Dòng hóa và chuyển gen ở Bò
Chia sẻ bởi Nguyễn Trần Nam An |
Ngày 24/10/2018 |
52
Chia sẻ tài liệu: Dòng hóa và chuyển gen ở Bò thuộc Bài giảng khác
Nội dung tài liệu:
ĐẶT VẤN ĐỀ
II. CỞ SỞ SINH HỌC
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
V.ỨNG DỤNG CỦA DÒNG HÓA BÒ
VI.CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Tạo sao lại dùng kỹ thuật chuyển nhân ?
Dòng đơn là gì?
Tại sao cần tạo ra dòng đơn?
Tạo dòng đơn bằng phương pháp nào ?
1.2 . Kỹ thuật chuyển nhân gồm những bước cơ bản nào ?
2
ĐẶT VẤN ĐỀ (tt)
1.1. Tạo sao lại dùng kỹ thuật chuyển nhân ?
Dòng đơn là gì?
là một nhóm gồm 2 cá thể trở lên với bộ máy di truyền giống được tạo nên bởi sinh sản vô tính hoặc hữu tính từ một cha hoặc một mẹ.
Tại sao cần tạo ra dòng đơn?
vì cần có một mô hình giống nhau về di truyền
3
ĐẶT VẤN ĐỀ (tt)
1.1. Tạo sao lại dùng kỹ thuật chuyển nhân ? (tt)
Tạo dòng đơn bằng phương pháp nào ?
cắt phôi ở giai đoạn sớm
chuyển nhân
Hình 1.1: cắt phôi ở giai đoạn sớm tạo dòng đơn
4
ĐẶT VẤN ĐỀ (tt)
1.2. Kỹ thuật chuyển nhân gồm những bước cơ bản nào ?
Chuẩn bị, xử lý tế bào cho nhân và tế bao nhận nhân.
2. Loại bỏ nhân của tế bào nhận
3. Chuyển nhân từ tế bào cho vào tế bào nhận
4. Tái kết cấu
5. Nuôi tế bào đã được tái kết cấu trong môi trường in vitro
5
II. CỞ SỞ SINH HỌC
2.1. Chu kì tế bào
2.2. Sự hình thành tế bào trứng
2.3. Thụ tinh – hình thành phôi
6
II. CỞ SỞ SINH HỌC
2.1. Chu kì tế bào
7
G0 là thời kì tế bào ở trạng thái “nghỉ ngơi”, nó là khoảng thời gian cuối thời kì G1
Hình 2.1: Chu kì tế bào
Hình 2.2: Sơ đồ cấu tạo buồng trứng động vật có vú
II. CỞ SỞ SINH HỌC
2.2. Sự hình thành tế bào trứng
tiền tế bào trứng nằm trong nang trứng, tăng dần kích thước từ nang nguyên thủy đến nang bậc 1, bậc 2 (đã có xoang), nang chín (còn gọi là bao Graaf) giải phóng trứng
8
Hình 2.3: Sơ đồ đường di chuyển của trứng ở động vật có vú
Ở đầu ống dẫn trứng, tế bào trứng được thụ tinh và di chuyển chậm xuống tử cung. Trong khi di chuyển, xảy ra các quá trình kết hợp nhân nguyên đực và cái, phân cắt thành 2 – 4 – 8 – 16 – 32 tế bào và tạo phôi dâu.
II. CỞ SỞ SINH HỌC
2.3. Thụ tinh – hình thành phôi
9
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận
3.1.2. Xử lý tế bào cho
3.1.3. Tái kết cấu
3.1.4. Nuôi cấu in vitro noãn đã được tái kết cấu
3.2. Sự tương tác giữa tế bào chất và nhân
3.3. Hiệu quả dòng hóa phôi trên bò
10
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI (tt)
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận
Noãn ở giai đoạn MII (metaphase II) được cho là lý tưởng cho việc chuẩn bị tế bào chất vì:
+ ở trạng thái dễ tách nhân
+ thuận lợi cho việc tái lập chương trình nhân
Tái kết cấu nhân là gì ?
là sự hợp nhất và tổ chức lại giữa nhân được chuyển và noãn nhận tạo thành dạng một tế bào đúng nghĩa gồm nhân và tế bào chất của nó.
Sự tái lập chương trình của nhân (Reprogramming) là gì?
Là hiện tượng khi được chuyển vào noãn nhận, nhân sẽ bị quay ngược chức năng để trở về giai đoạn đầu tiên để đóng vai trò chức năng nhân của một hợp tử.
11
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận (tt)
- Tiến trình chuẩn hiện nay là tạo các noãn MII từ buồng trứng được lấy ở lò mổ và đưa về phòng thí nghiệm trong dung dịch đệm vô trùng. Từ nang noãn có xoang với đường kính 2-8 mm, phức hợp trứng – tế bào ổ (cymulus-oocyte, COC) nguyên vẹn được hút ra.
12
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận (tt)
Chọn COC nguyên vẹn với vài lớp tế bào ổ dày và nuôi cấy in vitro trong 22-24 giờ ở môi trường nuôi trưởng thành có bổ xung huyết thanh phôi bò, FSH, LH và estradiol-17 (là một trong 3 nhóm chính của hormon estrogen gồm estradiol, estriol, estrol).
(Cơ chế hoạt động của các chất này chưa được hiểu rõ, thường thêm vào theo quy trình)
13
Thông thường hơn 80% noãn nuôi cấy có thể trưởng thành in vitro và đạt trung kì II (xuất hiện thể cực thứ nhất)
*cumulus oophorus: mấu mang trứng để bám vào nang buồng trứng(ovarian follicle)
*zona pellucida: màng trong suốt
Hình 3.2: Tế bào trứng
14
Noãn chưa trưởng thành cũng có thể được thu thập in vivo lập lại nhiều lần trên cùng một thú bằng cách dùng siêu âm để hướng dẫn bị trí hút (OPU = ovum pick up)
Hình 3.3: Sử dụng máy siêu âm để thu thập noãn in vivo
15
Để chuẩn bị tế bào chất nhận, chất liệu di truyền từ noãn trưởng thành (nhiễm sắc thể và thể cực) phải được loại bỏ.
Hình 3.5: Trứng ở giai đoạn MII. Một pipet được đưa qua vùng trong suốt và thể cực thứ nhất cùng với vùng tế bào chất bên dưới có chứa đĩa trung kì được hút vào pipet và bỏ đi.
(mũi tên chỉ thể cực thứ nhất)
Hình 3.4: Đĩa trung kì
16
Hai khó khăn về kĩ thuật đã được giải quyết
Dùng cytochalasin để màng noãn đủ mềm để có thể đưa micropipet qua mà không làm vỡ màng tế bào.
Dùng những thuốc nhuộm đặc biệt (Hoechst 33342) hoặc đánh dấu huỳnh quang để giúp quan sát đĩa trung kì được rõ hơn.
17
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận
3.1.2. Xử lý tế bào cho
tế bào cho thường được tách từ phôi dâu đặc (có thể được sản xuất từ in vivo hoặc in vitro). Ở giai đoạn này, phôi chứa 30-60 tế bào toàn năng chưa biệt hóa.
Hình 3.6: Phôi 1- 2 – 4 – 8 -16 tế bào
18
Hình 3.7: Phôi ở giai đoạn 8 tế bào được giữ tại chỗ bởi lực hút từ pipet bên trái và pipet chuyển (bên phải) được đưa qua màng trong suốt và một phôi bào được hút vào pipet.
19
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận
3.1.2. Xử lý tế bào cho
3.1.3. Tái kết cấu
- Tế bào cho (tế bào của phôi cho hoặc tế bào sinh dưỡng) được hút từng cái vào micropipet và được chuyển vào dưới màng trong suốt của mỗi noãn đã bỏ nhân.
Hình 3.8: Tế bào phôi được chuyển vào noãn nhận (mũi tên chỉ nhân của phôi bào)
20
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận
3.1.2. Xử lý tế bào cho
3.1.3. Tái kết cấu (tt)
Hình 3.9: Sau khi chuyển nhân tế bào cho và nhận được cho phục hồi lại dạng hình cầu trước khi hợp nhất bằng điện (electrofusion) (mũi tên chỉ phôi bào đã được chuyển). Độ phóng đại 400X. (Prather et al., 1987)
21
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận
3.1.2. Xử lý tế bào cho
3.1.3. Tái kết cấu (tt)
Sau khi chuyển tế bào, bộ noãn-tế bào cho được hợp nhất để giúp nhân của tế bào cho đi vào tế bào chất của noãn nhận. Được thực hiện bằng kỹ thuật hợp nhất bằng điện (electrofusion)
22
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận
3.1.2. Xử lý tế bào cho
3.1.3. Tái kết cấu (tt)
(A) Sơ đồ minh họa thao tác chuyển nhân và tái kết cấu
(B) Noãn-tế bào cho được đặt giữa hai điện cực
(C) 30 phút sau khi được hoạt hóa
Hình 3.10: Tái kết cấu bộ noãn-tế bào cho
23
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận
3.1.2. Xử lý tế bào cho
3.1.3. Tái kết cấu
3.1.4. Nuôi cấu in vitro noãn đã được tái kết cấu
Mục đích: noãn tái kết cấu sẽ phát triển đến thời kì phôi nang để từ phôi nang tạo thành con non.
Noãn tái kết cấu được nuôi trong môi trường hóa học hoặc môi trường đồng nuôi cấy với tế bào Vero.
24
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.2. Sự tương tác giữa tế bào chất và nhân
Nếu chuyển nhân của phôi cho vào noãn ở thời kì MII trước khi hợp nhất thì tế bào sẽ phát triển kém.
Người ta cho rằng: có thể do tế bào bị hư hại khi chất nhiễm sắc cô đặc sớm có nhiều yếu tố trưởng thành (maturation promoting factor, MPF) ở thời kì MII.
Yếu tố trưởng thành (MPF) là gì ?
25
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.2. Sự tương tác giữa tế bào chất và nhân (tt)
Yếu tố trưởng thành (MPF) là gì ?
Yếu tố trưởng thành còn có tên gọi là H1 kinase (CDC2 protein = p34 kinase)
Hoạt động như một tác nhân điều hòa của giai đoạn Metaphase. Nó chịu trách nhiệm làm vỡ màng nhân và cô đặc nhiễm sắc thể, ngăn cản quá trình tái kết cấu của nhân cho và tế bào chất của noãn.
26
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.2. Sự tương tác giữa tế bào chất và nhân (tt)
Yếu tố trưởng thành (MPF) là gì ? (tt)
Hoạt tính của MPF xuất hiện trong thời gian ngắn trước khi vỡ màng nhân, nó duy trì ở mức độ cao trong kì MI, giảm trước khi thể cực 1 xuất hiện và gia tăng trong thời kì MII.
MPF liên kết với cấu trúc p62 (protein Cylin B, 62 KDa) thành dạng hoạt hóa. Do đó ta hoạt hóa noãn bằng cách phân hủy cylin làm giảm MPF cho phép noãn ở giai đoạn MII hoàn tất quá trình phân chia.
27
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.2. Sự tương tác giữa tế bào chất và nhân (tt)
Vài tác giả cho thấy nếu hoạt hóa tế bào chất nhận trước trước khi hợp nhất thì không xảy ra sự cô đặc chất nhiễm sắc và phát triển tốt sau hợp nhất.
Người ta có thể tiền hoạt hóa bằng điện hoặc hóa chất (ethanol/cyloheximide hoặc calcium ionophore, rồi ủ với 6-dimethylaminopurine (6-DMAP)).
Việc tiền hoạt hóa tế bào chất nhận vào thời điểm chuyển nhân đã cải thiện sự phát triển in vitro của phôi chuyển nhân đến giai đoạn phôi nang . Khi sử dụng dòng điện để tái kết cấu thì cũng đồng thời hoạt hóa noãn.
28
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.2. Sự tương tác giữa tế bào chất và nhân
3.3. Hiệu quả dòng hóa phôi trên bò
Sự phát triển in vivo của phôi chuyển nhân còn giới hạn và thấp hơn so với phôi IVF.
Số thú mỗi lần dòng hoá thấp (tối đa 5 cá thể giống nhau từ 1 phôi cho), số thú dòng hoá nhiều đợt lớn nhất ở bò là 11 do: tỉ lệ đậu thai thấp, sau khi chuyển nhân, nhân bị biến động khi tái kết cấu và tỉ lệ phôi nang phát triển thành bê non là 20 – 30%.
Tóm lại hiệu quả chung là 10% nghĩa là từ 100 phôi dòng hoá chỉ tạo ra 10 con bê non.
29
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
Tại sao phải dòng hóa tế bào sinh dưỡng ?
4.1. Chu kì tế bào thích hợp
4.1.1.Tế bào ở thời kì nào thì thích hợp ?
4.1.2. Đồng pha tế bào tế bào sinh dưỡng
4.1.3. Loại tế sinh dưỡng sử dụng trong chuyển nhân
4.2. Dự trữ dòng tế bào
4.3. Hiệu quả của kỹ thuật dòng hóa tế bào sinh dưỡng
30
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
Tại sao phải dòng hóa tế bào sinh dưỡng ?
Hiệu quả dòng hóa bằng kỹ thuật chuyển nhân với tế bào cho nhân là tế bào phôi bị giới hạn vì có quá ít nhân trong một phôi. Một phương pháp giải quyết là tái sử dụng phôi ở thế hệ thứ nhất để tạo phôi thế hệ thứ 2, thứ 3.
Tuy nhiên, tỷ lệ thành công giảm dần theo thế hệ và gần như không có bê con nào được sinh ra ở thế hệ thứ 4.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy chuyển nhân từ tế bào sinh dưỡng đã biết hóa cho nhiều triển vọng hơn trong ứng dụng dòng hóa.
31
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
4.1. Chu kì tế bào thích hợp
4.1.1.Tế bào ở thời kì nào thì thích hợp ?
- Chủ yếu tùy thuộc vào thời kì của tế bào nhận:
+ ở thời kì MII (trước hoạt hóa) không thích hợp nhận nhân của tế bào sinh dưỡng thời kì S hoặc G2
+ ở thời kì S (sau hoạt hóa) thích hợp để nhận nhân của tế bào sinh dưỡng ở tất cả các thời kì.
Nên dùng tế bào nhận (noãn) đã hoạt hóa
32
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
4.1. Chu kì tế bào thích hợp
4.1.1.Tế bào ở thời kì nào thì thích hợp ?
4.1.2. Đồng pha tế bào tế bào sinh dưỡng
- Người ta có suy hướng dùng tế bào cho nhân ở thời kì Go vì cho rằng nó giúp cải thiện sự phù hợp của tế bào cho và tế bào nhận.
- Tế bào cho nhân được nuôi trong môi trường huyết thanh thiếu 1 số chất (huyết thanh đói) để dừng chu kì tế bào ở thời kì Go. Công việc này gọi là đồng pha tế bào sinh dưỡng.
Tuy nhiên, không phải tế bào sinh dưỡng ở thời kì Go đều cho kết quả cao hơn trong mọi trường hợp.
33
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
4.1. Chu kì tế bào thích hợp
4.1.1.Tế bào ở thời kì nào thì thích hợp ?
4.1.2. Đồng pha tế bào tế bào sinh dưỡng
4.1.3. Loại tế sinh dưỡng sử dụng trong chuyển nhân
- Ở bò, dòng hóa thú trưởng thành đã thành công bằng cách dùng các loại tế bào từ da, cơ, buồng trứng và kể cả tế bào máu.
- Số lượng thù sống được còn ít nên chưa thể khằng định loại tế bào nào cho kết quả tốt hơn
34
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
4.1. Chu kì tế bào thích hợp
4.2. Dự trữ dòng tế bào
Tế bào sinh dưỡng cho nhân có thể được lưu trữ để thao tác sau đó ?
Có thể dự trữ tế bào sinh dưỡng cho nhân của một cá thể cần quan tâm bằng cách lấy mẫu tế bào, nuôi cấy in vitro qua vài lần cấy truyền rồi sau đó bảo quản với độ lạnh sâu (-196oC).
Mô thường được thu thập là mô da vì có thể lấy mô này một cách dễ dàng mà không nguy cơ nhiều cho thú.
35
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
4.1. Chu kì tế bào thích hợp
4.2. Dự trữ dòng tế bào
4.3. Hiệu quả của kỹ thuật dòng hóa tế bào sinh dưỡng
Giai đoạn I: từ sau khi tái kết câu đến hình thành phôi nang
+ tế bào sau khi tái kết cấu phát triển nhanh trong môi trường in vitro
+ tỉ lệ phát triển đến phôi nang đạt 10 -50% tùy theo dòng tế bào và quy trình. Tỉ lệ này cũng tương tự với dòng hóa tế bào phôi (nhân lấy từ tế bào phôi)
36
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
4.1. Chu kì tế bào thích hợp
4.2. Dự trữ dòng tế bào
4.3. Hiệu quả của kỹ thuật dòng hóa tế bào sinh dưỡng (tt)
Giai đoạn II: từ phôi nang cho đến sau khi sanh
+ tỷ lệ phôi nang phát triển thành cho đến khi sanh chỉ đạt khoảng 10% ở bò (thấp hơn 4 lần so với phương phap cấy phôi – IVF)
+ tỷ lệ thấp do phôi bị hư hoặc cá thể mang thai bị sảy thai ở các giai đoạn sau
37
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
4.1. Chu kì tế bào thích hợp
4.2. Dự trữ dòng tế bào
4.3. Hiệu quả của kỹ thuật dòng hóa tế bào sinh dưỡng (tt)
Sức sống của phôi:
- số bê tạo ra từ dòng hóa tế bào sinh dưỡng còn ít nên chưa biết thông tin về sức sống dài hạn của chúng.
- Tuy nhiên, một số bệnh lý đã được ghi nhận như: rối loạn hô hấp và tuần hoàn, rối loạn miễn dịch...
- Nghiên cứu về những bất thường trên gặp khó khăn vì khoảng cách thế hệ dài. Hướng giải quyết là sẽ nghiên cứu dựa trên những thành công dòng hóa ở chuột.
38
V. ỨNG DỤNG CỦA DÒNG HÓA BÒ
Tạo ra giống ưu việt có ý nghĩa trong chọn giống và bò thịt.
Dòng hóa có thể giúp phục hồi thú nguy cơ tiệt chủng.
- Mặc dù thú dòng hóa không hoàn toàn giống nhau (do DNA ti thể tế của noãn, cá thể mang thai hộ khác nhau, đột biến trong quá trình thao tác...) nhưng chúng vẫn được dùng làm mô hình thú để nghiên cứu biểu hiện hành vi khi có yếu tố ngoại cảnh khác nhau,...
39
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.1.1. Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA
6.1.2. Chọn gen đích trong dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
6.3. Một số ứng dụng của chuyển gen
6.4. Dòng hóa để cải thiện chuyển gen
40
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
Chuyển gen động vật bậc cao cho vi sinh vật thì protein sản phẩm thường không giống hoàn toàn như ở động vật bậc cao.
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.1.1. Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA
Phương pháp vi tiêm: đưa trực tiếp một lượng DNA xác định ngoại bào vào các vị trí cụ thể trong tế bào, gồm:
- Chuẩn bị một lượng lớn DNA cẩn chuyển vào tế bào
- Chuẩn bị và xử lí tế bào cần chuyển
- Tiêm DNA vào tế bào
- Nuôi cấy tế bào đã được chuyển gen
41
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
Chuyển gen động vật bậc cao cho vi sinh vật thì protein sản phẩm thường không giống hoàn toàn như ở động vật bậc cao.
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.1.1. Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA (tt)
Ưu điểm
Hiệu suất chuyển được gen vào tế bào cao, có thể đưa một lượng chính xác DNA vào vị trí cụ thể
Nhược điểm
Các DNA lạ liên kết với nhiễm sắc thể rất ngẫu nhiên, tỉ lệ thành công của phương pháp này thường thấp
42
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.1.1. Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA
6.1.2. Chọn gen đích trong dòng hóa
Kĩ thuật chọn gen đích (gene targeting) là một kĩ thuật di truyền dựa vào sự tái tổ hợp tương đồng để biến đổi một gen.
Các bước thực hiện:
Chọn gen đích
Hình 6.1: Sơ đồ của gen đích dùng để chuyển gen lạ vào.
Thiết kế và tạo ra vector mang các gen muốn chuyển vào
Hình 6.2: Sơ đồ của cấu trúc vector dùng để thay thế alen hoang dại.
43
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.1.1. Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA
6.1.2. Chọn gen đích trong dòng hóa (tt)
Các bước thực hiện (tt):
Chuyển vector vào tế bào có chứa gen đích
Hình 6.3: sơ đồ sự bắt cặp của DNA ngay trước khi sự tái tổ hợp tương đồng xảy ra.
Hình 6.4: Sự bắt cặp của DNA trước khi sự tái tổ hợp không tương đồng .
44
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.1.1. Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA
6.1.2. Chọn gen đích trong dòng hóa (tt)
Các bước thực hiện (tt):
Chọn lọc dòng tế bào có xảy ra sự tái tổ hợp tương đồng
Hình6.5: Sự bắt cặp của DNA trước khi sự tái tổ hợp không tương đồng
Hình6.6: Sản phẩm cuối cùng của quá trình tái tổ hợp không tương đồng.
45
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
46
Hình 6.7: (a) chuyển vector mang gen quan tâm vào tế bào Fibroblast
(b) Chọn lọc dòng tế bào chuyển đúng chủ đích
(c) chuyển nhân tế bào mục đích vào noãn sau đó đưa vào phôi (thực hiện thao tác chuyển nhân)
(d) chuyển vào bò mẹ để mang thai hộ.
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath (tt)
47
Hình 6.8: Sơ đồ dòng hóa tế bào đã được biến đổi thành công trước đó
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Cơ chế:
48
Hình 6.9: Cơ chế “knock out” và “knock in” gen
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Bước 1. Tách một phôi đang phát triển ở giai đoạn phôi nang. Phôi này thì được tạo ra từ một dòng chuột lông xám.
49
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Bước 2. Tách các tế bào gốc phôi từ phôi chuột lông xám và nuôi chúng trong môi trường nuôi cấy.
50
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Bước 3. Chuyển các vector bên ngoài vào tế bào gốc. Chọn lọc các dòng tế bào có xảy ra sự tái tổ hợp bằng cách cho tất cả các tế bào phát triển trên môi trường chứa neomycin và gancyclovir.
51
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Bước 4. Tách các tế bào có xảy ra sự tái tổ hợp tương đồng ra khỏi đĩa petri và tiêm vào phôi nang của chuột lông trắng.
52
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Bước 5. Cấy các phôi nang mang tế bào biến đổi (phôi nang mang thể khảm) vào con mẹ lông trắng mang thai hộ.
53
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Bước 6. Con mẹ sẽ sinh ra các con chuột. Một số có lông trắng bình thường nhưng số còn lại sẽ là chuột thể khảm. Chuột thể khảm mang nhiều tế bào từ phôi nang của dòng chuột lông trắng và một số là tế bào được biến đổi của dòng lông xám. Các tế bào lông phát triển từ tế bào biến đổi sẽ tạo ra các đốm xám mà ta có thể thấy được
54
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Bước 7. Phối chuột thể khảm với con chuột lông trắng hoang dại. Nếu bộ phận sinh dục của con chuột thể khảm xuất phát từ tế bào bị biến đổi, thì thế hệ sau của nó sẽ có lông xám. Mỗi tế bào của các con lông xám này là dị hợp tử, chỉ mang một alen bị biến đổi.
55
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Bước 8. Các con chuột mang thể dị hợp và có kiểu hình là lông xám (được kí hiệu là (+/ H)).
56
knockout mouse
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích
6.3. Một số ứng dụng của chuyển gen
- Ức chế tạo beta lactoglobulin trong sữa bò vì chất này thường gây dị ứng khi dùng sữa bò.
- Tăng lượng casein trong sữa vì chất này bắt giữ chất béo và nước trong quá trình tạo phô mát và ảnh hưởng lớn đến năng suất phô mát.
- Thay đổi thành phần béo trong sữa. Giảm béo thông qua chọn lọc thường khó khăn vì lượng chất béo trong sữa có tương quan với protein sữa.
- Giảm acid béo trong sữa bằng cách giảm biểu hiện gen mã hóa acetyl CoA.
57
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích
6.3. Một số ứng dụng của chuyển gen
6.4. Dòng hóa để cải thiện chuyển gen
- Tế bào nuôi cấy được cấy truyền 15 lần thì đang ở giai đoạn sẵn sàng khi chèn gen mới vào tế bào sinh dưỡng và chọn lọc những dòng biến đổi.
- Một phương pháp mới để tạo nên tế bào khảm hoặc thú khảm (chimera) là đưa trực tiếp tế bào gốc của một giống thú vào gần tế bào nụ phôi trong phôi nang của một giống khác.
- Những tế bào gốc này sẽ trao đổi và gắn kết vào tế bào nụ phôi của phôi nang để phát triển thành kiểu hình trung gian.
58
II. CỞ SỞ SINH HỌC
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
V.ỨNG DỤNG CỦA DÒNG HÓA BÒ
VI.CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Tạo sao lại dùng kỹ thuật chuyển nhân ?
Dòng đơn là gì?
Tại sao cần tạo ra dòng đơn?
Tạo dòng đơn bằng phương pháp nào ?
1.2 . Kỹ thuật chuyển nhân gồm những bước cơ bản nào ?
2
ĐẶT VẤN ĐỀ (tt)
1.1. Tạo sao lại dùng kỹ thuật chuyển nhân ?
Dòng đơn là gì?
là một nhóm gồm 2 cá thể trở lên với bộ máy di truyền giống được tạo nên bởi sinh sản vô tính hoặc hữu tính từ một cha hoặc một mẹ.
Tại sao cần tạo ra dòng đơn?
vì cần có một mô hình giống nhau về di truyền
3
ĐẶT VẤN ĐỀ (tt)
1.1. Tạo sao lại dùng kỹ thuật chuyển nhân ? (tt)
Tạo dòng đơn bằng phương pháp nào ?
cắt phôi ở giai đoạn sớm
chuyển nhân
Hình 1.1: cắt phôi ở giai đoạn sớm tạo dòng đơn
4
ĐẶT VẤN ĐỀ (tt)
1.2. Kỹ thuật chuyển nhân gồm những bước cơ bản nào ?
Chuẩn bị, xử lý tế bào cho nhân và tế bao nhận nhân.
2. Loại bỏ nhân của tế bào nhận
3. Chuyển nhân từ tế bào cho vào tế bào nhận
4. Tái kết cấu
5. Nuôi tế bào đã được tái kết cấu trong môi trường in vitro
5
II. CỞ SỞ SINH HỌC
2.1. Chu kì tế bào
2.2. Sự hình thành tế bào trứng
2.3. Thụ tinh – hình thành phôi
6
II. CỞ SỞ SINH HỌC
2.1. Chu kì tế bào
7
G0 là thời kì tế bào ở trạng thái “nghỉ ngơi”, nó là khoảng thời gian cuối thời kì G1
Hình 2.1: Chu kì tế bào
Hình 2.2: Sơ đồ cấu tạo buồng trứng động vật có vú
II. CỞ SỞ SINH HỌC
2.2. Sự hình thành tế bào trứng
tiền tế bào trứng nằm trong nang trứng, tăng dần kích thước từ nang nguyên thủy đến nang bậc 1, bậc 2 (đã có xoang), nang chín (còn gọi là bao Graaf) giải phóng trứng
8
Hình 2.3: Sơ đồ đường di chuyển của trứng ở động vật có vú
Ở đầu ống dẫn trứng, tế bào trứng được thụ tinh và di chuyển chậm xuống tử cung. Trong khi di chuyển, xảy ra các quá trình kết hợp nhân nguyên đực và cái, phân cắt thành 2 – 4 – 8 – 16 – 32 tế bào và tạo phôi dâu.
II. CỞ SỞ SINH HỌC
2.3. Thụ tinh – hình thành phôi
9
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận
3.1.2. Xử lý tế bào cho
3.1.3. Tái kết cấu
3.1.4. Nuôi cấu in vitro noãn đã được tái kết cấu
3.2. Sự tương tác giữa tế bào chất và nhân
3.3. Hiệu quả dòng hóa phôi trên bò
10
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI (tt)
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận
Noãn ở giai đoạn MII (metaphase II) được cho là lý tưởng cho việc chuẩn bị tế bào chất vì:
+ ở trạng thái dễ tách nhân
+ thuận lợi cho việc tái lập chương trình nhân
Tái kết cấu nhân là gì ?
là sự hợp nhất và tổ chức lại giữa nhân được chuyển và noãn nhận tạo thành dạng một tế bào đúng nghĩa gồm nhân và tế bào chất của nó.
Sự tái lập chương trình của nhân (Reprogramming) là gì?
Là hiện tượng khi được chuyển vào noãn nhận, nhân sẽ bị quay ngược chức năng để trở về giai đoạn đầu tiên để đóng vai trò chức năng nhân của một hợp tử.
11
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận (tt)
- Tiến trình chuẩn hiện nay là tạo các noãn MII từ buồng trứng được lấy ở lò mổ và đưa về phòng thí nghiệm trong dung dịch đệm vô trùng. Từ nang noãn có xoang với đường kính 2-8 mm, phức hợp trứng – tế bào ổ (cymulus-oocyte, COC) nguyên vẹn được hút ra.
12
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận (tt)
Chọn COC nguyên vẹn với vài lớp tế bào ổ dày và nuôi cấy in vitro trong 22-24 giờ ở môi trường nuôi trưởng thành có bổ xung huyết thanh phôi bò, FSH, LH và estradiol-17 (là một trong 3 nhóm chính của hormon estrogen gồm estradiol, estriol, estrol).
(Cơ chế hoạt động của các chất này chưa được hiểu rõ, thường thêm vào theo quy trình)
13
Thông thường hơn 80% noãn nuôi cấy có thể trưởng thành in vitro và đạt trung kì II (xuất hiện thể cực thứ nhất)
*cumulus oophorus: mấu mang trứng để bám vào nang buồng trứng(ovarian follicle)
*zona pellucida: màng trong suốt
Hình 3.2: Tế bào trứng
14
Noãn chưa trưởng thành cũng có thể được thu thập in vivo lập lại nhiều lần trên cùng một thú bằng cách dùng siêu âm để hướng dẫn bị trí hút (OPU = ovum pick up)
Hình 3.3: Sử dụng máy siêu âm để thu thập noãn in vivo
15
Để chuẩn bị tế bào chất nhận, chất liệu di truyền từ noãn trưởng thành (nhiễm sắc thể và thể cực) phải được loại bỏ.
Hình 3.5: Trứng ở giai đoạn MII. Một pipet được đưa qua vùng trong suốt và thể cực thứ nhất cùng với vùng tế bào chất bên dưới có chứa đĩa trung kì được hút vào pipet và bỏ đi.
(mũi tên chỉ thể cực thứ nhất)
Hình 3.4: Đĩa trung kì
16
Hai khó khăn về kĩ thuật đã được giải quyết
Dùng cytochalasin để màng noãn đủ mềm để có thể đưa micropipet qua mà không làm vỡ màng tế bào.
Dùng những thuốc nhuộm đặc biệt (Hoechst 33342) hoặc đánh dấu huỳnh quang để giúp quan sát đĩa trung kì được rõ hơn.
17
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận
3.1.2. Xử lý tế bào cho
tế bào cho thường được tách từ phôi dâu đặc (có thể được sản xuất từ in vivo hoặc in vitro). Ở giai đoạn này, phôi chứa 30-60 tế bào toàn năng chưa biệt hóa.
Hình 3.6: Phôi 1- 2 – 4 – 8 -16 tế bào
18
Hình 3.7: Phôi ở giai đoạn 8 tế bào được giữ tại chỗ bởi lực hút từ pipet bên trái và pipet chuyển (bên phải) được đưa qua màng trong suốt và một phôi bào được hút vào pipet.
19
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận
3.1.2. Xử lý tế bào cho
3.1.3. Tái kết cấu
- Tế bào cho (tế bào của phôi cho hoặc tế bào sinh dưỡng) được hút từng cái vào micropipet và được chuyển vào dưới màng trong suốt của mỗi noãn đã bỏ nhân.
Hình 3.8: Tế bào phôi được chuyển vào noãn nhận (mũi tên chỉ nhân của phôi bào)
20
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận
3.1.2. Xử lý tế bào cho
3.1.3. Tái kết cấu (tt)
Hình 3.9: Sau khi chuyển nhân tế bào cho và nhận được cho phục hồi lại dạng hình cầu trước khi hợp nhất bằng điện (electrofusion) (mũi tên chỉ phôi bào đã được chuyển). Độ phóng đại 400X. (Prather et al., 1987)
21
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận
3.1.2. Xử lý tế bào cho
3.1.3. Tái kết cấu (tt)
Sau khi chuyển tế bào, bộ noãn-tế bào cho được hợp nhất để giúp nhân của tế bào cho đi vào tế bào chất của noãn nhận. Được thực hiện bằng kỹ thuật hợp nhất bằng điện (electrofusion)
22
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận
3.1.2. Xử lý tế bào cho
3.1.3. Tái kết cấu (tt)
(A) Sơ đồ minh họa thao tác chuyển nhân và tái kết cấu
(B) Noãn-tế bào cho được đặt giữa hai điện cực
(C) 30 phút sau khi được hoạt hóa
Hình 3.10: Tái kết cấu bộ noãn-tế bào cho
23
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.1.1. Chuẩn bị tế bào chất nhận
3.1.2. Xử lý tế bào cho
3.1.3. Tái kết cấu
3.1.4. Nuôi cấu in vitro noãn đã được tái kết cấu
Mục đích: noãn tái kết cấu sẽ phát triển đến thời kì phôi nang để từ phôi nang tạo thành con non.
Noãn tái kết cấu được nuôi trong môi trường hóa học hoặc môi trường đồng nuôi cấy với tế bào Vero.
24
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.2. Sự tương tác giữa tế bào chất và nhân
Nếu chuyển nhân của phôi cho vào noãn ở thời kì MII trước khi hợp nhất thì tế bào sẽ phát triển kém.
Người ta cho rằng: có thể do tế bào bị hư hại khi chất nhiễm sắc cô đặc sớm có nhiều yếu tố trưởng thành (maturation promoting factor, MPF) ở thời kì MII.
Yếu tố trưởng thành (MPF) là gì ?
25
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.2. Sự tương tác giữa tế bào chất và nhân (tt)
Yếu tố trưởng thành (MPF) là gì ?
Yếu tố trưởng thành còn có tên gọi là H1 kinase (CDC2 protein = p34 kinase)
Hoạt động như một tác nhân điều hòa của giai đoạn Metaphase. Nó chịu trách nhiệm làm vỡ màng nhân và cô đặc nhiễm sắc thể, ngăn cản quá trình tái kết cấu của nhân cho và tế bào chất của noãn.
26
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.2. Sự tương tác giữa tế bào chất và nhân (tt)
Yếu tố trưởng thành (MPF) là gì ? (tt)
Hoạt tính của MPF xuất hiện trong thời gian ngắn trước khi vỡ màng nhân, nó duy trì ở mức độ cao trong kì MI, giảm trước khi thể cực 1 xuất hiện và gia tăng trong thời kì MII.
MPF liên kết với cấu trúc p62 (protein Cylin B, 62 KDa) thành dạng hoạt hóa. Do đó ta hoạt hóa noãn bằng cách phân hủy cylin làm giảm MPF cho phép noãn ở giai đoạn MII hoàn tất quá trình phân chia.
27
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.2. Sự tương tác giữa tế bào chất và nhân (tt)
Vài tác giả cho thấy nếu hoạt hóa tế bào chất nhận trước trước khi hợp nhất thì không xảy ra sự cô đặc chất nhiễm sắc và phát triển tốt sau hợp nhất.
Người ta có thể tiền hoạt hóa bằng điện hoặc hóa chất (ethanol/cyloheximide hoặc calcium ionophore, rồi ủ với 6-dimethylaminopurine (6-DMAP)).
Việc tiền hoạt hóa tế bào chất nhận vào thời điểm chuyển nhân đã cải thiện sự phát triển in vitro của phôi chuyển nhân đến giai đoạn phôi nang . Khi sử dụng dòng điện để tái kết cấu thì cũng đồng thời hoạt hóa noãn.
28
III. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO PHÔI
3.1. Kỹ thuật chuyển nhân trên bò
3.2. Sự tương tác giữa tế bào chất và nhân
3.3. Hiệu quả dòng hóa phôi trên bò
Sự phát triển in vivo của phôi chuyển nhân còn giới hạn và thấp hơn so với phôi IVF.
Số thú mỗi lần dòng hoá thấp (tối đa 5 cá thể giống nhau từ 1 phôi cho), số thú dòng hoá nhiều đợt lớn nhất ở bò là 11 do: tỉ lệ đậu thai thấp, sau khi chuyển nhân, nhân bị biến động khi tái kết cấu và tỉ lệ phôi nang phát triển thành bê non là 20 – 30%.
Tóm lại hiệu quả chung là 10% nghĩa là từ 100 phôi dòng hoá chỉ tạo ra 10 con bê non.
29
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
Tại sao phải dòng hóa tế bào sinh dưỡng ?
4.1. Chu kì tế bào thích hợp
4.1.1.Tế bào ở thời kì nào thì thích hợp ?
4.1.2. Đồng pha tế bào tế bào sinh dưỡng
4.1.3. Loại tế sinh dưỡng sử dụng trong chuyển nhân
4.2. Dự trữ dòng tế bào
4.3. Hiệu quả của kỹ thuật dòng hóa tế bào sinh dưỡng
30
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
Tại sao phải dòng hóa tế bào sinh dưỡng ?
Hiệu quả dòng hóa bằng kỹ thuật chuyển nhân với tế bào cho nhân là tế bào phôi bị giới hạn vì có quá ít nhân trong một phôi. Một phương pháp giải quyết là tái sử dụng phôi ở thế hệ thứ nhất để tạo phôi thế hệ thứ 2, thứ 3.
Tuy nhiên, tỷ lệ thành công giảm dần theo thế hệ và gần như không có bê con nào được sinh ra ở thế hệ thứ 4.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy chuyển nhân từ tế bào sinh dưỡng đã biết hóa cho nhiều triển vọng hơn trong ứng dụng dòng hóa.
31
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
4.1. Chu kì tế bào thích hợp
4.1.1.Tế bào ở thời kì nào thì thích hợp ?
- Chủ yếu tùy thuộc vào thời kì của tế bào nhận:
+ ở thời kì MII (trước hoạt hóa) không thích hợp nhận nhân của tế bào sinh dưỡng thời kì S hoặc G2
+ ở thời kì S (sau hoạt hóa) thích hợp để nhận nhân của tế bào sinh dưỡng ở tất cả các thời kì.
Nên dùng tế bào nhận (noãn) đã hoạt hóa
32
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
4.1. Chu kì tế bào thích hợp
4.1.1.Tế bào ở thời kì nào thì thích hợp ?
4.1.2. Đồng pha tế bào tế bào sinh dưỡng
- Người ta có suy hướng dùng tế bào cho nhân ở thời kì Go vì cho rằng nó giúp cải thiện sự phù hợp của tế bào cho và tế bào nhận.
- Tế bào cho nhân được nuôi trong môi trường huyết thanh thiếu 1 số chất (huyết thanh đói) để dừng chu kì tế bào ở thời kì Go. Công việc này gọi là đồng pha tế bào sinh dưỡng.
Tuy nhiên, không phải tế bào sinh dưỡng ở thời kì Go đều cho kết quả cao hơn trong mọi trường hợp.
33
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
4.1. Chu kì tế bào thích hợp
4.1.1.Tế bào ở thời kì nào thì thích hợp ?
4.1.2. Đồng pha tế bào tế bào sinh dưỡng
4.1.3. Loại tế sinh dưỡng sử dụng trong chuyển nhân
- Ở bò, dòng hóa thú trưởng thành đã thành công bằng cách dùng các loại tế bào từ da, cơ, buồng trứng và kể cả tế bào máu.
- Số lượng thù sống được còn ít nên chưa thể khằng định loại tế bào nào cho kết quả tốt hơn
34
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
4.1. Chu kì tế bào thích hợp
4.2. Dự trữ dòng tế bào
Tế bào sinh dưỡng cho nhân có thể được lưu trữ để thao tác sau đó ?
Có thể dự trữ tế bào sinh dưỡng cho nhân của một cá thể cần quan tâm bằng cách lấy mẫu tế bào, nuôi cấy in vitro qua vài lần cấy truyền rồi sau đó bảo quản với độ lạnh sâu (-196oC).
Mô thường được thu thập là mô da vì có thể lấy mô này một cách dễ dàng mà không nguy cơ nhiều cho thú.
35
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
4.1. Chu kì tế bào thích hợp
4.2. Dự trữ dòng tế bào
4.3. Hiệu quả của kỹ thuật dòng hóa tế bào sinh dưỡng
Giai đoạn I: từ sau khi tái kết câu đến hình thành phôi nang
+ tế bào sau khi tái kết cấu phát triển nhanh trong môi trường in vitro
+ tỉ lệ phát triển đến phôi nang đạt 10 -50% tùy theo dòng tế bào và quy trình. Tỉ lệ này cũng tương tự với dòng hóa tế bào phôi (nhân lấy từ tế bào phôi)
36
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
4.1. Chu kì tế bào thích hợp
4.2. Dự trữ dòng tế bào
4.3. Hiệu quả của kỹ thuật dòng hóa tế bào sinh dưỡng (tt)
Giai đoạn II: từ phôi nang cho đến sau khi sanh
+ tỷ lệ phôi nang phát triển thành cho đến khi sanh chỉ đạt khoảng 10% ở bò (thấp hơn 4 lần so với phương phap cấy phôi – IVF)
+ tỷ lệ thấp do phôi bị hư hoặc cá thể mang thai bị sảy thai ở các giai đoạn sau
37
IV. CHUYỂN NHÂN TỪ TẾ BÀO SINH DƯỠNG
4.1. Chu kì tế bào thích hợp
4.2. Dự trữ dòng tế bào
4.3. Hiệu quả của kỹ thuật dòng hóa tế bào sinh dưỡng (tt)
Sức sống của phôi:
- số bê tạo ra từ dòng hóa tế bào sinh dưỡng còn ít nên chưa biết thông tin về sức sống dài hạn của chúng.
- Tuy nhiên, một số bệnh lý đã được ghi nhận như: rối loạn hô hấp và tuần hoàn, rối loạn miễn dịch...
- Nghiên cứu về những bất thường trên gặp khó khăn vì khoảng cách thế hệ dài. Hướng giải quyết là sẽ nghiên cứu dựa trên những thành công dòng hóa ở chuột.
38
V. ỨNG DỤNG CỦA DÒNG HÓA BÒ
Tạo ra giống ưu việt có ý nghĩa trong chọn giống và bò thịt.
Dòng hóa có thể giúp phục hồi thú nguy cơ tiệt chủng.
- Mặc dù thú dòng hóa không hoàn toàn giống nhau (do DNA ti thể tế của noãn, cá thể mang thai hộ khác nhau, đột biến trong quá trình thao tác...) nhưng chúng vẫn được dùng làm mô hình thú để nghiên cứu biểu hiện hành vi khi có yếu tố ngoại cảnh khác nhau,...
39
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.1.1. Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA
6.1.2. Chọn gen đích trong dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
6.3. Một số ứng dụng của chuyển gen
6.4. Dòng hóa để cải thiện chuyển gen
40
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
Chuyển gen động vật bậc cao cho vi sinh vật thì protein sản phẩm thường không giống hoàn toàn như ở động vật bậc cao.
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.1.1. Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA
Phương pháp vi tiêm: đưa trực tiếp một lượng DNA xác định ngoại bào vào các vị trí cụ thể trong tế bào, gồm:
- Chuẩn bị một lượng lớn DNA cẩn chuyển vào tế bào
- Chuẩn bị và xử lí tế bào cần chuyển
- Tiêm DNA vào tế bào
- Nuôi cấy tế bào đã được chuyển gen
41
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
Chuyển gen động vật bậc cao cho vi sinh vật thì protein sản phẩm thường không giống hoàn toàn như ở động vật bậc cao.
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.1.1. Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA (tt)
Ưu điểm
Hiệu suất chuyển được gen vào tế bào cao, có thể đưa một lượng chính xác DNA vào vị trí cụ thể
Nhược điểm
Các DNA lạ liên kết với nhiễm sắc thể rất ngẫu nhiên, tỉ lệ thành công của phương pháp này thường thấp
42
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.1.1. Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA
6.1.2. Chọn gen đích trong dòng hóa
Kĩ thuật chọn gen đích (gene targeting) là một kĩ thuật di truyền dựa vào sự tái tổ hợp tương đồng để biến đổi một gen.
Các bước thực hiện:
Chọn gen đích
Hình 6.1: Sơ đồ của gen đích dùng để chuyển gen lạ vào.
Thiết kế và tạo ra vector mang các gen muốn chuyển vào
Hình 6.2: Sơ đồ của cấu trúc vector dùng để thay thế alen hoang dại.
43
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.1.1. Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA
6.1.2. Chọn gen đích trong dòng hóa (tt)
Các bước thực hiện (tt):
Chuyển vector vào tế bào có chứa gen đích
Hình 6.3: sơ đồ sự bắt cặp của DNA ngay trước khi sự tái tổ hợp tương đồng xảy ra.
Hình 6.4: Sự bắt cặp của DNA trước khi sự tái tổ hợp không tương đồng .
44
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.1.1. Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA
6.1.2. Chọn gen đích trong dòng hóa (tt)
Các bước thực hiện (tt):
Chọn lọc dòng tế bào có xảy ra sự tái tổ hợp tương đồng
Hình6.5: Sự bắt cặp của DNA trước khi sự tái tổ hợp không tương đồng
Hình6.6: Sản phẩm cuối cùng của quá trình tái tổ hợp không tương đồng.
45
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
46
Hình 6.7: (a) chuyển vector mang gen quan tâm vào tế bào Fibroblast
(b) Chọn lọc dòng tế bào chuyển đúng chủ đích
(c) chuyển nhân tế bào mục đích vào noãn sau đó đưa vào phôi (thực hiện thao tác chuyển nhân)
(d) chuyển vào bò mẹ để mang thai hộ.
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath (tt)
47
Hình 6.8: Sơ đồ dòng hóa tế bào đã được biến đổi thành công trước đó
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Cơ chế:
48
Hình 6.9: Cơ chế “knock out” và “knock in” gen
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Bước 1. Tách một phôi đang phát triển ở giai đoạn phôi nang. Phôi này thì được tạo ra từ một dòng chuột lông xám.
49
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Bước 2. Tách các tế bào gốc phôi từ phôi chuột lông xám và nuôi chúng trong môi trường nuôi cấy.
50
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Bước 3. Chuyển các vector bên ngoài vào tế bào gốc. Chọn lọc các dòng tế bào có xảy ra sự tái tổ hợp bằng cách cho tất cả các tế bào phát triển trên môi trường chứa neomycin và gancyclovir.
51
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Bước 4. Tách các tế bào có xảy ra sự tái tổ hợp tương đồng ra khỏi đĩa petri và tiêm vào phôi nang của chuột lông trắng.
52
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Bước 5. Cấy các phôi nang mang tế bào biến đổi (phôi nang mang thể khảm) vào con mẹ lông trắng mang thai hộ.
53
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Bước 6. Con mẹ sẽ sinh ra các con chuột. Một số có lông trắng bình thường nhưng số còn lại sẽ là chuột thể khảm. Chuột thể khảm mang nhiều tế bào từ phôi nang của dòng chuột lông trắng và một số là tế bào được biến đổi của dòng lông xám. Các tế bào lông phát triển từ tế bào biến đổi sẽ tạo ra các đốm xám mà ta có thể thấy được
54
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Bước 7. Phối chuột thể khảm với con chuột lông trắng hoang dại. Nếu bộ phận sinh dục của con chuột thể khảm xuất phát từ tế bào bị biến đổi, thì thế hệ sau của nó sẽ có lông xám. Mỗi tế bào của các con lông xám này là dị hợp tử, chỉ mang một alen bị biến đổi.
55
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích (tt)
6.2.1. Qui trình tạo cừu chuyển gen của McCreath
6.2.2. Qui trình tạo chuột bị loại bỏ gen (knock out)
Bước 8. Các con chuột mang thể dị hợp và có kiểu hình là lông xám (được kí hiệu là (+/ H)).
56
knockout mouse
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích
6.3. Một số ứng dụng của chuyển gen
- Ức chế tạo beta lactoglobulin trong sữa bò vì chất này thường gây dị ứng khi dùng sữa bò.
- Tăng lượng casein trong sữa vì chất này bắt giữ chất béo và nước trong quá trình tạo phô mát và ảnh hưởng lớn đến năng suất phô mát.
- Thay đổi thành phần béo trong sữa. Giảm béo thông qua chọn lọc thường khó khăn vì lượng chất béo trong sữa có tương quan với protein sữa.
- Giảm acid béo trong sữa bằng cách giảm biểu hiện gen mã hóa acetyl CoA.
57
VI. CHUYỂN GEN VÀ DÒNG HÓA
6.1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
6.2. Một số qui trình tạo thú chuyển gen dựa trên kĩ thuật tạo gen đích
6.3. Một số ứng dụng của chuyển gen
6.4. Dòng hóa để cải thiện chuyển gen
- Tế bào nuôi cấy được cấy truyền 15 lần thì đang ở giai đoạn sẵn sàng khi chèn gen mới vào tế bào sinh dưỡng và chọn lọc những dòng biến đổi.
- Một phương pháp mới để tạo nên tế bào khảm hoặc thú khảm (chimera) là đưa trực tiếp tế bào gốc của một giống thú vào gần tế bào nụ phôi trong phôi nang của một giống khác.
- Những tế bào gốc này sẽ trao đổi và gắn kết vào tế bào nụ phôi của phôi nang để phát triển thành kiểu hình trung gian.
58
* Một số tài liệu cũ có thể bị lỗi font khi hiển thị do dùng bộ mã không phải Unikey ...
Người chia sẻ: Nguyễn Trần Nam An
Dung lượng: |
Lượt tài: 2
Loại file:
Nguồn : Chưa rõ
(Tài liệu chưa được thẩm định)