Dung hợp tế bào trần
Chia sẻ bởi Lý Văn Phan |
Ngày 24/10/2018 |
45
Chia sẻ tài liệu: Dung hợp tế bào trần thuộc Bài giảng khác
Nội dung tài liệu:
NUÔI CẤY VÀ DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN
Mở đầu
I. Nuôi cấy tế bào trần
1.1. Tách tế bào trần
1.2. Phương pháp tách
II. Các yếu tổ ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển chủa tế bào trần.
2.1. Môi trường nuôi cấy.
2.2. Điều kiện nuôi cấy.
2.3. Mật độ nuôi cấy.
2.4. Ứng dụng của tế bào trần.
III. Dung hợp tế bào trần.
3.1. Các phương pháp dung hợp.
3.1.1. Dung hợp tự phát (spontaneuouso fusion).
3.1.2 Dung hợp cảm ứng (inducd fusion)
3.2. Cơ sở tế bào học của dung hợp tế bào trần.
3.3 Lựa chọn sản phẩm dung hợp.
Mở đầu
Tế bào trần là tế bào thực vật bị loại bỏ vách bởi 1 xử lý enzyme. Đó là tế bào tự do, cô lập, không định hướng (vì không còn chịu sự tương quan trong hệ thống thực vật).
Dung hợp tế bào trần là sự hợp nhất của các tế bào sôma không có thành tế bào của các cá thể hoặc các loài khác nhau và sau đó tái sinh cây lai từ các tế bào đã dung hợp.
Vì sao lại chọn lai tế bào trần?
Lai hữu tính là phương pháp lai cỏ bản nhất để tạo ra biến dị tổ hợp thông qua dung hợp giao tử.
-Tuy nhiên lai hữu tính chỉ thực hiện được giữa các cá thể trong 1 loài hay các loài có quan hệ thân thuộc. Lai giữu các loài có quan hệ xa nhau thường rất khó khăn vì hàng rào cản trở việc lai xa làm giảm tính hữu dụng của kỹ thuật lai trong việc tăng nguần biến dị di truyền cần thiết cho việc cải thiện cây trồng.
- Nuôi cấy tế bào trần có ích lợi:
+ Giúp loại trừ tính bất thụ hữu tính, tạo cây lai hữu thụ.
+Giúp chuyển những đặc tính có lợi vào cây trồng, ít đòi hỏi phương tiện phức tạp, ít tốn kém, nhanh và trực tiếp.
+ Bằng thao tác di truyền ở tế bào trần có thể dễ dàng tạo ra các tế bào biến đổi gen. Tế bào với kiểu gen biến đổi sẽ được bảo tồn khi tái sinh tế bào thành cây hoàn chỉnh.
I. Nuôi cấy tế bào trần
1.1. Tách tế bào trần
1.1.1. Chọn nguyên liệu
- Thường sử dụng mô thịt lá trưởng thành ở những cây có tính trạng sinh lý tốt. Vì lá cây là nguần nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kỹ thuật protoplast thực vật, do nó cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất. Cũng có thể tách tế bào trần từ mô sẹo, bao phấn.
- Lấy lá ở ngoài tự nhiên thì phải từ những cây không bị xử lý với thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ.
- Những lá được tạo ra trong môi trường nuôi cấy invitro là vật liệu lý tưởng cung cấp 1 lượng lớn tế bào khoẻ mạnh.
1.1.2 Phương pháp tách:
Trước khi thành tế bào bị phá bỏ, các tế bào cần được ngâm trong dung dịch làm ổn định áp suất thẩm thấu và được điều chỉnh cẩn thận liên quan đến khả năng thẩm thấu tế bào. Thường sử dụng mannitol hoặc sorbitol 12-14% (W/v) để duy trì tính ổn định màng sinh chất.
Có 3 phương pháp tách:
1.1.2.1. Phương pháp tách bằng cơ học:
Cắt nhỏ nhu mô thịt lá rồi nghiền nhỏ cho vào dung dịch co nguyên sinh nên cả tế bào chất bị co nhỏ lại ngay lập tức cho vào dung dịch phản nguyên sinh, làm giãn nở 1 cách đột ngột đẩy phần nguyên sinh chất qua thành tế bào. Ta thu được tế bào trần.
+Ưu điểm: Dụng cụ đơn giản
+Nhược điểm: Khá phức tạp, hiệu quả thấp.
1.1.2.2.Phương pháp tách bằng enzyme:
Dùng enzym pectinase, hemicelolase, cellulase. Để phá vỡ thành tế bào có thể dùng riêng lẻ hoạc kết hợp tuỳ vào từng loại tế bào.
- Ưu điểm: Thu được lượng lớn các tế bào trần
-Các bước tiến hành như sau:
+Thu mẫu và vô trùng bề mặt lá.
+ Ngâm trong dung dịch thẩm thấu phù hợp.
+Loại bỏ biểu bì mặt dưới hoặc cắt mẫu lá thành các lát mỏng, tạo thuận lợi cho sự xâm nhập của các enzym.
+ Xử lý hỗn hợp enzym.
+Tinh sạch và thu nhận các tế bào trần.
+Chuyển tế bào trần vào các môi trường nuôi cấy thích hợp.
1.1.2.3. Phương pháp hỗn hợp:
-Sử dụng phương pháp cơ học để thu được 1 lượng lớn các tế bào tự do sau đó dùng enzyme thường được sử dụng để tách thu được tế bào trần. Thành tế bào cấu tạo gồm cellulose, hemicellulose, pectin và một lượng ít hơn là protein và lipit. Vì vậy cần một lượng hỗn hợp cả 3 loại enzym cellulaza, pectinaza hemicellulaza ở những tỷ lệ khác nhau.
-Một số loại enzym thường dùng:
1.1.3. Xác định chất lượng của tế bào trần
Các tế bào trần đều có dạng hình cầu khi quan sát dưới kính hiển vi.
-Bước 1: Xác định xem còn thành tế bào hay không?
Dùng calcofour để xác định .Calcofour bám vào các phân tử cellulose và gây ra phát ánh sáng huỳnh quang mầu xanh rực rỡ khi soi dưới tia cực tím.
Nếu các tế bào đã bị loại bỏ hoàn toàn thành tế bào, hiển vi trường có mầu tối thẫm, các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ của các lạp thể.
-Bước 2: Xác định khả năng sống sót của tế bào trần
Bởi vì quy trình tách tế bào trần thường làm tổn thương hoặc làm hỏng một tỷ lệ tế bào nên không thể thiếu bước này.
Có thể quan sát trực tiếp huyền phù tế bào trần dưới kính hiển vi ở vật kính 20x và 40x.
Tế bào chất của những tế bào xuất hiện ở dạng dòng chảy hoặc chuyển động tròn, trông như những hạt nhỏ trong nguyên sinh chất là những tế bào sống.
Ngược lại là những tế bào gần như bị chết do màng nguyên sinh chất bị phá huỷ.
- Bước 3: Xác định sức sống của tế bào trần:
+Dùng kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với nhuộm xanh evan.
Trộn 2 ml dung dịch thuốc nhuộm 1% + 10 ml môi trường tách tế bào trần.
Lấy 0,25 ml huyền phù tế bào trần và đưa vào 1 ml hỗn hợp dịch nhuộm trên, để trong 15 phút,
+Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Những tế bào còn nguyên vẹn sẽ ngăn không cho thuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất, còn những tế bào có màng nguyên sinh chất bị mất chức năng sẽ bắt màu xanh và chúng không thể sinh trưởng được.
+Kiểm tra tỷ lệ sống của tế bào trần:
Sử dụng fluorescein diacetat (FDA) ở thể tích 0,8ml dung dịch với 20ml môi trường chứa tế bào trần.
Khi soi dưới ánh sáng tử ngoại, tế bào trần còn sống sẽ phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh, những tế bào trần có màng sinh cất bị phá huỷ sẽ có màu sẫm hoặc màu tối.
1.1.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào trần
Các tế bào trần sau khi được tách từ mẫu thực vật sẽ được làm loãng trong môi trường lỏng
-Xác định mật độ tế bào trong buồng đếm hồng cầu.
+ Mật độ thích hợp cho nuôi cấy tế bào trần là104 -106 tế bào/ml môi trường
+Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp thành tế bào mới được tái tạo sau khoảng 48-96 giờ nuôi cấy.sau đó các tế bào sẽ bắt đầu phân chia và hình thành mô sẹo.khi được chuyển sang một môi trường mới các tế bào mô sẹo sẽ phát sinh phôi(sau khoảng 3-4 tuần nuôi cấy) rồi phát triển thành cây hoàn chỉnh.
-Ưu điểm: Nuôi cấy trong môi trường lỏng được sử dụng nhiều do có thể điều chỉnh được mật độ tế bào và áp suất thẩm thấu.một số loài thực vật tế bào trần không thể phân chia trên môi trường đặc.
II. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của tế bào trần
2.1. Môi trường nuôi cấy
- Trong quá trình phân lập và nuôi cấy, các tế bào trần cần được duy trì cân bằng áp lực thẩm thấu để tránh hiện tượng ưu trương hoặc nhược trương dẫn đến tình trạng tế bào trần bị vỡ hoặc teo lại.
-Các chất điều chỉnh áp lực thẩm thấu trong môi trường nuôi cấy tế bào trần và trong hỗn hợp enzyme là: sorbitol, mannitol, glucose, hoặc sucrose.
Các tế bào trần sẽ sinh trưởng ổn định hơn trong dung dịch được tăng nhẹ áp lực thẩm thấu.
- Để tránh gây độc và thúc đẩy sự phân bào thì nồng độ nitratamon = ¼- ½ hàm lượng nuôi cấy mô của tế bào bình thường.
Các môi trường nuôi mô và cơ quan bình thường có nồng độ Ca từ 0,5-0,3mM và ở những nồng độ thấp này, các tế bào trần bị ngưng kết và hoá nâu nhanh chóng.
Hàm lượng Ca phải tăng lên 14-40mM sẽ thúc đẩy phân bào sớm, tăng tính đồng bộ tế bào sẽ làm giảm sự ngưng kết và hoá nâu của tế bào trần trong giai đoạn sớm của nuôi cấy.
Thành phần Ca cung cấp trong môi trương MS ở dạng CaCl2.2H2O, Ca(H2PO4)2
-Thành phần hữa cơ như inositol, a.nicotinic, biotin, pyridoxy, thiamin, glyxin, axit folic, được bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
Trong đó cazein thuỷ phân,D-Ca pantothenat, cholin, chlorit,xystein, a.malic, axit ascobic, adenin sulfat …thường được đưa vào môi trường nuôi cấy 0.01 -10mg/l để đẩy nhanh sự sinh tổng hợp và thúc đẩy sự phân bào,
Đa số các thành phần này không được sử dụng sau khi tế bào trần đã được tái tạo thành tế bào mới và phân chia.
-Đường cung cấp là nguồn C và chất ổn định áp suất thẩm thấu như manitol,sorbitol (0.3-0.7M) trong khi sacarozo và glucozo là nguồn C ở hàm lượng từ 0.2-0.6M. Nồng độ đường được giảm dần sau khi các tế bào bắt đầu phân chia.
- Các chất điều hoà sinh trưởng là rất cần thiết cho trong nuôi cấy tế bào trần. Loại và nồng độ sử dụng là khác nhau giữa các loài và kiểu tái sinh. NAA 2,4-D có nồng độ từ 0,45 – 10,7um, trong khi cytokinin như zeatin và benzyl amino purin được dùng từ 2-5um.
VD:Đối với các tế bào trần thịt lá của ở ngũ cốc và đậu thì mannitol hoặc sorbitol là các nhân tố ổn định áp lực thẩm thấu thích hợp hơn cả, trong khi sucrose lại thích hợp hơn glucose hoặc mannitol trong nuôi cấy protoplast của khoai tây, đậu hoa (sweet pea), tước
mạch (brome grass) và sắn. Trong nuôi cấy dịch huyền phù thuốc lá, galactose và fructose đã được sử dụng để điều chỉnh áp lực thẩm thấu.
2.2. Điều kiện nuôi cấy
Khi chưa hình thành thành tế bào rất nhạy cảm với ánh sáng vì vậy chúng được nuôi cấy trong tối hoặc ánh sáng yếu cho đến khi tổng hợp xong thành tế bào sau đó chuyển dần ra nuôi ở mức ánh sáng cao hơn. Ánh sáng trắng và xanh thì tốt hơn so với ánh sáng đỏ trong nuôi cấy tế bào trần. Giai đoạn hình thành mô sẹo thì đưa ra ánh sáng bình thường .
Quá trình nuôi cấy tế bào trần được duy trì ở nhiệt độ từ 20-250C
2.3. Mật độ nuôi cấy
Mật độ nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của tế bào trần
VD: Nuôi cấy thuốc lá ở mật độ 5.104 tb/ml cho hiệu quả tốt nhất. Khi giảm còn 5.105 tb/ml tế bào trần không phân chia
1.3.Ứng dụng của tế bào trần
-Chọn dòng tế bào
-Dung hợp protoplast để lai vô tính tế bào thực vật
-Biến nạp di truyền, đưa các cơ quan tử, virut, DNA ngoại lai vào tế bào thực vật.
-Là hệ thống lý tưởng cho nghiên cứu sinh tổng hợp thành tế bào
1.3.1.Ưu điểm
-Thao tác thực hiện thuận lợi
-có thể thao tác đột biến và tách quần thể tế bào thực vật, chọn được dòng tế bào riêng rẽ.
-Có thể chuyển gen được dễ dàng hơn vào hệ gen nhân hoặc vào các bào quan.
-Tạo ra những sinh vật mới biến đổi gen ,tạo thể lai tế bào chất hoặc thể lai gen.
-Sử dụng tế bào trần riêng rẽ cho phép loại bỏ mối tương tác với các tế bào bên cạnh và những thay đổi di truyền có điều kiện biểu hiện rõ ràng hơn.
1.3.2.Nhược điểm:
-Mới chỉ thành công ở họ cà solanacea, họ Brassiccaceac..
-Còn ở họ hoà thảo Gramineae là họ của các cây trồng ngũ cốc còn hạn chế
VD: Cây lúa là đối tượng thành công nhất trong nuôi cấy protoplast nhưng vẫn chỉ hạn chế ở các giông thuộc loài phụ. Japonica ,còn các giống lúa thuộc dưới chi
indica vẫn khó tái sinh thành công và trong số cây tái sinh được tỷ lệ bất thụ thường rất cao
-Cách dung hợp có thể tạo được giống mới do sự kết hợp những tính trạng tốt của hai loài tuy nhiên cách dung hợp này thường có sự loại bơt NST trong phân bào và không ổn định .
-cho đến nay người ta chỉ nhận được cây pomato là cây lai giữa cà chua và khoai tây và phải giữ giống khó khăn trong điều kiện thí nghiệm.
1.4 Thí nghiệm tách và nuôi cấy tế bào trần thuốc lá
1.4.1. Nguyên liệu thực vật
Lá của cây thuốc lá in vitro được chọn dùng làm nguyên liệu tách tế bào trần. Sử dụng các lá được tách trong ngày.
1.4.2. Chuẩn bị môi trường
Dung dịch enzyme tách protoplast:
+ Onozuka cellulase R10 0,5 %
+ Onozuka macerozyme R10 0,1 %
+ Mannitol 13,0 %
+ pH môi trường ~ 5,8
Dung dịch này được khử trùng bằng màng lọc Millipore loại có đường kính lỗ lọc 0,2-0,25 μm.
1.4.3 Tiến hành
* Ngày thứ nhất: Các mẫu lá thuốc lá in vitro được loại bỏ hết gân lá và đặt lên đĩa petri thủy tinh vô trùng. Dùng dao cấy băm nhỏ các mảnh lá. Cho các mảnh lá đã băm nhỏ vào cốc đong vô trùng loại 50 dung dịch enzyme tách protoplast. Bọc cốc đong bằng giấy parafilm, ghi nhãn và đặt trong tối qua đêm trên máy lắc ở tốc độ thấp (khoảng 40 vòng/phút).
* Ngày thứ hai: Dùng micropipette chuyển dịch tế bào trần lên lưới lọc vô trùng (Φ = 65μm) đặt trong cốc loại 50 ml. Bổ sung thêm 3 ml dung dịch rửa (PI + 10% mannitol) vào cốc chứa các mảnh lá vụn, lắc mạnh, và lọc tiếp trên lưới lọc rồi chuyển vào hỗn hợp protoplast-enzyme của bước trên. Bổ sung thêm 2 ml dung dịch rửa để rửa tế bào trần hết khỏi lưới lọc. Chuyển hỗn hợp protoplast-enzyme (tổng cộng 15 ml) vào tube ly
tâm loại 15 ml và ly tâm 50×g trong 10 phút.
+Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, tái huyền phù tiểu thể bằng 10ml dung dịch tách (PI + 20% sucrose), thêm 1ml dung dịch rửa lên trên bề mặt dung dịch tách và tế bào trần sao cho không làm hòa lẫn hai dung dịch, tốt nhất là tạo thành hai pha (nhỏ từ từ dung dịch rửa bên thành tube tránh bắn tung toé lên dịch rửa bên dưới), ly tâm 50×g trong 10 phút.
Các tế bào trần sống sót sẽ nằm ở trên bề mặt dung dịch.
+Dùng micropipette hút lớp tế bào trần màu xanh lục nổi trên tube ly tâm và chuyển nó sang một tube ly tâm sạch, thêm 10 ml dung dịch rửa và ly tâm lại, tế bào trần sẽ lắng xuống đáy tube và có dạng viên.
+Rửa tế bào trần thêm một lần nữa trong 10 ml dung dịch rửa.
+ Loại bỏ phần nổi trên mặt và tái huyền phù tế bào trần trong khoảng chừng 1 ml môi trường nuôi cấy tế bào trần (PC). Đặt một giọt tế bào trần trên buồng đếm hồng cầu và ước lượng mật độ tế bào trần (số lượng tế bào/số ô đếm ×10.000).
Nuôi cấy tế bào trần bằng cách pha loãng 50.000 tế bào/ml môi trường nuôi cấy tế bào trần và chuyển sang một đĩa petri vô trùng. Bọc lại, ghi nhãn và nuôi cấy qua đêm trong tối ở 280C .
* Ngày thứ ba:
Chuyển sang nuôi cấy ở ánh sáng yếu (10-20 μmol.sec/m2 hoặc bọc một lớp vảithưa dưới đèn hùynh quang ánh sáng trắng, với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ, nuôi trong 2 ngày.
* Ngày thứ năm:
Chuyển sang nuôi cấy ở cường độ ánh sáng cao hơn (50-75 μmol/sec/m2) trong 2 ngày bằng cách bỏ lớp vải thưa ra.
* Ngày thứ bảy Ghi lại kết quả của bài học nuôi cấy tế bào trần, số tế bào phân chia từ tổng số tế bào nuôi cấy ban đầu, trong một mẫu có 100-200 tế bào trần nuôi cấy. Có dấu hiệu của sự nhiễm bẩn không.
Các bước nuôi cấy tế bào trần
III. Dung hợp tế bào trần và lai tế bào xoma
Dung hợp là hiện tượng cắt đứt màng sinh chất nơi tiếp xúc giữa 2 tế bào trần khác loài do tác động của các nhân tố bên ngoài. Sau đó là sự tái tổ chức các màng ban đầu thành 1 và bao lấy tế bào chất và 2 nhân cha mẹ.
Khi 2 hoặc nhiều tế bào trần dung hợp ngẫu nhiên sẽ tạo một khối tế bào trần, trong đó nhân của chúng có thể kết hợp hoặc tồn tại riêng rẽ. Nếu hai nhân khác nhau sẽ tạo ra thể lai dị nhân ngược lại có thể lai đồng nhân. Sự kết hợp nhân trong thể dị nhân hình thành tế bào trần lai thực sự gọi là thể dị nhân. Nếu 1 trong 2 nhân bị đào thải, nguyên sinh chất của 2 tế bào trần sẽ dung hợp tạo ra thể lai tế bào chất cybrid (Cytoplasmid hybrid)
3.1. Các phương pháp dung hợp
3.1.1. Dung hợp tự phát:
-Khái niệm: là hiện tượng các tế bào trần ở cạnh nhau dung hợp với nhau.
-Đặc điểm: Trong quá trình phân cắt thành tế bào bằng enzym, các tế bào trần được hình thành từ những tế bào tiếp giáp với nhau có thể dung hợp với nhau qua cầu nối sinh chất. Việc loại bỏ thành tế bào đã làm cho các cầu nối sinh chất giữa các tế bào giãn nở to lên. Chất nguyên sinh và các
cơ quan từ hai hay nhiều tế bào có thể liên thông sang với nhau hình thành thể dung hợp
- Sự dung hợp tự phát chỉ xảy ra trong phạm vi 1 loài tức là những tế bào cùng loài ở cùng nhau trong quá trình tách. Hiện tượng này hiếm gặp do có sự tích điện âm trên bề mặt màng tế bào trần làm cho các tế bào đẩy nhau ra. Đây là nguyên nhân ngăn cản các tế bào trần tự kết hợp với nhau.
3.1.2. Dung hợp cảm ứng
3.1.2.1. Xử lý bằng NaNO3
Năm 1970, Power và cộng sự đã dùng NaNO3 (0,25 M) kích thích dung hợp hai protoplast. Carlson và cs (1972) cũng dùng phương pháp này để sản xuất cây lai soma đầu tiên (Nicotiana glauca × N. langsdorffii). Tuy nhiên, phương pháp này cho hiệu suất thấp vì NaNO3 không thích hợp với tế bào bị không bào hóa mạnh như tế bào trần từ nhu mô lá.
3.1.2.2. Xử lý bằng PEG
-Tác nhân kích thích dung hợp là PEG (polyethylen glycol).
+Khoảng 0,6 ml dung dịch PEG (hòa tan 1 g PEG mol. wt. 1500 trong 2 ml glucose 0,1 M, CaCl2 10 mM, và KH2PO4 0,7 mM) làm thành một giọt protoplast và chuyển lên đĩa petri.
+Sau khi đậy nắp, tế bào trần trong dung dịch PEG được nuôi ở nhiệt độ phòng trong 40 phút, pha loãng dung dịch PEG bằng cách bổ sung 0,5-1 ml môi trường nuôi cấy tế bào trần sau mỗi 10 phút.
+ Rửa tế bào trần với dung dịch không có tác nhân dung hợp bằng cách ly tâm và các tế bào trần được treo trở lại trong môi trường nuôi cấy.
-Nồng độ và trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự thành công của thí nghiệm dung hợp PEG có trọng lượng phân tử thấp (~ 100) không thể tạo ra một sự dính chặt chắc chắn, trong khi PEG
Tế bào xử lý bằng PEG
trọng lượng phân tử 6000 cho hiệu quả dung hợp cao hơn. PEG cùng với pH/Ca2+ có hiệu quả tăng tần số dung hợp và khả năng sống của các protoplast. Sau khi xử lý bằng tác nhân dung hợp, các protoplast được nuôi cấy theo phương thức chuẩn. PEG có 2 tác dụng: hoặc cung cấp một cầu nối để Ca2+ có thể liên kết các bề mặt màng với nhau hoặc dẫn đến sự rối loạn tích điện bề mặt màng trong suốt quá trình rửa giải.
3.1.2.3. Xử lý với nồng độ ion Ca+2 cao và pH cao
Hỗn hợp tế bào trần tách từ thịt lá được ủ trong môi trường kiềm mạnh có 0,05M CaCL2, 0,4M 9% (W/v) manitol, pH cao (8-10) và ly tâm nhẹ ở 50g trong 3 phút, tiếp theo đem ủ trong nước ở nhiệt độ 370C trong 45 phút. Bằng phương pháp này Keller và Melcher (1973) đã dung hợp thành công tế bào trần tách từ mô dậu của 2 dòng thuốc lá. Tuy nhiên pH cao có thể gây độc cho tế bào trần của một số loài thực vật.
3.1.2.4. Dung hợp bằng điện
Phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn dung hợp bằng hóa chất.
- Dung hợp bằng điện (electrofusion) không gây độc đối với tế bào như thường thấy ở các tế bào trần hoặc các thể dị nhân được xử lý bằng PEG.
Người ta đã dùng các xung điện (electric pulses) để đưa trực tiếp DNA ngoại lai vào trong tế bào thực vật, kỹ thuật này đã làm tăng sự quan tâm về việc ứng dụng dung hợp bằng điện vào lĩnh vực di truyền tế bào soma.
- Các nhà khoa học đã đưa ra một protocol có thể sử dụng rộng rãi.
Protocol này bao gồm 2 bước:
+Bước1: Các tế bào trần được đưa vào trong ngăn dung hợp nhỏ có 2 dây kim loại song song với nhau đóng vai trò là các điện cực.
+Bước 2:Tiếp đó, sử dụng điện áp thấp và trường điện từ AC dao động nhanh, kích thích các tế bào sắp thành từng chuỗi tế bào giữa các điện cực.
Sau khi các tế bào xếp hàng hoàn chỉnh, quá trình dung hợp được thực hiện theo từng đợt ngắn của xung DC điện áp cao. Xung DC điện áp cao tạo ra sự phá vỡ thuận nghịch của màng nguyên sinh chất ở vị trí tiếp xúc của các tế bào, tạo ra sự dung hợp và tái tổ chức lại màng một cách hợp lý.
Một quá trình hoàn chỉnh bắt đầu từ lúc đưa các tế bào trần vào bên trong ngăn và chuyển chúng lên môi trường nuôi cấy, có thể được hoàn chỉnh trong 5 phút hoặc ít hơn.
Hình 6. Các tế bào trần thịt lá của cây thuốc lá xếp thành chuỗi ngọc trai dưới ảnh hưởng của trường AC (100 V/cm, 0,6 MHz)
Các thể dị nhân hình thành nhờ dung hợp bằng điện đã phân chia trong môi trường nuôi cấy và có khả năng tái sinh chồi hoặc cây lai soma, bao gồm: Nicotiana tabacum (+) N. tabacum, N. plumbaginifolia (+) N. tabacum, N. glauca (+) N. langsdorfii, và Solanum tuberosum (+) S. phureja.
Một số tổ hợp lai protoplast đã hình thành callus như: Brassica napus (+) B. napus và Solanum brevidens (+) N. rustica.
3.2. Cơ sở tế bào học của dung hợp
-Dung hợp 2 tế bào trần mục đích tạo thành 2 thể lai hỗn hợp và xảy ra các hiện tượng như sau:
* Dung hợp tế bào chất và cơ quan tử nhưng không dung hợp nhân.
* Dung hợp tất cả.
Nếu dung hợp chỉ xảy ra tế bào chất và cơ quan tử các nhân vẫn giữ nguyên thì tạo thành thể lai tế bào chất (Cybrid). Còn trường hợp tế bào chất và nhân được dung hợp thì tạo tế bào lai thực sự (Hybrid)
- Dung hợp tế bào trần bao gồm 3 pha:
* Pha 1: Pha kết dính
Màng sinh chất của 2 hay nhiều tế bào trần tiến sát nhau.
* Pha 2: Pha Dung hợp màng tại những vùng nhỏ liên kết chặt dẫn đến hình thành tế bào chất liên tục hoặc cầu giữa các tế bào trần.
* Pha 3: Giãn nở của các cầu nguyên sinh chất và hình thành thể đồng nhân hoặc dị nhân hình cầu.
Sau khi dung hợp màng tế bào chất của 2 tế bào trần sẽ kết hợp với nhau khoảng vài giờ. Nếu ở thể dị nhân lai tế bào chất 2 nhân có thể phân bào đồng thời trên cùng 1 sợi thoi vô sắc chung nhưng các nhiễm sắc thể không đi cùng nhau. Kết quả tạo ra mô khảm sau đó có sự thoái hoá và phân ly 1 nhân tạo ra những tế bào chứa tế bào chất của cả 2
tế bào trần nhưng chỉ có 1 nhân.
Thể dị nhân chỉ duy trì ở 1 vài thế hệ tế bào, sau đó xảy ra dung hợp nhân ở gian kỳ hoặc ở lần nguyên phân đồng bộ đầu tiên.
Chỉ có những tế bào lai được tạo ra qua dung hợp nhân mới có khả năng tiếp tục phát triển.
-Trong các tế bào lai sự hợp nhất hoàn toàn genom từ 2 nguần thường không xảy ra. Sự đào thải dần dần nhiễm sắc thể của 1 trong các dạng cha mẹ. Kết quả của tế bào lai là 1 tế bào của 1 loài. Tế bào lai chỉ dùng trong thời gian ngắn, trong vòng 1 vài thế hệ.
Vd: Lai dòng tế bào lai giữa loài đỗ tương và thuốc lá thấy sự phân bào không bình thường xảy ra ở lần phân chia đầu tiên sau 1 tháng ở nhiễm sắc thể ở thuốc lá đã hiếm gặp và sau 7 tháng chỉ còn lại 1
số nhiễm sắc thể của thuốc lá còn tồn tại trong thể lai đồng thời các dòng tế bào lai có những đặc điểm giống với các dòng đỗ tương.
3.3. Lựa chọn sản phẩm dung hợp
-Sau khi dung hợp, quần thể tế bào trần sẽ gồm có các tế bào trần cha mẹ, thể đồng nhân, thể dị nhân và các sản phẩm dung hợp đa nhân. Vì vậy phải lựa chọn sản phẩm dung hợp tế bào trần đã được lai 1 cách hoàn thiện cả về tế bào chất và nhân.
-Có thể nhận biết sản phẩm dung hợp dựa vào các đặc điểm hình thái, gen đánh dấu, môi trường chọn lọc, dùng tế bào trần từ các loại mô khác nhau hoặc dùng phương pháp nhuộm bằng các chất phát huỳnh quang.
+Con lai xoma có thể được phân biệt nhờ những khác biệt tự nhiên giữa các dạng cha mẹ.Thường thì sản phẩm dung hợp tạo ra chồi màu tím đỏ.
VD: Khoai tây lai, cây khoai tây dại Solamum chacoense có các tế bào chứa sắc tố anthocyanin màu tím đỏ nhưng sinh trưởng rất kém trong môi trường nuôi cấy và không thể tái sinh thành được chồi. Khoai tây trồng Solamum tuberosum mang các đặc điểm trái ngược, có khả năng tạo chồi nhanh. Mô sẹo hình thành từ sản phẩm dung hợp sinh trưởng mạnh hơn mô sẹo từ các dạng cha mẹ và tạo ra các chồi màu tím đỏ.
+Các con lai cũng có thể được phát hiện qua môi trường sinh trưởng chọn lọc.
VD: 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N.langsdoffii đều không có khả năng sinh trưởng trên môi trường thiếu auxin. Nhưng sản phẩm dung hợp tế bào trần của 2 loài lại có khả năng tự dưỡng về auxin và sinh trưởng được trên môi trường không có auxin.
Sử dụng đột biến sinh hoá và lựa chọn thể lai xoma dựa trên sự hình thành các đặc điểm bổ xung.
VD: Kháng sinh actinomycin D được dùng để phát hiện sản phẩm dung hợp giữa 2 loài thuộc chi Petunia. Các tế bào nuôi cấy của loài Petunia hybrida không thể sinh trưởng được khi có actinomycin D. Ngược lại, những tế bào của loài P.parodii sinh trưởng trên môi trường có actinomycin D nhưng không thể tái sinh được cây từ mô sẹo nuôi cấy. Những tế bào vừa có thể sinh trưởng khi có kháng sinh vừa có khả năng tái sinh thành công là sản phẩm dung hợp của 2 dòng tế bào trần cha mẹ.
Khi không có đặc điểm bổ sung hoặc đột biến rõ rệt, có thể dùng phương pháp nhuộm hoá chất và nhận biết qua phát hiện huỳnh quang. Có 2 loại thuốc nhuộm được sử dụng là fluorescein isothiocyanate (FITC) có màu xanh và rhodamine isothiocyanate (RITC) có màu đỏ khi quan sát dưới kính hiển vi
huỳnh quang. Sản phẩm dung hợp của cả 2 sẽ có màu vàng và có thể tách ra để nuôi cấy trên môi trường thích hợp cho quá trình tạo mô sẹo và tái sinh.
3.4. Thí nghiệm dung hợp tế bào trần khoai tây
3.4.1 Nguyên liệu và thiết bị
_nguyên liệu lá cây khoai tây
_ Dầu khoáng thuốc nhuộm FITC và RITC (nồng độ 3,0mg/ml, pha trong ethanol).
_ Môi trường PEG.
_ Môi trường rửa có Ca2+.
_ Môi trường nuôi cấy tế bào trần và sản phẩm dung hợp của khoai tây.
3.4.2. Tiến hành
_ Tiến hành tách tế bào trần từ 2 giống khoai tây khác nhau. Nhuộm quần thể tế bào trần thứ nhất bằng FITC, và quần thể tế bào trần thứ 2 bằng RITC.
_ Lấy 1 giọt nhỏ dầu khoáng vô trùng cho vào giữu đĩa petri, đặt 1lamen vô trùng lên trên giọt dầu khoáng.
_ Nhỏ từng giọt môi trường PEG và xung quanh các tế bào trần (5giọt) và thêm 1 giọt nữa vào giữa quần thể tế bào trần. Giữ nhiệt độ phòng trong vòng 20-25 phút.
_ Thêm môi trường rửa chứa Ca2+ vào 1 phía của hỗn hợp tế bào trần: cứ 3 phút lại thêm từ từ 3 giọt và lặp lại thao tác này trong 20 phút. Trong khi ở phía đối diện dùng pipet loại bỏ 3 giọt môi trường chứa PEG và sự kết dính tế bào trần sẽ xảy ra trong quá trình rửa này.
_ Cho 3 giọt môi trường nuôi cấy vào 1 phía của hỗn hợp tế bào trần và 1 phía đối diện loại bỏ 1 phần môi trường rửa, lặp lại thao tác thêm 2 lần nữa. Tiếp tục lấy 1 số giọt môi trường cho vào phần đĩa xung quanh lamen để duy trì độ ẩm, sau đó nuôi cấy trong ánh sáng yếu ở nhiệt độ 250C.
_ Sau 2-7 ngày nuôi cấy, các tế bào trần cần được kiểm tra về sự tái tạo thành tế bào, sự phân bào và tần số dung hợp. Khi các tế bào phân chia và hình thành khối mô sẹo đang tăng trưởng, quần thể tế bào nuôi cấy cần được làm loãng bằng môi trường mới với hàm lượng khoáng cao hơn và có 0,6%agar (sau khoảng 2 tuần nuôi cấy)
_ Sau hơn 2 tuần nuôi cấy, có thể quan sát thấy cụm mô sẹo. Chúng có thể khác nhau về hình thái, màu sắc và kích thước. Những khối mô sẹo sinh trưởng nhanh hoạc có khác biệt rõ rệt có thể là dấu hiệu của con lai xoma.
Mở đầu
I. Nuôi cấy tế bào trần
1.1. Tách tế bào trần
1.2. Phương pháp tách
II. Các yếu tổ ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển chủa tế bào trần.
2.1. Môi trường nuôi cấy.
2.2. Điều kiện nuôi cấy.
2.3. Mật độ nuôi cấy.
2.4. Ứng dụng của tế bào trần.
III. Dung hợp tế bào trần.
3.1. Các phương pháp dung hợp.
3.1.1. Dung hợp tự phát (spontaneuouso fusion).
3.1.2 Dung hợp cảm ứng (inducd fusion)
3.2. Cơ sở tế bào học của dung hợp tế bào trần.
3.3 Lựa chọn sản phẩm dung hợp.
Mở đầu
Tế bào trần là tế bào thực vật bị loại bỏ vách bởi 1 xử lý enzyme. Đó là tế bào tự do, cô lập, không định hướng (vì không còn chịu sự tương quan trong hệ thống thực vật).
Dung hợp tế bào trần là sự hợp nhất của các tế bào sôma không có thành tế bào của các cá thể hoặc các loài khác nhau và sau đó tái sinh cây lai từ các tế bào đã dung hợp.
Vì sao lại chọn lai tế bào trần?
Lai hữu tính là phương pháp lai cỏ bản nhất để tạo ra biến dị tổ hợp thông qua dung hợp giao tử.
-Tuy nhiên lai hữu tính chỉ thực hiện được giữa các cá thể trong 1 loài hay các loài có quan hệ thân thuộc. Lai giữu các loài có quan hệ xa nhau thường rất khó khăn vì hàng rào cản trở việc lai xa làm giảm tính hữu dụng của kỹ thuật lai trong việc tăng nguần biến dị di truyền cần thiết cho việc cải thiện cây trồng.
- Nuôi cấy tế bào trần có ích lợi:
+ Giúp loại trừ tính bất thụ hữu tính, tạo cây lai hữu thụ.
+Giúp chuyển những đặc tính có lợi vào cây trồng, ít đòi hỏi phương tiện phức tạp, ít tốn kém, nhanh và trực tiếp.
+ Bằng thao tác di truyền ở tế bào trần có thể dễ dàng tạo ra các tế bào biến đổi gen. Tế bào với kiểu gen biến đổi sẽ được bảo tồn khi tái sinh tế bào thành cây hoàn chỉnh.
I. Nuôi cấy tế bào trần
1.1. Tách tế bào trần
1.1.1. Chọn nguyên liệu
- Thường sử dụng mô thịt lá trưởng thành ở những cây có tính trạng sinh lý tốt. Vì lá cây là nguần nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kỹ thuật protoplast thực vật, do nó cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất. Cũng có thể tách tế bào trần từ mô sẹo, bao phấn.
- Lấy lá ở ngoài tự nhiên thì phải từ những cây không bị xử lý với thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ.
- Những lá được tạo ra trong môi trường nuôi cấy invitro là vật liệu lý tưởng cung cấp 1 lượng lớn tế bào khoẻ mạnh.
1.1.2 Phương pháp tách:
Trước khi thành tế bào bị phá bỏ, các tế bào cần được ngâm trong dung dịch làm ổn định áp suất thẩm thấu và được điều chỉnh cẩn thận liên quan đến khả năng thẩm thấu tế bào. Thường sử dụng mannitol hoặc sorbitol 12-14% (W/v) để duy trì tính ổn định màng sinh chất.
Có 3 phương pháp tách:
1.1.2.1. Phương pháp tách bằng cơ học:
Cắt nhỏ nhu mô thịt lá rồi nghiền nhỏ cho vào dung dịch co nguyên sinh nên cả tế bào chất bị co nhỏ lại ngay lập tức cho vào dung dịch phản nguyên sinh, làm giãn nở 1 cách đột ngột đẩy phần nguyên sinh chất qua thành tế bào. Ta thu được tế bào trần.
+Ưu điểm: Dụng cụ đơn giản
+Nhược điểm: Khá phức tạp, hiệu quả thấp.
1.1.2.2.Phương pháp tách bằng enzyme:
Dùng enzym pectinase, hemicelolase, cellulase. Để phá vỡ thành tế bào có thể dùng riêng lẻ hoạc kết hợp tuỳ vào từng loại tế bào.
- Ưu điểm: Thu được lượng lớn các tế bào trần
-Các bước tiến hành như sau:
+Thu mẫu và vô trùng bề mặt lá.
+ Ngâm trong dung dịch thẩm thấu phù hợp.
+Loại bỏ biểu bì mặt dưới hoặc cắt mẫu lá thành các lát mỏng, tạo thuận lợi cho sự xâm nhập của các enzym.
+ Xử lý hỗn hợp enzym.
+Tinh sạch và thu nhận các tế bào trần.
+Chuyển tế bào trần vào các môi trường nuôi cấy thích hợp.
1.1.2.3. Phương pháp hỗn hợp:
-Sử dụng phương pháp cơ học để thu được 1 lượng lớn các tế bào tự do sau đó dùng enzyme thường được sử dụng để tách thu được tế bào trần. Thành tế bào cấu tạo gồm cellulose, hemicellulose, pectin và một lượng ít hơn là protein và lipit. Vì vậy cần một lượng hỗn hợp cả 3 loại enzym cellulaza, pectinaza hemicellulaza ở những tỷ lệ khác nhau.
-Một số loại enzym thường dùng:
1.1.3. Xác định chất lượng của tế bào trần
Các tế bào trần đều có dạng hình cầu khi quan sát dưới kính hiển vi.
-Bước 1: Xác định xem còn thành tế bào hay không?
Dùng calcofour để xác định .Calcofour bám vào các phân tử cellulose và gây ra phát ánh sáng huỳnh quang mầu xanh rực rỡ khi soi dưới tia cực tím.
Nếu các tế bào đã bị loại bỏ hoàn toàn thành tế bào, hiển vi trường có mầu tối thẫm, các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ của các lạp thể.
-Bước 2: Xác định khả năng sống sót của tế bào trần
Bởi vì quy trình tách tế bào trần thường làm tổn thương hoặc làm hỏng một tỷ lệ tế bào nên không thể thiếu bước này.
Có thể quan sát trực tiếp huyền phù tế bào trần dưới kính hiển vi ở vật kính 20x và 40x.
Tế bào chất của những tế bào xuất hiện ở dạng dòng chảy hoặc chuyển động tròn, trông như những hạt nhỏ trong nguyên sinh chất là những tế bào sống.
Ngược lại là những tế bào gần như bị chết do màng nguyên sinh chất bị phá huỷ.
- Bước 3: Xác định sức sống của tế bào trần:
+Dùng kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với nhuộm xanh evan.
Trộn 2 ml dung dịch thuốc nhuộm 1% + 10 ml môi trường tách tế bào trần.
Lấy 0,25 ml huyền phù tế bào trần và đưa vào 1 ml hỗn hợp dịch nhuộm trên, để trong 15 phút,
+Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Những tế bào còn nguyên vẹn sẽ ngăn không cho thuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất, còn những tế bào có màng nguyên sinh chất bị mất chức năng sẽ bắt màu xanh và chúng không thể sinh trưởng được.
+Kiểm tra tỷ lệ sống của tế bào trần:
Sử dụng fluorescein diacetat (FDA) ở thể tích 0,8ml dung dịch với 20ml môi trường chứa tế bào trần.
Khi soi dưới ánh sáng tử ngoại, tế bào trần còn sống sẽ phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh, những tế bào trần có màng sinh cất bị phá huỷ sẽ có màu sẫm hoặc màu tối.
1.1.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào trần
Các tế bào trần sau khi được tách từ mẫu thực vật sẽ được làm loãng trong môi trường lỏng
-Xác định mật độ tế bào trong buồng đếm hồng cầu.
+ Mật độ thích hợp cho nuôi cấy tế bào trần là104 -106 tế bào/ml môi trường
+Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp thành tế bào mới được tái tạo sau khoảng 48-96 giờ nuôi cấy.sau đó các tế bào sẽ bắt đầu phân chia và hình thành mô sẹo.khi được chuyển sang một môi trường mới các tế bào mô sẹo sẽ phát sinh phôi(sau khoảng 3-4 tuần nuôi cấy) rồi phát triển thành cây hoàn chỉnh.
-Ưu điểm: Nuôi cấy trong môi trường lỏng được sử dụng nhiều do có thể điều chỉnh được mật độ tế bào và áp suất thẩm thấu.một số loài thực vật tế bào trần không thể phân chia trên môi trường đặc.
II. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của tế bào trần
2.1. Môi trường nuôi cấy
- Trong quá trình phân lập và nuôi cấy, các tế bào trần cần được duy trì cân bằng áp lực thẩm thấu để tránh hiện tượng ưu trương hoặc nhược trương dẫn đến tình trạng tế bào trần bị vỡ hoặc teo lại.
-Các chất điều chỉnh áp lực thẩm thấu trong môi trường nuôi cấy tế bào trần và trong hỗn hợp enzyme là: sorbitol, mannitol, glucose, hoặc sucrose.
Các tế bào trần sẽ sinh trưởng ổn định hơn trong dung dịch được tăng nhẹ áp lực thẩm thấu.
- Để tránh gây độc và thúc đẩy sự phân bào thì nồng độ nitratamon = ¼- ½ hàm lượng nuôi cấy mô của tế bào bình thường.
Các môi trường nuôi mô và cơ quan bình thường có nồng độ Ca từ 0,5-0,3mM và ở những nồng độ thấp này, các tế bào trần bị ngưng kết và hoá nâu nhanh chóng.
Hàm lượng Ca phải tăng lên 14-40mM sẽ thúc đẩy phân bào sớm, tăng tính đồng bộ tế bào sẽ làm giảm sự ngưng kết và hoá nâu của tế bào trần trong giai đoạn sớm của nuôi cấy.
Thành phần Ca cung cấp trong môi trương MS ở dạng CaCl2.2H2O, Ca(H2PO4)2
-Thành phần hữa cơ như inositol, a.nicotinic, biotin, pyridoxy, thiamin, glyxin, axit folic, được bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
Trong đó cazein thuỷ phân,D-Ca pantothenat, cholin, chlorit,xystein, a.malic, axit ascobic, adenin sulfat …thường được đưa vào môi trường nuôi cấy 0.01 -10mg/l để đẩy nhanh sự sinh tổng hợp và thúc đẩy sự phân bào,
Đa số các thành phần này không được sử dụng sau khi tế bào trần đã được tái tạo thành tế bào mới và phân chia.
-Đường cung cấp là nguồn C và chất ổn định áp suất thẩm thấu như manitol,sorbitol (0.3-0.7M) trong khi sacarozo và glucozo là nguồn C ở hàm lượng từ 0.2-0.6M. Nồng độ đường được giảm dần sau khi các tế bào bắt đầu phân chia.
- Các chất điều hoà sinh trưởng là rất cần thiết cho trong nuôi cấy tế bào trần. Loại và nồng độ sử dụng là khác nhau giữa các loài và kiểu tái sinh. NAA 2,4-D có nồng độ từ 0,45 – 10,7um, trong khi cytokinin như zeatin và benzyl amino purin được dùng từ 2-5um.
VD:Đối với các tế bào trần thịt lá của ở ngũ cốc và đậu thì mannitol hoặc sorbitol là các nhân tố ổn định áp lực thẩm thấu thích hợp hơn cả, trong khi sucrose lại thích hợp hơn glucose hoặc mannitol trong nuôi cấy protoplast của khoai tây, đậu hoa (sweet pea), tước
mạch (brome grass) và sắn. Trong nuôi cấy dịch huyền phù thuốc lá, galactose và fructose đã được sử dụng để điều chỉnh áp lực thẩm thấu.
2.2. Điều kiện nuôi cấy
Khi chưa hình thành thành tế bào rất nhạy cảm với ánh sáng vì vậy chúng được nuôi cấy trong tối hoặc ánh sáng yếu cho đến khi tổng hợp xong thành tế bào sau đó chuyển dần ra nuôi ở mức ánh sáng cao hơn. Ánh sáng trắng và xanh thì tốt hơn so với ánh sáng đỏ trong nuôi cấy tế bào trần. Giai đoạn hình thành mô sẹo thì đưa ra ánh sáng bình thường .
Quá trình nuôi cấy tế bào trần được duy trì ở nhiệt độ từ 20-250C
2.3. Mật độ nuôi cấy
Mật độ nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của tế bào trần
VD: Nuôi cấy thuốc lá ở mật độ 5.104 tb/ml cho hiệu quả tốt nhất. Khi giảm còn 5.105 tb/ml tế bào trần không phân chia
1.3.Ứng dụng của tế bào trần
-Chọn dòng tế bào
-Dung hợp protoplast để lai vô tính tế bào thực vật
-Biến nạp di truyền, đưa các cơ quan tử, virut, DNA ngoại lai vào tế bào thực vật.
-Là hệ thống lý tưởng cho nghiên cứu sinh tổng hợp thành tế bào
1.3.1.Ưu điểm
-Thao tác thực hiện thuận lợi
-có thể thao tác đột biến và tách quần thể tế bào thực vật, chọn được dòng tế bào riêng rẽ.
-Có thể chuyển gen được dễ dàng hơn vào hệ gen nhân hoặc vào các bào quan.
-Tạo ra những sinh vật mới biến đổi gen ,tạo thể lai tế bào chất hoặc thể lai gen.
-Sử dụng tế bào trần riêng rẽ cho phép loại bỏ mối tương tác với các tế bào bên cạnh và những thay đổi di truyền có điều kiện biểu hiện rõ ràng hơn.
1.3.2.Nhược điểm:
-Mới chỉ thành công ở họ cà solanacea, họ Brassiccaceac..
-Còn ở họ hoà thảo Gramineae là họ của các cây trồng ngũ cốc còn hạn chế
VD: Cây lúa là đối tượng thành công nhất trong nuôi cấy protoplast nhưng vẫn chỉ hạn chế ở các giông thuộc loài phụ. Japonica ,còn các giống lúa thuộc dưới chi
indica vẫn khó tái sinh thành công và trong số cây tái sinh được tỷ lệ bất thụ thường rất cao
-Cách dung hợp có thể tạo được giống mới do sự kết hợp những tính trạng tốt của hai loài tuy nhiên cách dung hợp này thường có sự loại bơt NST trong phân bào và không ổn định .
-cho đến nay người ta chỉ nhận được cây pomato là cây lai giữa cà chua và khoai tây và phải giữ giống khó khăn trong điều kiện thí nghiệm.
1.4 Thí nghiệm tách và nuôi cấy tế bào trần thuốc lá
1.4.1. Nguyên liệu thực vật
Lá của cây thuốc lá in vitro được chọn dùng làm nguyên liệu tách tế bào trần. Sử dụng các lá được tách trong ngày.
1.4.2. Chuẩn bị môi trường
Dung dịch enzyme tách protoplast:
+ Onozuka cellulase R10 0,5 %
+ Onozuka macerozyme R10 0,1 %
+ Mannitol 13,0 %
+ pH môi trường ~ 5,8
Dung dịch này được khử trùng bằng màng lọc Millipore loại có đường kính lỗ lọc 0,2-0,25 μm.
1.4.3 Tiến hành
* Ngày thứ nhất: Các mẫu lá thuốc lá in vitro được loại bỏ hết gân lá và đặt lên đĩa petri thủy tinh vô trùng. Dùng dao cấy băm nhỏ các mảnh lá. Cho các mảnh lá đã băm nhỏ vào cốc đong vô trùng loại 50 dung dịch enzyme tách protoplast. Bọc cốc đong bằng giấy parafilm, ghi nhãn và đặt trong tối qua đêm trên máy lắc ở tốc độ thấp (khoảng 40 vòng/phút).
* Ngày thứ hai: Dùng micropipette chuyển dịch tế bào trần lên lưới lọc vô trùng (Φ = 65μm) đặt trong cốc loại 50 ml. Bổ sung thêm 3 ml dung dịch rửa (PI + 10% mannitol) vào cốc chứa các mảnh lá vụn, lắc mạnh, và lọc tiếp trên lưới lọc rồi chuyển vào hỗn hợp protoplast-enzyme của bước trên. Bổ sung thêm 2 ml dung dịch rửa để rửa tế bào trần hết khỏi lưới lọc. Chuyển hỗn hợp protoplast-enzyme (tổng cộng 15 ml) vào tube ly
tâm loại 15 ml và ly tâm 50×g trong 10 phút.
+Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, tái huyền phù tiểu thể bằng 10ml dung dịch tách (PI + 20% sucrose), thêm 1ml dung dịch rửa lên trên bề mặt dung dịch tách và tế bào trần sao cho không làm hòa lẫn hai dung dịch, tốt nhất là tạo thành hai pha (nhỏ từ từ dung dịch rửa bên thành tube tránh bắn tung toé lên dịch rửa bên dưới), ly tâm 50×g trong 10 phút.
Các tế bào trần sống sót sẽ nằm ở trên bề mặt dung dịch.
+Dùng micropipette hút lớp tế bào trần màu xanh lục nổi trên tube ly tâm và chuyển nó sang một tube ly tâm sạch, thêm 10 ml dung dịch rửa và ly tâm lại, tế bào trần sẽ lắng xuống đáy tube và có dạng viên.
+Rửa tế bào trần thêm một lần nữa trong 10 ml dung dịch rửa.
+ Loại bỏ phần nổi trên mặt và tái huyền phù tế bào trần trong khoảng chừng 1 ml môi trường nuôi cấy tế bào trần (PC). Đặt một giọt tế bào trần trên buồng đếm hồng cầu và ước lượng mật độ tế bào trần (số lượng tế bào/số ô đếm ×10.000).
Nuôi cấy tế bào trần bằng cách pha loãng 50.000 tế bào/ml môi trường nuôi cấy tế bào trần và chuyển sang một đĩa petri vô trùng. Bọc lại, ghi nhãn và nuôi cấy qua đêm trong tối ở 280C .
* Ngày thứ ba:
Chuyển sang nuôi cấy ở ánh sáng yếu (10-20 μmol.sec/m2 hoặc bọc một lớp vảithưa dưới đèn hùynh quang ánh sáng trắng, với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ, nuôi trong 2 ngày.
* Ngày thứ năm:
Chuyển sang nuôi cấy ở cường độ ánh sáng cao hơn (50-75 μmol/sec/m2) trong 2 ngày bằng cách bỏ lớp vải thưa ra.
* Ngày thứ bảy Ghi lại kết quả của bài học nuôi cấy tế bào trần, số tế bào phân chia từ tổng số tế bào nuôi cấy ban đầu, trong một mẫu có 100-200 tế bào trần nuôi cấy. Có dấu hiệu của sự nhiễm bẩn không.
Các bước nuôi cấy tế bào trần
III. Dung hợp tế bào trần và lai tế bào xoma
Dung hợp là hiện tượng cắt đứt màng sinh chất nơi tiếp xúc giữa 2 tế bào trần khác loài do tác động của các nhân tố bên ngoài. Sau đó là sự tái tổ chức các màng ban đầu thành 1 và bao lấy tế bào chất và 2 nhân cha mẹ.
Khi 2 hoặc nhiều tế bào trần dung hợp ngẫu nhiên sẽ tạo một khối tế bào trần, trong đó nhân của chúng có thể kết hợp hoặc tồn tại riêng rẽ. Nếu hai nhân khác nhau sẽ tạo ra thể lai dị nhân ngược lại có thể lai đồng nhân. Sự kết hợp nhân trong thể dị nhân hình thành tế bào trần lai thực sự gọi là thể dị nhân. Nếu 1 trong 2 nhân bị đào thải, nguyên sinh chất của 2 tế bào trần sẽ dung hợp tạo ra thể lai tế bào chất cybrid (Cytoplasmid hybrid)
3.1. Các phương pháp dung hợp
3.1.1. Dung hợp tự phát:
-Khái niệm: là hiện tượng các tế bào trần ở cạnh nhau dung hợp với nhau.
-Đặc điểm: Trong quá trình phân cắt thành tế bào bằng enzym, các tế bào trần được hình thành từ những tế bào tiếp giáp với nhau có thể dung hợp với nhau qua cầu nối sinh chất. Việc loại bỏ thành tế bào đã làm cho các cầu nối sinh chất giữa các tế bào giãn nở to lên. Chất nguyên sinh và các
cơ quan từ hai hay nhiều tế bào có thể liên thông sang với nhau hình thành thể dung hợp
- Sự dung hợp tự phát chỉ xảy ra trong phạm vi 1 loài tức là những tế bào cùng loài ở cùng nhau trong quá trình tách. Hiện tượng này hiếm gặp do có sự tích điện âm trên bề mặt màng tế bào trần làm cho các tế bào đẩy nhau ra. Đây là nguyên nhân ngăn cản các tế bào trần tự kết hợp với nhau.
3.1.2. Dung hợp cảm ứng
3.1.2.1. Xử lý bằng NaNO3
Năm 1970, Power và cộng sự đã dùng NaNO3 (0,25 M) kích thích dung hợp hai protoplast. Carlson và cs (1972) cũng dùng phương pháp này để sản xuất cây lai soma đầu tiên (Nicotiana glauca × N. langsdorffii). Tuy nhiên, phương pháp này cho hiệu suất thấp vì NaNO3 không thích hợp với tế bào bị không bào hóa mạnh như tế bào trần từ nhu mô lá.
3.1.2.2. Xử lý bằng PEG
-Tác nhân kích thích dung hợp là PEG (polyethylen glycol).
+Khoảng 0,6 ml dung dịch PEG (hòa tan 1 g PEG mol. wt. 1500 trong 2 ml glucose 0,1 M, CaCl2 10 mM, và KH2PO4 0,7 mM) làm thành một giọt protoplast và chuyển lên đĩa petri.
+Sau khi đậy nắp, tế bào trần trong dung dịch PEG được nuôi ở nhiệt độ phòng trong 40 phút, pha loãng dung dịch PEG bằng cách bổ sung 0,5-1 ml môi trường nuôi cấy tế bào trần sau mỗi 10 phút.
+ Rửa tế bào trần với dung dịch không có tác nhân dung hợp bằng cách ly tâm và các tế bào trần được treo trở lại trong môi trường nuôi cấy.
-Nồng độ và trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự thành công của thí nghiệm dung hợp PEG có trọng lượng phân tử thấp (~ 100) không thể tạo ra một sự dính chặt chắc chắn, trong khi PEG
Tế bào xử lý bằng PEG
trọng lượng phân tử 6000 cho hiệu quả dung hợp cao hơn. PEG cùng với pH/Ca2+ có hiệu quả tăng tần số dung hợp và khả năng sống của các protoplast. Sau khi xử lý bằng tác nhân dung hợp, các protoplast được nuôi cấy theo phương thức chuẩn. PEG có 2 tác dụng: hoặc cung cấp một cầu nối để Ca2+ có thể liên kết các bề mặt màng với nhau hoặc dẫn đến sự rối loạn tích điện bề mặt màng trong suốt quá trình rửa giải.
3.1.2.3. Xử lý với nồng độ ion Ca+2 cao và pH cao
Hỗn hợp tế bào trần tách từ thịt lá được ủ trong môi trường kiềm mạnh có 0,05M CaCL2, 0,4M 9% (W/v) manitol, pH cao (8-10) và ly tâm nhẹ ở 50g trong 3 phút, tiếp theo đem ủ trong nước ở nhiệt độ 370C trong 45 phút. Bằng phương pháp này Keller và Melcher (1973) đã dung hợp thành công tế bào trần tách từ mô dậu của 2 dòng thuốc lá. Tuy nhiên pH cao có thể gây độc cho tế bào trần của một số loài thực vật.
3.1.2.4. Dung hợp bằng điện
Phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn dung hợp bằng hóa chất.
- Dung hợp bằng điện (electrofusion) không gây độc đối với tế bào như thường thấy ở các tế bào trần hoặc các thể dị nhân được xử lý bằng PEG.
Người ta đã dùng các xung điện (electric pulses) để đưa trực tiếp DNA ngoại lai vào trong tế bào thực vật, kỹ thuật này đã làm tăng sự quan tâm về việc ứng dụng dung hợp bằng điện vào lĩnh vực di truyền tế bào soma.
- Các nhà khoa học đã đưa ra một protocol có thể sử dụng rộng rãi.
Protocol này bao gồm 2 bước:
+Bước1: Các tế bào trần được đưa vào trong ngăn dung hợp nhỏ có 2 dây kim loại song song với nhau đóng vai trò là các điện cực.
+Bước 2:Tiếp đó, sử dụng điện áp thấp và trường điện từ AC dao động nhanh, kích thích các tế bào sắp thành từng chuỗi tế bào giữa các điện cực.
Sau khi các tế bào xếp hàng hoàn chỉnh, quá trình dung hợp được thực hiện theo từng đợt ngắn của xung DC điện áp cao. Xung DC điện áp cao tạo ra sự phá vỡ thuận nghịch của màng nguyên sinh chất ở vị trí tiếp xúc của các tế bào, tạo ra sự dung hợp và tái tổ chức lại màng một cách hợp lý.
Một quá trình hoàn chỉnh bắt đầu từ lúc đưa các tế bào trần vào bên trong ngăn và chuyển chúng lên môi trường nuôi cấy, có thể được hoàn chỉnh trong 5 phút hoặc ít hơn.
Hình 6. Các tế bào trần thịt lá của cây thuốc lá xếp thành chuỗi ngọc trai dưới ảnh hưởng của trường AC (100 V/cm, 0,6 MHz)
Các thể dị nhân hình thành nhờ dung hợp bằng điện đã phân chia trong môi trường nuôi cấy và có khả năng tái sinh chồi hoặc cây lai soma, bao gồm: Nicotiana tabacum (+) N. tabacum, N. plumbaginifolia (+) N. tabacum, N. glauca (+) N. langsdorfii, và Solanum tuberosum (+) S. phureja.
Một số tổ hợp lai protoplast đã hình thành callus như: Brassica napus (+) B. napus và Solanum brevidens (+) N. rustica.
3.2. Cơ sở tế bào học của dung hợp
-Dung hợp 2 tế bào trần mục đích tạo thành 2 thể lai hỗn hợp và xảy ra các hiện tượng như sau:
* Dung hợp tế bào chất và cơ quan tử nhưng không dung hợp nhân.
* Dung hợp tất cả.
Nếu dung hợp chỉ xảy ra tế bào chất và cơ quan tử các nhân vẫn giữ nguyên thì tạo thành thể lai tế bào chất (Cybrid). Còn trường hợp tế bào chất và nhân được dung hợp thì tạo tế bào lai thực sự (Hybrid)
- Dung hợp tế bào trần bao gồm 3 pha:
* Pha 1: Pha kết dính
Màng sinh chất của 2 hay nhiều tế bào trần tiến sát nhau.
* Pha 2: Pha Dung hợp màng tại những vùng nhỏ liên kết chặt dẫn đến hình thành tế bào chất liên tục hoặc cầu giữa các tế bào trần.
* Pha 3: Giãn nở của các cầu nguyên sinh chất và hình thành thể đồng nhân hoặc dị nhân hình cầu.
Sau khi dung hợp màng tế bào chất của 2 tế bào trần sẽ kết hợp với nhau khoảng vài giờ. Nếu ở thể dị nhân lai tế bào chất 2 nhân có thể phân bào đồng thời trên cùng 1 sợi thoi vô sắc chung nhưng các nhiễm sắc thể không đi cùng nhau. Kết quả tạo ra mô khảm sau đó có sự thoái hoá và phân ly 1 nhân tạo ra những tế bào chứa tế bào chất của cả 2
tế bào trần nhưng chỉ có 1 nhân.
Thể dị nhân chỉ duy trì ở 1 vài thế hệ tế bào, sau đó xảy ra dung hợp nhân ở gian kỳ hoặc ở lần nguyên phân đồng bộ đầu tiên.
Chỉ có những tế bào lai được tạo ra qua dung hợp nhân mới có khả năng tiếp tục phát triển.
-Trong các tế bào lai sự hợp nhất hoàn toàn genom từ 2 nguần thường không xảy ra. Sự đào thải dần dần nhiễm sắc thể của 1 trong các dạng cha mẹ. Kết quả của tế bào lai là 1 tế bào của 1 loài. Tế bào lai chỉ dùng trong thời gian ngắn, trong vòng 1 vài thế hệ.
Vd: Lai dòng tế bào lai giữa loài đỗ tương và thuốc lá thấy sự phân bào không bình thường xảy ra ở lần phân chia đầu tiên sau 1 tháng ở nhiễm sắc thể ở thuốc lá đã hiếm gặp và sau 7 tháng chỉ còn lại 1
số nhiễm sắc thể của thuốc lá còn tồn tại trong thể lai đồng thời các dòng tế bào lai có những đặc điểm giống với các dòng đỗ tương.
3.3. Lựa chọn sản phẩm dung hợp
-Sau khi dung hợp, quần thể tế bào trần sẽ gồm có các tế bào trần cha mẹ, thể đồng nhân, thể dị nhân và các sản phẩm dung hợp đa nhân. Vì vậy phải lựa chọn sản phẩm dung hợp tế bào trần đã được lai 1 cách hoàn thiện cả về tế bào chất và nhân.
-Có thể nhận biết sản phẩm dung hợp dựa vào các đặc điểm hình thái, gen đánh dấu, môi trường chọn lọc, dùng tế bào trần từ các loại mô khác nhau hoặc dùng phương pháp nhuộm bằng các chất phát huỳnh quang.
+Con lai xoma có thể được phân biệt nhờ những khác biệt tự nhiên giữa các dạng cha mẹ.Thường thì sản phẩm dung hợp tạo ra chồi màu tím đỏ.
VD: Khoai tây lai, cây khoai tây dại Solamum chacoense có các tế bào chứa sắc tố anthocyanin màu tím đỏ nhưng sinh trưởng rất kém trong môi trường nuôi cấy và không thể tái sinh thành được chồi. Khoai tây trồng Solamum tuberosum mang các đặc điểm trái ngược, có khả năng tạo chồi nhanh. Mô sẹo hình thành từ sản phẩm dung hợp sinh trưởng mạnh hơn mô sẹo từ các dạng cha mẹ và tạo ra các chồi màu tím đỏ.
+Các con lai cũng có thể được phát hiện qua môi trường sinh trưởng chọn lọc.
VD: 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N.langsdoffii đều không có khả năng sinh trưởng trên môi trường thiếu auxin. Nhưng sản phẩm dung hợp tế bào trần của 2 loài lại có khả năng tự dưỡng về auxin và sinh trưởng được trên môi trường không có auxin.
Sử dụng đột biến sinh hoá và lựa chọn thể lai xoma dựa trên sự hình thành các đặc điểm bổ xung.
VD: Kháng sinh actinomycin D được dùng để phát hiện sản phẩm dung hợp giữa 2 loài thuộc chi Petunia. Các tế bào nuôi cấy của loài Petunia hybrida không thể sinh trưởng được khi có actinomycin D. Ngược lại, những tế bào của loài P.parodii sinh trưởng trên môi trường có actinomycin D nhưng không thể tái sinh được cây từ mô sẹo nuôi cấy. Những tế bào vừa có thể sinh trưởng khi có kháng sinh vừa có khả năng tái sinh thành công là sản phẩm dung hợp của 2 dòng tế bào trần cha mẹ.
Khi không có đặc điểm bổ sung hoặc đột biến rõ rệt, có thể dùng phương pháp nhuộm hoá chất và nhận biết qua phát hiện huỳnh quang. Có 2 loại thuốc nhuộm được sử dụng là fluorescein isothiocyanate (FITC) có màu xanh và rhodamine isothiocyanate (RITC) có màu đỏ khi quan sát dưới kính hiển vi
huỳnh quang. Sản phẩm dung hợp của cả 2 sẽ có màu vàng và có thể tách ra để nuôi cấy trên môi trường thích hợp cho quá trình tạo mô sẹo và tái sinh.
3.4. Thí nghiệm dung hợp tế bào trần khoai tây
3.4.1 Nguyên liệu và thiết bị
_nguyên liệu lá cây khoai tây
_ Dầu khoáng thuốc nhuộm FITC và RITC (nồng độ 3,0mg/ml, pha trong ethanol).
_ Môi trường PEG.
_ Môi trường rửa có Ca2+.
_ Môi trường nuôi cấy tế bào trần và sản phẩm dung hợp của khoai tây.
3.4.2. Tiến hành
_ Tiến hành tách tế bào trần từ 2 giống khoai tây khác nhau. Nhuộm quần thể tế bào trần thứ nhất bằng FITC, và quần thể tế bào trần thứ 2 bằng RITC.
_ Lấy 1 giọt nhỏ dầu khoáng vô trùng cho vào giữu đĩa petri, đặt 1lamen vô trùng lên trên giọt dầu khoáng.
_ Nhỏ từng giọt môi trường PEG và xung quanh các tế bào trần (5giọt) và thêm 1 giọt nữa vào giữa quần thể tế bào trần. Giữ nhiệt độ phòng trong vòng 20-25 phút.
_ Thêm môi trường rửa chứa Ca2+ vào 1 phía của hỗn hợp tế bào trần: cứ 3 phút lại thêm từ từ 3 giọt và lặp lại thao tác này trong 20 phút. Trong khi ở phía đối diện dùng pipet loại bỏ 3 giọt môi trường chứa PEG và sự kết dính tế bào trần sẽ xảy ra trong quá trình rửa này.
_ Cho 3 giọt môi trường nuôi cấy vào 1 phía của hỗn hợp tế bào trần và 1 phía đối diện loại bỏ 1 phần môi trường rửa, lặp lại thao tác thêm 2 lần nữa. Tiếp tục lấy 1 số giọt môi trường cho vào phần đĩa xung quanh lamen để duy trì độ ẩm, sau đó nuôi cấy trong ánh sáng yếu ở nhiệt độ 250C.
_ Sau 2-7 ngày nuôi cấy, các tế bào trần cần được kiểm tra về sự tái tạo thành tế bào, sự phân bào và tần số dung hợp. Khi các tế bào phân chia và hình thành khối mô sẹo đang tăng trưởng, quần thể tế bào nuôi cấy cần được làm loãng bằng môi trường mới với hàm lượng khoáng cao hơn và có 0,6%agar (sau khoảng 2 tuần nuôi cấy)
_ Sau hơn 2 tuần nuôi cấy, có thể quan sát thấy cụm mô sẹo. Chúng có thể khác nhau về hình thái, màu sắc và kích thước. Những khối mô sẹo sinh trưởng nhanh hoạc có khác biệt rõ rệt có thể là dấu hiệu của con lai xoma.
* Một số tài liệu cũ có thể bị lỗi font khi hiển thị do dùng bộ mã không phải Unikey ...
Người chia sẻ: Lý Văn Phan
Dung lượng: |
Lượt tài: 2
Loại file:
Nguồn : Chưa rõ
(Tài liệu chưa được thẩm định)