Dòng hóa và chuyển gen ở bò

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Dân
Nhóm thực hiện:
Lê Thị Thúy Dung (báo cáo)
Phạm Minh Duy
Nguyễn Thị Li Na
Nguyễn Phan Thành (Nhóm trưởng)
Dương Ngọc Kiều Thi
Nguyễn Thị Khánh Trang
Hồ Nam Việt (báo cáo)
DÒNG HÓA VÀ
CHUYỂN GEN Ở BÒ
1
NỘI DUNG BÁO CÁO
I. Mở đầu
II. Dòng hóa (Cloning)
1. Giới thiệu về dòng hóa.
2. Các kỹ thuật dòng hóa.
3. Quy trình thực hiện.
4. So sánh.
III. Khả năng áp dụng của dòng hóa bò
IV. Chuyển gen và dòng hóa
1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa.
2. Dòng hóa để cải thiện chuyển gen.
3.Áp dụng.
V. Tổng kết


2
I. Mở đầu
Dòng đơn là gì?
Một nhóm gồm 2 cá thể trở lên với bộ máy di truyền giống nhau, được tạo từ sinh sản hữu tính hoặc vô tính từ một cha hoặc một mẹ.

2 phương pháp tạo dòng đơn:
Cắt phôi giai đoạn sớm.
Chuyển nhân.
3
Phôi giai đoạn sớm Kính hiển vi cắt phôi
4
I. Mở đầu
Dòng hóa:
Là quá trình tạo ra các cá thể giống nhau gần như tuyệt đối về mặt di truyền.
5
Những con bò được dòng hóa
6
I. Mở đầu
Hiện tượng dấu ấn giao tử:
Là sự ảnh hưởng di truyền từ tế bào chất nhận.

Hậu quả:
Lệch kiểu di truyền theo Mendel
Đóng góp alen từ cha hoặc mẹ cho sự phát triển của thú con là hoàn toàn khác nhau
Sự khác nhau này dẫn đến những thay đổi trong việc tạo tế bào dòng hóa
7
II. Dòng hóa
Giới thiệu về dòng hóa
Đối với dòng hóa động vật, kỹ thuật được sử dụng phổ biến cho đến ngày nay là chuyển nhân (nuclear transfer).
8
1. Giới thiệu về dòng hóa
Lý thuyết của nuclear transfer

Tế bào trong quá trình phát triển từ hợp tử (zygote) đến cá thể trưởng thành sẽ biệt hóa dần từ totipotent đến differentiated cell

Chỉ có tế bào totipotent mới có thể phát triển thành một cá thể mới hoàn chỉnh

Tế bào chất của trứng có khả năng tái lập chương trình nhân để đưa nhân trở về trạng thái totipotent
9
II. Dòng hóa
Hợp tử
Phôi dâu
Phôi nang
Tế bào gốc phôi
Túi phôi
Tế bào gốc
Tế bào biệt hóa
Totipotent
Pluripotent
Multipotent
Differentiated
2-4 tế bào
10
Sự phát triển của phôi
11
2. Các kỹ thuật dòng hóa
Embryo cloning là kỹ thuật sử dụng tế bào cho nhân là tế bào pluripotent (tế bào giai đoạn phôi nang hoặc phôi dâu).

Somatic cloning là kỹ thuật sử dụng tế bào cho nhân là tế bào sinh dưỡng (somatic cell). Tế bào sinh dưỡng là bất cứ tế bào nào hình thành nên các cơ quan, bao gồm cả tế bào biệt hóa và các tế bào gốc (organ stem cell).
12
II. Dòng hóa
3. Quy trình
13
Chuẩn bị, xử lý tế bào cho nhân và trứng nhận

Đồng pha tế bào

Tái kết cấu

Nuôi cấy và chuyển phôi

II. Dòng hóa
Kỹ thuật chuyển nhân trong cloning
14
3. Quy trình
3.1. Thu nhận tế bào cho nhân
Embryo cloning

15
II. Dòng hóa
Phôi nang/ phôi dâu
In vitro/ in vivo
Phôi mất màng trong suốt
Thu tế bào đơn
Protease
Ủ với môi trường không Ca , 15 phút
Lấy phôi bò
17
3. Quy trình
3.1. Thu nhận tế bào cho nhân
Somatic cloning:

Có thể được lấy từ nhiều bộ phận khác nhau
Có thể lấy từ thú ở mọi lứa tuổi, hay từ thú đã chết vài giờ.
Mức độ biệt hóa của tế bào cho khó xác định rõ ràng.
18
II. Dòng hóa
3. Quy trình
3.1. Thu nhận tế bào cho nhân:
Somatic cloning

Thu tế bào biểu mô sau tai:
→ Cạo lông
→ rửa dd sát khuẩn
→ cắt một mảnh da
→ ngâm qua cồn 70o
→ bảo quản trong dd saline vô trùng ở 4oC
19
II. Dòng hóa
3. Quy trình
3.1. Thu nhận tế bào cho nhân:
Somatic cloning


20
II. Dòng hóa
Rửa, cắt,
xử lý enzyme
Sau vài tuần,
tách bằng trypsin
Huyết thanh,
chất chống đông
3. Quy trình
3.2. Thu nhận và chuẩn bị trứng

21
II. Dòng hóa
Nhuộm NST,
ức chế cytoskeleton
Trưởng thành
in vitro
Hút ở hốc nang noãn có xoang
Loại bỏ tế bào ổ bằng enzyme
Hút nhân
Sự trưởng thành của nang noãn
Nang noãn có xoang của bò
3. Quy trình
3.3. Đồng pha tế bào:

Đưa nhân và trứng về cùng pha tạo điều kiện cho tái kết cấu thành công.

Nguyên nhân:
MPF (maturation promoting factor) của trứng tác động lên nhân cho.
Nhân không cùng pha với trứng
→ MPF tác động sai lệch lên nhân
→ bất thường ở nhân: vỡ màng nhân, NST cô đặc, tạo thể đa bội…
25
II. Dòng hóa
3. Quy trình
3.3. Đồng pha tế bào
Embryo cloning
Hoạt hóa trứng nhận
Tăng thời gian nuôi cấy trứng
Giảm nhiệt độ môi trường (10oC)
Xung điện
Ức chế tổng hợp protein
Hóa chất: Calcium Ionophore A23187, ethanol.
(Protocol: 5 μM ionomycin 5’ → 1,9 mM DMAP 3h)

Nhược điểm:
Có thể làm giảm khả năng tái lập chương trình nhân của tế bào chất trứng.
26
II. Dòng hóa
3. Quy trình
3.3. Đồng pha tế bào
Somatic cloning
Cảm ứng tế bào cho
Nuôi ngắn hạn với môi trường không yếu tố tăng trưởng hoặc huyết thanh đói
→ tế bào cảm ứng vào giai đoạn G0/G1
Có thể kết hợp với hoạt hóa trứng

Nhược điểm:
Dễ gây chết tế bào theo chu trình.

27
II. Dòng hóa
28
3. Quy trình
3.4. Tái kết cấu
Giúp nhân cho vào nguyên sinh chất của tế bào nhận

Tái kết cấu bằng vi tiêm trực tiếp
Tế bào cho:
→ phá màng bằng cơ học hay hóa học.
→ tiêm trực tiếp vào tế bào chất trứng nhận.

Ưu điểm: giảm thiểu DNA ty thể tế bào cho.
Nhược điểm: Gây chấn động nhân, giảm tỷ lệ sống, khó thực hiện, nhất là với tế bào cho lớn (tế bào sợi…)
29
II. Dòng hóa
3. Quy trình
3.4. Tái kết cấu
Tái kết cấu bằng xung điện
Tế bào cho:
→ dưới màng trong suốt
→ môi trường hợp nhất Zimmerman
→ tạo hai đợt xung điện, cường độ và tần số tùy thuộc loại tế bào
→ lặp lại mỗi 15’ cho đến khi hợp nhất.

Có thể tăng hiệu suất quá trình bằng cách tăng nhiệt độ hoặc tạo môi trường nhược trương
30
II. Dòng hóa
32
3. Quy trình
3.5. Nuôi cấy và chuyển phôi

Phôi nuôi in vitro
→ phôi nang
→ chuyển phôi vào thú mang thai hộ hoặc đông lạnh

Thú nhận phôi
→ phối với thú đực thiến
→ ngày 0 của mang thai giả (đóng hàn cổ tử cung)
→ phẫu thuật chuyển phôi
→ tạo điều kiện mang thai (bổ sung kích thích tố…)
33
II. Dòng hóa
3. Quy trình
3.5. Nuôi cấy và chuyển phôi

34
II. Dòng hóa
Nuôi in vitro
Phối với thú dực thiến
Kích thích tố
Phẫu thuật chuyển phôi
4. So sánh
35
II. Dòng hóa
4. So sánh
36
II. Dòng hóa
Bảng: Phát triển in vitro của phôi chuyển nhân từ TB nguyên xơ bò (nuôi cấy trong 2 loại môi trường)
37
Bảng: Phát triển của phôi đến khi sanh với TB nguyên xơ bò (nuôi cấy trong 2 loại môi trường)
38
Bảng: Phát triển của phôi chuyển nhân từ các nguồn tế bào trưởng thành ở bò
39
40
41
III. Khả năng áp dụng của dòng hóa bò
Trong công tác giống

Tạo đời con của bò đực ưu việt.

Tạo bò cái xuất sắc để cải thiện di truyền

Dòng hóa cũng áp dụng ở bò thịt
42
43
Bò cái ưu việt Holstein Friesian và bò con được dòng hóa từ tế bào hạt của nang noãn.
III. Khả năng áp dụng của dòng hóa bò.
2. Dòng hóa các thú có nguy cơ
Gaur Noah
44
III. Khả năng áp dụng của dòng hóa bò
3. Bò dòng hóa như mô hình thú

Nghiên cứu bệnh lý
Nghiên cứu hành vi khi cung cấp các loại thức ăn khác nhau cho thú
45
IV. Chuyển gen và dòng hóa

Chuyển gen:
Là đưa một đoạn DNA ngọai lai vào tế bào và làm cho nó biểu hiện.

Yêu cầu:
Gen được chuyển là một phân tử DNA tái tổ hợp chứa ít nhất 2 phần:
Phần điều hòa hay khởi động
Phần cấu trúc.
46
1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
Thông qua quá trình dòng hóa như thế nào?

Dòng hóa tạo một lượng lớn hợp tử và chuyển gen trực tiếp vào nó.

Tạo nhiều phôi để chuyển gen và thu nhận nhân từ phôi đã chuyển gen để dòng hóa.


47
IV. Chuyển gen và dòng hóa
1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa

1.1 Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA

48
IV. Chuyển gen và dòng hóa
Quy trình chuyển gen ở bò
49
1.1 Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA

Khó khăn:
Đoạn DNA đưa vào TB nhận bị xóa hay biến đổi.
Nguyên nhân:
Các đoạn DNA ngắn thường bị phân cắt bởi DNase ở tế bào chất.
Trong nhân các đoạn ngắn có xu hướng tái tổ hợp tương đồng.
50
IV. Chuyển gen và dòng hóa
1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
1.1 Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA
Khó khăn:
DNA lạ khi tiêm vào sẽ liên kết một cách ngẫu nhiên, dẫn đến sự biểu hiện sai lầm của gen.
Nguyên nhân:
Theo cơ chế sửa sai DNA của tế bào, đoạn DNA ngoại lai sẽ sát nhập ở dạng không tương đồng và tương đồng.
51
IV. Chuyển gen và dòng hóa
1.2 Chọn gen đích trong dòng hóa

Đưa gen vào một vùng chọn lọc của bộ gen tạo nhiều ưu thế
Sự sát nhập gen ngoại lai vào gen tế bào chủ dễ dàng hơn
Tỷ lệ biểu hiện cao hơn
Có thể loại bỏ hay bất hoạt một gen mong muốn

Dòng tế bào mang phải được nuôi cấy trong thời gian dài

Có khả năng tạo nên đời con sau khi biến đổi.
52
IV. Chuyển gen và dòng hóa
1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa
2. Dòng hóa để cải thiện chuyển gen
Tế bào nguyên xơ được cấy truyền qua 15 lần trước khi chuyển nhân
giúp tế bào ở giai đoạn sẵn sàng để chuyển gen
chọn lọc dòng tế bào biến đổi để lấy nhân

Tạo tế bào khảm hoặc thú khảm.

53
IV. Chuyển gen và dòng hóa

54
3. Áp dụng của chuyển gen
Ức chế tạo beta lactoglobulin trong sữa bò

Tăng lượng casein trong sữa

Thay đổi thành phần béo trong sữa

Giảm lactose trong sữa

Nâng cao lượng lactoferrin và lysozyme

Loại bỏ gen không cần thiết như gen tạo protein PrP
55
IV. Chuyển gen và dòng hóa
V. Tổng kết
Dòng hóa đã mở ra nhiều triển vọng hơn trong nghiên cứu hay bảo tồn động vật có nguy cơ

Tuy nhiên khả năng thành công ở động vật lớn như bò, cừu,… chưa cao

Quy trình dòng hóa cần nghiên cứu nhiều hơn để hiểu rõ cơ chế và chuẩn hóa chung.

Sự kết hợp dòng hóa và chuyển gen mở ra khả năng loại bỏ hay gắn thêm gen đem đến nhiều ứng dụng to lớn
56
Tài liệu tham khảo
Trần Thị Dân, 2006, Công nghệ sinh học trong chăn nuôi gia súc, Chương 10, Nhà xuất bản nông nghiệp.
Peter Sutovsky, 2007, ADVANCES IN EXPERIMENTAL MEDICINE AND BIOLOGY, Volume 591 SOMATIC CELL NUCLEAR TRANSFER, Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, LLC, 233 Spring Street, New York, U.S.A.
Michael J. Fields, Robert S. Sand • Joel V. Yelich, 2002, FACTORS AFFECTING CALF CROP - Biotechnology of Reproduction, CRC Press LLC, Boca Raton, Florida, U.S.A.
Tatsanee Suteevun, 2005, EPIGENETICS OF CLONED SWAMP BUFFALO EMBRYOS, CLONED CATTLE FETUSES AND CALVES
57
Tài liệu tham khảo
Trần Keith E. Latham and Mark E. Westhusin, Transplantation and Cloning in Mammals, Rocky S. Tuan, Cecilia W. Lo (Editor), 2000, Nuclear Methods in Molecular Biology, Volume 136 - Developmental Biology Protocols Volume II, Humana Press, Clifton, New Jersey, U.S.A.
Jose Cibelli, Robert Lanza, Keith Campbell, Michael D. West, 2002, Principles of Cloning, Academic Press, London, England
Louis-Marie Houdebine, 2001, Transgenèse Animale et Clonage, Louis-Marie Houdebine, Christine Young, Gail Wagman, Kirsteen Lynch (Translator), 2003, Animal Transgenesis and Cloning, John Wiley & Sons Ltd, The Atrium, Southern Gate, Chichester, West Sussex, England
http://www.atp.nist.gov/atc/atc-21.htm
http://www.cyagra.com/process3.htm
http://en.wikipedia.org
58
59