợ nghiền: cát thạch anh và hạt thủy tinh
Trích ly:
Chế phẩm enzyme thô
Hòa tan bằng dung môi nước
Với tỉ lệ: 1 phần enzyme thô + 4-5 phần nước
Khuấy nhẹ, lọc lấy dịch
Bã
Dung dịch enzyme thô
Enzyme Protease, nước, chất hòa tan trong môi trường nuôi cấy
Kết tủa Protease
Dung dịch enzyme thô
Kết tủa enzyme
Dùng tác nhân kết tủa là ethanol hoặc sunfat amon.
Tỉ lệ: 1 phần dd enzyme thô + 2-2,5 ethanol nồng độ 97%
Thu nhận kết tủa enzyme
Khuấy nhẹ, để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh 4oC-7oC
Độ ẩm lớn hơn 70%W, dễ bị biến tính
Sấy phun sương

to: 40oC
Enzyme Protease tinh khiết
Độ ẩm 40%W
3. Xác định hoạt đô của enzyme Protease
a. Nguyên tắc chung:
→ Hoạt động của enzyme được xác định thông qua lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành của phản ứng trong một thời gian nhất định.




Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với [E]=const
Xác định thời gian cần thiết để thu được lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm ứng với [E]=const
Xác định [E] thích hợp để trong một thời gian không đổi thu được lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm
3 cách xác định
b. Xác định hoạt độ Protease theo phương pháp Gross và Fuld
Nguên tắc chung:
- Trong môi trường kiềm yếu casein hòa tan và bị kết tủa khi thêm dung dịch acid acetic trong ethanol, nhưng sản phẩm thủy phân của casein lại không bị kết tủa.

- Một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme của 1ml dung dịch nghiên cứu có khả năng phân giải 1mg casein ở 38 độ C trong thời gian 30 phút.

- Mục đích là xác định lượng enzyme tối thiểu để phân giải 2mg casein đến mức không bị kết tủa trong điều kiên trên
Hóa chất

- Chuẩn bị dung dịch casein 0,1% : 2 cách chuẩn bị
. Cân 0,1g casein hòa tan trong100ml dung dịch cacbonat natri đun ấm cho đến khi hòa tan hết.
. Cân 0,1g casein, trộn lẫn với 5ml dung dịch NaOH 0,1N, 25ml nước cất, đun cách thủy cho đến khi tan hoàn toàn. Làm lạnh dùng dung dịch HCl 0,1N điều chỉnh pH=8 thêm nước cất cho đủ 100ml.

- Dung dịch acid acetic 1% ( 1ml acid đặc hòa tan với 49ml nước cất và 50ml ethanol 90% )

- Dung dịch enzyme cần xác định hoạt độ: chế phẩm enzyme thu được: lấy 1g chế phẩm đem hòa tan trong 100ml nước cất và giữ ở 38 độ C, lấy ra 1ml để xác định hoạt độ.

Tiến hành:

- Lấy 12 ống nghiệm đánh số thứ tự, cho vào các ống 1ml nước cất trừ ống số 1
- Cho vào ống số thứ nhất 2ml dịch enzyme

- Tiến hành pha loãng: lấy 1ml từ ống thứ nhất cho vào ống thứ 2 và lần lượt lấy 1ml từ ống thứ 2 cho vào ống thứ 3, cho đến ống thứ 12, hút bỏ 1ml ở ống 12, tức là mỗi ống chứa 1ml dịch enzyme.

- Cho vào mỗi ống nghiệm 2ml dịch casein đã chuẩn bị ở trên, và giữ ở 38°C trong khoảng 30 phút. Làm lạnh nhanh bằng nước đá để dừng xúc tác của enzyme.
- Nhanh chóng nhỏ vài giọt acid acetic 1% trong cồn rồi xem kết quả.
Tính kết quả:
- Quan sát các ống nghiệm, tìm ra ống có kết tủa ít nhất.

-  Tính hệ số pha loãng của ống dựa vào số thứ tự của ống rồi sau đó tính ra hoạt độ của enzyme.

 - Từ số liệu này ta tính được số đơn vị có trong 1 gam chế phẩm theo phương pháp này.


Ưu điểm:

- phương pháp này đơn giản có thể sử dụng rộng rãi khi nghên cứu các loại chế phẩm khác nhau.

Ví dụ:
Mẫu ban đầu lấy là 1g chế phẩm hòa tan trong 100ml nước cất.
Sau khi cho casein quan sát kết quả, giả sử ta thấy ở ống nghiệm thứ nhất đến ống nghiệm thứ 4 hoàn toàn không có kết tủa.
→ kết luận rằng lượng enzyme trong ống thứ 4 là lượng enzyme tối thiểu có khả năng phân giải hòa toàn 1mg casein trong điều kiện tiêu chuẩn.

Ở ống nghiệm thứ 4 dung dịch enzyme bị pha loãng 8 lần tương ứng với 0,125ml dung dịch ban đầu. Nhu vậy 1ml dich ban đầu có có hoạt độ là : 2/0,125= 16

Vậy 1g chế phẩm enzyme ban đầu có hoạt độ là 1600. đơn vị


Chú ý:

. Nếu kết thúc bước cho acid vào mà tất cả các ống vẫn còn kết tủa thì có nghĩa chế phẩm cần kiểm tra có hoạt độ enzyme yếu
→ chuẩn bị dung dịch enzyme có nồng độ cao hơn

. Nếu tất cả các ông đều không thấy có kết tủa có nghĩa là dung dịch ban đầu có hoạt độ enzyme cao
→ cần phải pha loãng dung dịch enzyme trước khi cho vào ống nghiệm



c. Xác định hoạt độ của protease theo phương pháp Vintetle và Vandsmid.
Nguyên tắc :

- Phương pháp này dựa trên cơ sở xác định nhóm cacboxil của peptide và amino acid được tạo thành do thủy phân protein.

- Một dơn vị hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khr năng xúc tác thủy phân protein để tạo ra 1mg đạm amine trong 1 giờ ở 40°C và pH thích hợp ( 7,38 hoặc 4.49 )
Hóa chất:
- Chuẩn bị dung dịch đệm: chuẩn bị dung dịch Na2HPO4 ( cân 11,876g hòa tan thành 1lit)) KH2PO4 ( cân 9,078g hòa tan thành 1 lit)
. Đệm pH = 7,38 lấy 8 thể tích Na2HPO4 và 2 phần thẻ tích KH2PO4
. Đệm có pH= 4,49 lấy một thể tích Na2HPO4 và 8 thể tích KH2PO4

- Dung dịch gelatin5%: cân 5g gelatin và làm trương với 15ml trong 15 phút. Thêm 20-25ml dung dịch đệm có pH thích hợp đun tới 80độ C khuấy cho tan, rót vào bình định mức 100ml để nguội tới 20 độ thêm đệm vào cho đủ.
- Dung dịch NaOH 0,1N.

Dịch chiết enzyme.
- Cân P(g) chế phẩm nấm mốc nghiền nhỏ với 5ml
- Thêm 10ml dung dịch đệm.
- Giữ ở nhiệt độ 30°C

Tiến hành :
10ml dd gelatin






6 giọt thimolphtalein
chuẩn độ = NaOH 0.1N
lấy 1ml dịch + 20ml cồn 96°
lấy 1ml dịch + 20ml cồn 96°
giữ 3 giờ, 40°C
đun cách thủy (40°C)
10 phút
+ 2ml dd enzyme, lắc đều
Tính kết quả
Hoạt độ của protease được tính theo công thức:
HđP
( a – ao ).V
1,4
t.n
=
đV/g
a, ao : số ml dung dịch NaOH 0,1N tiêu hoa trong thí nghiệm trước và sau phản ứng enzyme.
V : thể tích hỗn hợp phản ứng
1,4: số g đạm amine tương ứng với 1ml dd NaOH 0,1N
t : thời gian phản ứng
n : số g chế phẩm enzyme tham gia phản ứng
( n= P/100)

B. Ứng dụng của Protease trong sản xuất nước tương
1. Giới thiệu về nước tương
Nước tương:

- Nước tương, xì dầu… là các sản phẩm thủy phân từ protein thực vật còn gọi chung là HVP (hydrolyzed vegetable protein).
- Ở Việt Nam, nước tương là sản phẩm thực phẩm truyền thống được sử dụng phổ biến khắp 3 miền Bắc, Trung, Nam.


Nguyên liệu:
- Nguyên liệu sản xuất tương là các nguồn protein thực vật, có thể từ hạt: lúa mì, ngô hạt, đậu nành
- Hay từ bánh khô dầu đậu nành, đậu phụng hoặc gluten bột mì, gluten bắp.


Sự thủy phân protein là cơ sở của các phương pháp công nghệ chế biến nước tương
Công nghệ:
Bản chất của sự thủy phân protein là sự thủy phân liên kết peptide.

Do liên kết peptide là một liên kết mạnh, sự thủy phân xảy ra trong điều kiện có xúc tác.
Tác nhân xúc tác hóa học là axit hoặc kiềm và tác nhân xúc tác hoá sinh học là nhóm enzym thủy phân protein có tên chung là protease.
Có 3 phương pháp công nghệ: công nghệ vi sinh, công nghệ hóa học và công nghệ enzym.
Phương pháp công nghệ enzyme
Theo đề nghị của công ty Novo quy trình enzyme với 5 enzym được phối hợp sử dụng gồm protease, cellulase, amylase. Quy trình này có ưu điểm là điều kiện thủy phân ôn hòa, hoàn toàn không sử dụng hóa chất, không làm biến đổi thành phần axit amin ban đầu, nhưng hiệu suất tối đa chỉ đat 70%.

Để khắc phục nhược điểm của cả hai phương pháp trên và bổ sung ưu điểm cho nhau, ta kết hợp thủy phân bằng axit với thủy phân bằng enzym.

Việc sử dụng enzym protease kết hợp axit xúc tác quá trình thủy phân có ưu điểm là giảm thiểu sử dụng hóa chất độc hại, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, rút ngắn thời gian sản xuất. Có thể sản xuất trên hệ thống thiết bị sẵn có.
Công nghệ enzyme kết hợp axit
Có thể thực hiện thuỷ phân bằng enzym trước rồi sau đó mới thuỷ phân bằng axit hoặc thuỷ phân bằng axit rồi sau đó thuỷ phân bằng enzym. Quy trình được lựa chọn như sau:

So sánh các phương pháp
Quy trình công nghệ sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men cải tiến
Đậu nành
Hấp chín
+ Giống A.ozyzae
Lên men
+ Enzyme
Dịch thủy phân
Nước muối 15-17%
VSV gây mùi
Ủ 1 tháng
Lọc
Nước tương
Bã tương
Lên men
Sấy khô
Chế phẩm
sinh học
Sản xuất nước tương
Ưu điểm:
- Rút ngắn thời gian lên men từ 2-3 tháng còn 1 tháng so với phương pháp lên men bình thường.
- Tận dụng bã sau khi lọc để lên men tạo chế phẩm sinh học giàu đạm và enzym dùng trong nuôi trồng thủy sản và chăn nuôi.

Nhược điểm:
- Mặc dầu so với phương pháp lên men bình thường diện tích mặt bàng dùng cho sản xuất vẫn ít hơn nhưng so với phương pháp hóa giải chúng vẫn cần nhiều hơn.

- Mùi vị nước tương vẫn là của mùi lên men nên ít được người tiêu dùng VN ưa chuộng.