Độc tố nấm mốc Ochratoxin

Môn học : Độc tố VSV
Giảng viên: TS. Bùi Thị Hải Hòa
******************************
Độc tố nấm mốc ochratoxin
Lớp 10-01
Nhóm 6.


1. Nguyễn Thị Lương
2. Chử Thị Huyên
3. Lê Thị Thanh Ngân
4. Trần Thị Hạnh
5. Nguyễn Hà Nhung
6. Nguyễn Thị Hương

7. Trần Thủy Tiên
8. Nguyễn Thị Quyên
9. Trần Thị Hằng
10. Nguyễn Anh Tiến
11. Đoàn Tiến Dũng
OCHRATOXIN
Đề tài thuyết trình.
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ViỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
A/ Đặt vấn đề
B/ Tìm hiểu.
I/ Sơ lược mycotoxin
C/ Ochratoxin.
I/ Khái niệm.
II/ Lịch sử phát hiện Ochratoxin
III/ Tính chất hóa lý Ochratoxin
IV/ Cơ chế tác động của Ochratoxin
V/ Phân loại
C.I/ Ochratoxin B
C.II/ Ochratoxin C
C.III/ Ochratoxin A
a/ Cấu tạo
b/ Tính chất vật lý
c/ Nấm mốc tổng hợp
d/ Độc tính: + Tác động nông sản
+ Tác động lên vật nuôi
+ Tác động lên động vật thí nghiệm
+ Tác động lên con người.
e/ giới hạn an toàn
D/ Nhận diện Ochratoxin
E/ Giải pháp phòng trừ.





Mục Lục
A/ Đặt vấn đề.
Theo tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), khoảng 25% số ngũ cốc thế giới có chứa một hàm lượng Mycotoxin ở một mức độ nào đó.
Tùy vào địa lý, khả năng nhiễm mycotoxin lại khác nhau. Ở  điều  kiện nhiệt đới và cận nhiệt đới, nguy cơ  nhiễm  mycotoxin càng  cao.
Đặc thù khí hậu và nền sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam tình trạng nhiễm độc tố nấm mốc là khá phổ biến.
 Tìm hiểu, đánh giá đúng độc tố có ý nghĩa rất quan trọng.
B/ Tìm hiểu.
I/ Sơ lược về độc tố nấm mốc:
Đ/n: Độc tố nấm mốc hay còn gọi là mycotoxins là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp từ nấm mốc (). Độc tố nấm mốc có tính bền vững nhiệt độ cao và không bị tiêu diệt trong quá trình chế biến thức ăn thông thường. Ước lượng thực tế có khoảng 300 loại độc tố nấm mốc có hại cho người và động vật.
Xuất hiện: Mycotoxin có thể xuất hiện trước khi thu hoạch hoặc trong thời gian lưu trữ, hoặc trong thức ăn hoàn chỉnh khi không được bảo quản đúng cách
Nhiễm độc:
Cấp tính: Sự nhiễm độc cấp tính do mycotoxin gây nên rất nhiều đợt dịch bệnhvà kèm theo tỉ lệ tử vong rất cao. Nhiễm liều thấp gây ra rối loạn chuyển hóa.
Mạn tính: mycotoxin còn gây nên các bệnh lý rất khác nhau. Mycotoxin có thể gây độc cho các hệ thống khác nhau của cơ thể như gan ,thận ,hệ thần kinh ,hệ tiêu hóa của động vật tiêu thụ các sản phẩm nhiễm các độc tố nấm mốc
Các căn bệnh ở người và động vật do nấm mốc gây ra có các đặc điểm sau:
Đây là bệnh không lây. Điều trị bằng hóa học trị liệu ít hoặc không hiệu quả.
Bệnh thường bùng nổ theo mùa, Sự bùng nổ của bệnh thường liên quan đến thức ăn đặc biệt.
Mức độ nhiễm bệnh thường chịu ảnh hưởng của tuổi, giới tính, trạng thái dinh dưỡng của cơ thể.
Khi kiểm tra thức ăn thấy có dấu hiệu của nấm mốc.
 Độc tố nấm mốc gây độc cho gia súc gia cầm, làm ảnh hưởng đến năng suất chăn nuôi và hiệu quả kinh tế. Chúng còn gây độc trực tiếp cho người, hoặc gián tiếp.
MỘT SỐ MYCOTOXIN ĐIỂN HÌNH
C/ OCHRATOXIN.
I/ Khái niệm:
Độc tố Ochratoxin, là một sản phẩm chuyển hoá thứ cấp của một số loàinấm mốc.Ochratoxin có mặt trong khắp các loại nông sản thực phẩm: ngũ cốc, thảo dược, bia,cà phê... trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật do bị lây nhiễm trước. Ochratoxins đc biết đến là sản phẩm của các loài nấm Aspergillus và Penicillium và thường được tìm thấy trong đa dạng các sản phẩm lương thực và thức ăn chăn nuôi.

Hình 1. Penicillium verrucosum
Hình 2. Aspergillus
II/ Lịch sử phát hiện Ochratoxin
Ochratoxin A lần đầu tiên đc tìm thấy ở nấm mốc A. ochraceus vùng Nam Phi bởi Scott( 1965) trên hạt lúa miến bị nhiễm A.ochraceus.
Ở Đức tìm thấy Ochratoxin thường xuyên trong thịt. Ở Anh, chúng đc tìm thấy trong đậu nành, bắp bột, ca cao.
M.Nakajima năm 1997 đã ghi nhận tỷ lệ chiểm 30% ở hàm lượng OTA từ 0.1 – 17,4 µg/kg ở 47 mẫu café được nhập vào Nhật Bản từ các nước Phi , và 1 số nước ASIAN.
Tại VN, Nghiên cứu tiến hành trên 123 mẫu ngô của 2 xã Cán Tỷ và Lùng Tám huyện Quản Bạ tỉnh Hà Giang. Kết quả cho thấy: trong 123 mẫu ngô được phân tích có tới 50 mẫu (40,7 %) phát hiện có Ochratoxin A, trong số đó có 2 mẫu (1,6 %) vượt mức dư lượng theo quy định của Bộ Y tế
Cho tới nay đã phát hiện được 7 loại Ochratoxin khác nhau.

III/ Tính chất hóa lý Ochratoxin
Ochratoxin là đốc tố tinh thể không màu, ít tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, như benzen, chloroform.. Dạng muối dễ tan trong nước. Dạng axit tan trong dung môi phân cực (chloroform, methenol).
Ochratoxin rất bền vững với các xử lý nhiệt và hóa chất. Hiện tại, p2 hay dùng là sử dụng khí quyển điều chỉnh, tăng CO 2 = 30% ức chế hoàn toàn sự tạo thành OTA.
Ochratoxin phát huỳnh quang và hấp thụ UV cực đại tại 365nm.
Các Ochratoxin rất ưa độ ẩm, thường có trong cơ chất với độ ẩm >16%.
Độc tố được sản sinh nhiều nhất ở nhiệt độ từ 20-25oC.
Sự sản sinh Ochratoxin phụ thuộc chủng nấm mốc, hoạt tính của nước trong hạt, cơ chất, nhiệt độ.
OTA phát huỳnh quang xanh
Con đường xâm nhập
Thức ăn
Gan,thân,cơ,mô mỡ…
Ruột, dạ dày
Nước tiểu, phân
IV/ Cơ chế tác động của Ochratoxin

Ochratoxin gây ức chế sự vận chuyển của ribonucleic axit (tRNA) và các axitamin.
Ochratoxin còn ức chế vi khuẩn, nấm men và phenylalanine-tRNA ở gan. Tác động làm ức chế sự tổng hợp protein trong tế bào và cơ thể.
Sự ức chế miễn dịch của ochratoxin được biểu hiện làm giảm thực bào và ứcchế tế bào lympho. Ức chế tương tự như trên các amino axit synlaza tRNAtương ứng
OTA gây ức chế hydroxylase phenylalanine, 1 nửa phenylalanine củaOTA là 1 phần hydroxyl hóa để tyrosin gây bệnh các tế bào gan trong cơ thể
Ochratoxin ức chế sự tổng hợp RNA làm ảnh hưởng đến các protein trong vòngtuần hoàn. Tác động đến các tế bào màng ty thể và gây ra các hiệu ứngkhác nhau trên ti thể. Kích thích sự hình thành DNA trong thận, gan và lá lách. CácDNA này là các sợi đơn bị phá vỡ.
V/ Phân loại
R R1 R2
Ochratoxin A H Cl H
Ochratoxin B H H H
Ochratoxin C C2H5 Cl H
Ochratoxin A methyl ester CH3 Cl H
Ochratoxin B ethyl ester C2H5 H H
Ochratoxin B methyl ester CH3 H H
4-Hydroxyochratoxin A H Cl OH
C.I/ OCHRATOXIN B

C.II/ OCHRATOXIN C

C22H22ClNO6
Bảng tính chất lý hóa của 3 loại Ochratoxin điển hình
C.III/ OCHRATOXIN A
a/ Cấu tạo:
Ochratoxin A hay còn đc gọi là OTA hoặc OA
CTPT: C20H18ClNO6 .
Công thức danh pháp theo IUPAC: L-phenylalanine- N-[( 5chloro-3,4-dihydro-8-hydroxy-3methyl-1-oxo-1h-2-benzopyran-7-yl)carbonyl]-(R)- isocoumarin.
Khối lượng phân tử là 403.822Da.
Hình 3. Cấu tạo OTA
b/ Tính chất vật lý.
OTA là hợp chất không màu, kết tinh. Tan trong dung môi phân cực và trong dung dịch bicabonat, tan hạn chế trong nước.
Phổ hấp thụ116-332nm.
OTA có điểm nóng chảy ở 94-96 0C.
Phổ hồng ngoại trong cloroform cho các peak có độ dài 3380, 1723,1678, 1655 cm-1
OTA có tính axit yếu pKa14.2-4.4 và pKa2 7.0-7.3.
OTA phát huỳnh quang xanh khi dùng thiết bị TLC chiếu tia UV ở 366nm
c/ Nấm mốc tổng hợp Ochratoxin
Table 1. OTA producing fungi.

(Species  accepted  by  Frisvad  and
co-authors are listed in Table 1.)
c/ Nấm mốc tổng hợp Ochratoxin
Hình 4. A. cabonius
Đặc điểm:
Xuất hiện trong trái cây trưởng thành.
Đề kháng cao với ánh nắng mặt trời.
Phát triển tốt nhất ở 15-20độ C, hoạt độ nước 0.95-0.98 aw.
c/ Nấm mốc tổng hợp Ochratoxin
Hình 5. A. ochraceus
Đặc điểm :
- Có nhiều trong café
- Phát triển tốt nhất ở 25-30độ C, và ở hoạt độ nước 0.98 aw (substrate water activity).
c/ Nấm mốc tổng hợp Ochratoxin
Hình 6. P. verrucosum
Đặc điểm:
Phát triển tốt nhất ở 24 °C và ở hoạt độ nước 0.95–0.99 aw
Có thể sản xuất OTA ở nhiệt độ thấp là 5 ° C
d/ Độc tính
Ochratoxin A ( OTA) có tính độc cao nhất. Do nhóm hydroxyl phenol được tách ra dễ dàng. OTA thường gây ra nhiễm độc mãn tính hơn cấp tính.
d.1/ Tác động tới nông sản:
Ngay từ khi gieo trồng, tất cả các loại ngũ cốc đều bị nhiễm nấm mốc. Loại nấm mốc này có tên là Fusarium.

Hình 7. Fusarium
Hình 8. Ngô nhiễm nấm mốc
Food products Contamination levels
Beans 0.25–0.92 µg/Kg
Cocoa beans 0.35–14.8 µg/Kg
Corn 0.11–0.15 µg/Kg
Dried figs <0.1–35.1 µg/Kg
Dried fruits 0.1–30 µg/Kg
Grapes 0.008–1.6 µg/Kg
Green coffee beans 0–48 µg/Kg
Raisins 0.2–53.6 mg/Kg
Rice 1.0–27.3 µg/Kg
Spices 4.2–103.2 µg/Kg
Wheat, Barley, oats 0.1–17.8 µg/Kg
Beer <0.01–0.135 µg/L
Breakfast cereals 0.4–8.8 µg/Kg
Cocoa products 0.22–0.77 µg/Kg
Grape juice <0.003–0.311 µg/L
Pork products <0.03–10.0 µg/Kg
Roasted coffee 3.2–17.0 µg/Kg
Table  2.  OTA  levels  found  in  some  agricultural  commodities,  livestock  products  and processed food products.
(Toxins 1048)
d.2/ Tác động đối với vật nuôi :

 OTA là độc tố nấm mốc tác động lên cơ quan đích là thận. Ảnh hưởng của ngộ độc cấp tính. xuất huyết đa ổ ở các cơ quan khác nhau và fibrin huyết khối trong lá lách, não, gan, thận và tim



Trên heo:
Liều gây chết : LD50 1-6mg/kg
- OTA gây tổn thươngthận. Hợp chất này được tìm thấy ở thịt heo và các sản phẩm từ thịt.OTA cũng ảnh hưởng đến sự sinh sản của heo nọc. Gây chết hàng loạt ở heo con.
Hình 10. Tổn thương thận
Hình 11. Nhiễm độc thịt heo
d.2/ Tác động đối với vật nuôi :

Ở gà: LD50 3,6mg/kg đối với gà con 10 ngày tuổi
- OTA gây chậm phát triển, khả năng trao đổi giống giảm, sản lượng trứng giảm, tiêu chảy. Số lượng các thành phần máu hữu hình và hàm lượng hemoglobin đều giảm. Protein tổng số và lipid giảm. Độ thanh thải thận cũng giảm.
Hình 12. Gà bị nhiễm độc OTA
d.2/ Tác động đối với vật nuôi :

Trong các loài động vật nhai lại, ochratoxin hấp thụ qua đường máu với một tỷ lệ chuyển hóa thành alpha ochratoxin chất chuyển hóa thành chất không độc hại và ít độc hại.
d.3/ Tác động trên động vật thí nghiệm.
OTA gây tổn thương gan và gan hoại tử ở động vật thí nghiệm.
Gây ung thư: Tính chất gây ung thư của OTA đã được thử nghiệm trên chuột. Nó làm tăng tỷ lệ mắc các khối u tb gan ở chuột, kết hợp với u tuyến tính và ung thư biểu mô tế bào.thận.
Năm 1993, Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thư (IARC) phân loại ochratoxin vào nhóm 2B có khả năng gây ung thư.
Hình 13. Chuột tn bị ung thư
d.3/ Tác động đối với cơ thể người :

Ochratoxin A có thể thấm qua da của con người. 
. OTA gây chứng bệnh suy thận ở người. Nh ững trường hợp nhiễm độc OTA cấp tính có thể bị tử vong. OTA gây đột biến, tác động vào hệ sinh sản gây quái thai, nhiễm độc thần kinh, hoại tử gan , tăng huyết áp, phù nề, gây độc tố tới hệ thống lympho miễn dịch.
Hấp thu, chuyển hoá, thải trừ :
Ochratoxin A được hấp thu chủ yếu trong dạ dày.
Trong ruột phát hiện thấy ochratoxin. độc tố được phân bố nhiều nhất trong thận, sau đó làgan, cơ và các tổ chức mỡ.
Hình 13. Các cơ quan bị ảnh hưởng
d.3/ Tác động đối với cơ thể người :

.
Hình 14.
Hình 15.OTA tác động khu thần kinh
Ochratoxin A có một mối quan hệ mạnh mẽ với não, đặc biệt là các tiểu não và cơ cấu vùng đồi thị.
Ochratoxin gây ra sự suy giảm nhận thức tạo thành tiền đề của bệnh Parkinson,
Một số tác động khác của OTA
Ochratoxin A trên sự miễn dịch của thú: Làm giảm tế bào lympho, tăng apoptotic thực bào, tăng lượng bạch cầu ưa acid, làm tăng lượng bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa bazơ  và làm giảm sự thực bào
Tác động lên gene:
DNA: tổn thương DNA, sửa chữa DNA, và quang sai nhiễm sắc thể.
RNA: Ochratoxin ức chế sự tổng hợp RNA làm ảnh hưởng đến các protein trong vòngtuần hoàn

31
Giới hạn an toàn cho phép đối với ô nhiễm Ochratoxin A
trong thực phẩm :
QCVN 8-1:2011/BYT

Sắc ký mỏng
(TLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC)
Phát hiện mẫu dưới tia UV
Các phương pháp phát hiện OTA
Các phương pháp phát hiện OTA trong ngũ cốc
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC)
HPLC làm sạch bằng Silicagel
HPLC làm sạch bằng Bicabonat
Nội dung trình bày
Phạm vi áp dụng
Nguyên tắc
Điều kiện xác định phân tích
Quy trình thực hiện
Tính toán
HPLC làm sạch bằng silicagel
Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định OTA với các hàm lượng lớn hơn 0.4 µg/kg trong các mẫu ngũ cốc, quả khô, các hạt có dầu, đậu đỗ, cà phê nguyên liệu…
Phương pháp này thử nghiệm trên bột mì cho thấy trong bột mì có chứa hàm lượng OTA từ 0.4 – 1.4 µg/kg.
Nguyên tắc

Sau khi đã axit hóa bằng axit HCl và bổ sung MgCl2 dùng toluene để chiết OTA. Làm sạch dịch chiết trên cột Silicagel và xác định OTA bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao trên cột pha đảo, nhận dạng và sửa đổi detector huỳnh quang.

Điều kiện vận hành HPLC

Pha động: Tỷ lệ: acetonitril (HPLC): Nước: axit axetic = 49:49:2 (Thay đổi tỷ lệ nếu cần).
Tốc độ dòng: 1ml/phút
Cột pha tích pha đảo: 250mm x 4.6mm x C18 (5 µm)
Detector: Huỳnh quang 420nm
V bơm: 20 µl.
Quy trình thực hiện
20g mẫu
(mo)
Ống ly tâm
250ml
Ly tâm
50ml d.dịch
(V2)
Cột chiết
pha rắn
Hút 1ml
(V3)
Bộ lọc màng
HPLC
Vbơm=20µl
Kết quả
Bổ sung:
+ 30ml HCl 2M
+ 50ml MgCl2 0.4M
=> Khuấy đều
Thêm 100ml Toluen
Tính toán
WOTA= mt/m0 x F x 1000
Trong đó:
WOTA : Lượng OTA (µg/ Kg)
m0 : khối lượng mẫu thử (g)
mt : khối lượng OTA tương ứng với diện tích pic đọc được từ đường chuẩn (Nanogam)
F : hệ số pha loãng
HPLC làm sạch bằng Bicabonat
Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này qui đinh phương pháp xác định Ochratoxin A với các hàm lượng lớn hơn 3µg/kg trong các mẫu ngũ cốc như ngô hạt, cám, lúa mì…
Phương pháp này thử nghiệm trên mẫu ngũ cốc chứa hàm lượng Ochratoxin A từ 3.0µg/kg đến 16.3µg/kg
Nguyên tắc
Ochratoxin A (OTA) được chiết ra khỏi ngũ cốc bằng axit phosphoric loãng trong clorofom và được tách phân đoạn bằng dung dịch bicacbonat loãng. OTA được rửa giải bằng axit etyl axetic-metanol-axetat. Ochratoxin A được tách bằng (HPLC) pha đảo, rồi được nhận biết và định lượng bằng huỳnh quang. Chạy sắc ký dẫn xuất của este metyl ocratoxin A để khẳng định việc nhận dạng.
Điều kiện vận hành HPLC
Pha động:
axetonitril : Nước : acid acetic = 49:49:2
Tốc độ dòng:1 ml/phút
Cột pha tích pha đảo: 250mm x 4.6mm x C18 (5µm)
Phát hiện huỳnh quang:
+ Bước sóng kích thích: 333 nm
+ Bước sóng phát xạ: 460 nm
Detector: Huỳnh quang 420 nm
Vbơm: 20 l - 25 l
Quy trình thực hiện
50g mẫu
(mo)
Máy trộn
tốc độ cao
Bộ lọc
sợi thủy tinh
đã phủ diatomit
50g dịch lọc
Phễu chiết
5ml
HPLC
Kết quả
Bổ sung:
+ 250ml HCl Clorofom
+ 50ml H3PO4 0.1M
=> Trộn 3 phút
Thêm 10g diatomit
Cột chiết
Mẫu thô
+10g NaHCO3
30g/l
Nghiền
Tính toán
WOTA= mt/m0 x F x 1000
Trong đó:
WOTA : Lượng OTA (µg/ Kg)
m0 : khối lượng mẫu thử (g)
mt : khối lượng OTA tương ứng với diện tích pic đọc được từ đường chuẩn (Nanogam)
F : hệ số pha loãng
Đề xuất giải pháp
Đề xuất giải pháp
Hạn chế
Các hiểu biết hiện tại về OTA còn ít so với Aflatoxin
OTA rất bền vững với các xử lí nhiệt và hóa chất: Chỉ 76% hàm lượng OTA giảm đi khi gia nhiệt ở 250oC trong 40 phút.
So với aflatoxin, OTA rất bền vững trong môi trường ẩm: Dung dịch OTA trong methanol cũng không bị phân hủy khi bị chiếu xạ ( tới 7,5 Mrad ).
Biện pháp làm giảm và hạn chế sinh OTA
• Giải pháp duy nhất hiện nay cho việc hạn chế tác hại của độc tố nấm mốc là việc sử dụng các chất hấp phụ.
• Trên thế giới hiện nay sử dụng nhiều loại chất hấp phụ nhưng chủ yếu tập trung vào 3 nhóm chính có nguồn gốc từ:
+ Chất khoáng
+ Enzym
+ Nấm men
♥ Tuy nhiên, sử dụng chất hấp phụ có nguồn gốc chất khoáng hiện được xem là có hiệu quả hơn cả.
• Điều kiện bảo quản trong kho bãi cũng giúp hạn chế sự phát triển của nấm mốc và độc tố nấm mốc rất nhiều .
Những giải pháp phòng trừ
kiểm soát sự tăng trưởng nấm mốc.
Nên chọn nguyên liệu mới làm thức ăn chăn nuôi.
 Thường xuyên kiểm tra nguyên liệu trước, trong khi dự trữ và lúc sử dụng để trộn thức ăn cho thú.
 Kiểm tra, khống chế độ ẩm và nhiệt độ thích hợp trong quá trình dự trữ nguyên liệu.
Bảo quản nguyên liệu nơi khô ráo.
Kiểm soát và trừ khử côn trùng, sâu mọt, chuột trong kho:
Sử dụng hóa chất chống nấm.
51
K?t lu?n

- OTA t?n t?i ph?n l?n trờn nụng s?n th?c� ph?m, th?c an chan nuụi. nguy co nhi?m OTA th?m chớ ? m?c� d? th?p cung� cú� nh?ng� ?nh� hu?ng� tiờu c?c� d?i� v?i� s?c� kh?e� v� ho?t d?ng� c?a v?t nuụi.??nh hu?ng r?t nhi?u d?n hi?u su?t chan nuụi.
- OTA r?t da d?ng v� cú nhi?u c?u trỳc hoỏ h?c, nờn n?u gi?i quy?t v?n d? m?t cỏch don gi?n thỡ khụng th? cú du?c nh?ng hi?u qu? nhu ý.
- S? ngan ng?a l� r?t c?n thi?t nhung khụng th? d?m b?o trong th?c an s? khụng cũn d?c t? n?m m?c. Khi th?c li?u dó b? nhi?m d?c t?, thỡ c?n s? d?ng m?t s? bi?n phỏp d? x? lý. K?t h?p dỳng gi?a ch?t k?t dớnh d?c t? n?m m?c, enzymes l�m b?t ho?t d?c t?, v� polimer sinh h?c s? d? d�ng gi?i quy?t v?n d? .
Tài liệu tham khảo:
Open access: www.mdpi.com/journal/toxins
Toxins 2010, 2, 1078-1099; doi:10.3390/toxins2051078. Biodegradation of Ochratoxin A for Food and Feed Decontamination - Luís Abrunhosa *, Robert R. M. Paterson and Armando Venâncio
IBB, Institute for Biotechnology and Bioengineering, Centro de Engenharia Biológica, Universidade do Minho, Campus de Gualtar, 4710-057 Braga, Portugal;
Confidential science magazine.
Độc chất học đại cương.
Quy định giới hạn độc tố BYT 2011.
Cám ơn cô và các bạn đã lắng nghe