Dac diem chung vsv cong nghiep
Chia sẻ bởi Mai Thị Yến |
Ngày 10/05/2019 |
31
Chia sẻ tài liệu: dac diem chung vsv cong nghiep thuộc Sinh học 10
Nội dung tài liệu:
Đặc điểm chủng vi sinh vật công nghiệp và các biện pháp cải tạo chúng
GVHD:
TS.Trần Thanh Thủy
Sinh viên thực hiện:
Hoàng Thị Hồng
Ngô Lê Bảo Trung
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HỒ CHÍ MINH
KHOA SINH HỌC
Mục lục
A. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
B. NỘI DUNG
Đặc điểm chủng VSV công nghiệp
Các chủng VSV công nghiệp chủ yếu
Các biện pháp cải tạo chủng VSV công nghiệp
C. KẾT LUẬN
D. TÀI LIỆU THAM KHẢO
2
3
Enzym 1200 tấn/ năm
Rượu 80 triệu lít/ năm
Bia 1,5 tỉ lít/năm
Đường 163 triệu tấn/ năm
Phomat 2098 nghìn tấn/năm
Năng suất cao
Chất lượng ổn định
4
ChủngGiống
Chủng giống cần có những đặc điểm gì?
I. Đặc điểm chủng VSV công nghiệp
Chủng phải tạo ra được sản phẩm mong muốn, với năng lực và hiệu quả chuyển hóa tạo sản phẩm cao
Ví dụ:
Chủng pinicillium tự nhiên tích tụ được 10-15 UI/l
Chủng pinicilium công nghiệp tích tụ được 85000 UI/l
5
Có khả năng sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm như các phụ phẩm, nguyên liệu thô…
→ Giảm giá thành sản xuất, giảm giá thành sản phẩm
Chủng Corynebacterium Glutamicum có khả năng lên men từ tinh bột, ngô, sắn để tạo ra acid glutamic
6
Chủng phải có canh trường giống dạng thuần khiết, ổn định về di truyền và có thể bảo quản giống lâu dài để đảm bảo cấp giống thường xuyên và ổn định cho sản xuất
→ sự ổn định về di truyền ảnh hưởng đến sự ảnh hưởng về chất lượng sản phẩm
7
Chủng phải thích hợp với điều kiện lên men sản xuất lớn, dễ dàng cấy truyền và nhân giống để cung cấp nhanh và đủ giống cho sản xuất
8
Tốc độ phát triển nhanh và tích tụ các sản phẩm mong muốn trong thời gian ngắn, không tạo sản phẩm phụ trong quá trình sản xuất
→nâng cao hiệu suất sử dụng thiết bị, giảm nguy cơ tạp nhiễm và tạo điều kiện thuận lợi trong giám sát và điều chỉnh quy trình sản xuất
9
Ít mẫn cảm với các vi sinh vật tạp nhiễm và thể thực khuẩn vì sự tạp nhiễm sẽ gây ra một số bất lợi như:
Gây mất thuần chủng giống
Tạo độc tố trong sản phẩm
Cạnh tranh dinh dưỡng làm biến đổi đặc tính sinh hóa của giống
→ giảm năng suất
10
Tách chiết sinh khối hay sản phẩm dễ dàng
11
Không gây độc với con người, động vật, thực vật (nếu có thì độc tính phải thấp và dễ dàng loại khỏi sản phẩm, đồng thời phải mất hoạt tính nhanh trong điều kiện môi trường ngoài
12
Có khả năng áp dụng các kĩ thuật tạo giống hiện đại để nâng cao hoạt tính của chủng chọn lọc hoặc tạo ra những biến chủng có đặc tính ưu việt hơn.
II. Các nhóm VSV công nghiệp chủ yếu
14
1. VK lactic
Gồm hai nhóm vi khuẩn
VK đồng hình:
Streptococcus lactic
Lactobacilus delbrueckii ssp .bulgalicus
L.bulgaricus
Pedoicoccus
b. VK dị hình:
Leuconosto
Bifidobacterium
15
2. Pseudomonas
16
17
Bacillus subtilis
món “itohiki”- món truyền thống của người Nhật với sản lượng 108kg/năm
Bacillus thuringensis
thuốc trừ sâu
B.licheniformis và B.amyloliquefaciens
α-amylase chịu nhiệt
B.alcalophilus
serine protease trong bột giặt
3. Bacillus
4. Corynebacteria
18
Corynebacterium glutamicum
5. Streptomycetes
90% kháng sinh được sản xuất từ nhóm VSV này
Kháng sinh đầu tiên là streptomycin
19
6. Vi nấm
20
7. Vi tảo
21
22
Các đặc điểm trên không phải luôn luôn gắn liền với nhau và cùng tồn tại ở một đối tượng VSV nào đó
Trong thực tiễn chủng E.coli và S.cerevisae thỏa mãn hầu hết các tiêu chuẩn trên
23
Các nhà công nghệ vi sinh đã cải tạo chúng bằng cách nào?
III. Các biện pháp cải tạo chủng VSV công nghiệp
24
1. Chọn lọc
Trong quần thể VSV, tế bào đột biến chỉ chiếm một tỉ lệ rất nhỏ (10-7 hoặc 10-8)
Hiện tượng đột biến có thể xảy ra một cách tự nhiên
Người ta lợi dụng đặc điểm này để tiến hành chọn lọc những chủng VSV có hoạt tính sinh học cao, tạo điều kiện cho chúng phát triển phục vụ SX
25
2. Đột biến
26
Tần số đột biến 10-7 hoặc 10-8 là quá nhỏ. Cần chủ động gây ra đột biến để có chủng VSV có hoạt tính cao hơn nữa
Cải tạo genotype
27
Tác nhân đột biến
Các cơ chế gây đột biến
28
29
Chủng gốc NRRL 1951
Chủng NRRL 1951 B25 (200UI)
Chủng X-1612 (500UI)
Chủng Wis-BL-D10 (không có sắc tố
Chủng Wis 47-650
Chủng Wis 47-638
Chủng Wis 47-911
Chủng Wis 47-650
Chủng Wis 47-1564
Chủng Wis 48-701
Chủng Wis 47-749
Chủng SX Wis 49-133
Chủng Wis – Q176 (750UI)
Tuyển chọn
Xử lý tia X
Xử lý tia UV
Xử lý tia UV
Tuyển chọn
xử lý methyldiamin
(2000UI/ml không có sắc tố
2UI/ml
Kết quả một số loại có hoạt tính cao sinh một số kháng sinh (theo Sacharosa và Kbitko)
30
Biện pháp này tạo ra các đột biến liên quan đến quá trình trao đổi chất theo 2 hướng:
Các đột biến cơ cấu: tạo sản phẩm không cần chất cảm ứng
Các đột biến kháng ức chế ngược: tạo sản phẩm nhiều mà không bị ức chế bởi sản phẩm cuối cùng
31
Đây là phương pháp có ý nghĩa quyết định thành công trong việc tạo giống có năng suất cao dưới tác động mạnh mẽ các tác nhân gây đột biến
Ưu điểm bằng phương pháp gây đột biến này tạo được nhiều biến đổi về gen và kết hợp với chọn lọc định hướng như bổ sung các chất vào môi trường mang lại hiệu quả cao
Nhược điểm: quá trình gây đột biến không xác định rõ được kết quả. Nên có thể phải tiến hành nhiều lần
33
Bằng cách nào có thể hạn chế được nhược điểm của phương pháp gây đột biến
3. Kỹ thuật di truyền
Mở đầu cho kỷ nguyên sản xuất protein tái tổ hợp nhờ VSV biến đổi gen là tạo chủng vi khuẩn E.coli tái tổ hợp mang gen mã hóa insulin người của công ty Genetech, 1978
34
Các chủng VSV tái tổ hợp được tạo nên từ các nguồn vật liệu khác nhau (VK,VR, vi nấm), về cơ bản kỹ thuật tạo chủng VSV tái tổ hợp gồm các bước sau
35
1. Tái tổ hợp di truyền
36
B1 . Xác định và tách triết gen đích
Gen đích là gen mã hóa các protein cần thiết cho con người
Ví dụ:
Tách gen mã hóa insulin từ TB β tuyến tụy người
Tách gen mã hóa Interleukin-2 từ TB lách người
Tách gen trừ sâu, muỗi từ gen Cry của Bacillus thuringiensis
37
B2. Lựa chọn loại vectơ tách dòng
Căn cứ vào điểm đặc trưng, nguồn gốc, kích thước của gen đích và loại TB chủ để lựa chọn loại vectơ tách dòng phù hợp
Trong công nghệ vi sinh người ta thường sử dụng vectơ tách dòng là plasmid hoặc phage
38
39
1kb= 1000cặp Nu
B3. Tạo vectơ tái tổ hợp
Dùng enzym cắt cắt mở vòng vectơ tách dòng và gen đích
Nối gen đích và vectơ tách dòng
40
B4. Đưa vectơ tái tổ hợp vào TBVSV để tạo chủng tái tổ hợp
Kỹ thuật sốc nhiệt ở VK E.coli gồm 2 bước:
Chuẩn bị TB khả biến:
Nuôi E.coli trên MT LB (5% cao nấm men + 10% trypton + 10% NaCl)
Lấy 1khuẩn lạc E.coli và 5ml MT ở 370C, lắc với tốc độ 200vòng/phút trong 12-16h → vi khuẩn lắc
41
Lấy 1ml VK lắc + 99ml MT lắc 2-3h, đem kiểm tra mật độ TB bằng quang phổ kế có chỉ số OD600 đạt 0,4-0,6 là được dung dịch nuôi cấy
Lấy dung dịch nuôi cấy để trên đá lạnh 1-1,5h sau đó li tâm với tốc độ 4500-5000 vòng trong 8-10 phút thu cặn TB
42
Cặn TB + 100ml CaCl2 100mM lạnh, để trên khay đá 15 →li tâm thu cặn TB
Cặn TB + 40ml CaCl2 100mM lạnh, để trên khay đá 1h → li tâm 4000 vòng trong 10 phút thu cặn TB
Cặn TB + 500μl CaCl2 100mM +15% glycerol → TB khả biến
43
Thực hiện kỹ thuật
Lấy 50μl TB khả biến ở -750C đến -850C để trên đá lạnh 15 phút thêm 0,5ng vectơ tái tổ hợp đảo nhẹ ống 3-4 lần trên đá khoảng 15-20 phút
Lấy mẫu đặt vào bể ổn nhiệt ở 420C trong 2 phút, đặt nhanh trên đá lạnh 2 phút
Thêm 1000μl MT nuôi trong 370C ở máy lắc trong 30-60 phút → dung dịch sốc nhiệt
44
45
370C trong 12-16h
Kỹ thuật biến nạp bằng xung điện ở nấm men
a. Chuẩn bị TB khả biến:
46
+
=
1 khuẩn lạc nấm men
MT YPD
280C
250 vòng/phút 1 ngày đêm
Dung dịch nuôi cấy
30μl dd nuôi cấy + 100ml MT, lắc 16-18h đo chỉ số mật độ quang OD600 đạt 1,3- 1,5 → dd mẫu
Đặt dd mẫu lên đá lạnh 5-10 phút → li tâm 4500-5000vòng trong 5 phút→ thu cặn TB
Cặn TB + 10ml nước khử ion lạnh→ li tâm thu cặn TB
Cặn TB+ 20ml sorbitol 1M → li tâm 4500 vòng trong 5 phút→ thu cặn TB
Cặn TB + 0,2ml sorbitol → dịch TB khả biến
47
b. Thực hiện
50l dịch TB khả biến + 10-15g vectơ tái tổ hợp xung điện 0.2 cm, o.25F, 200, 1.5kV trong 4/1000 – 5/1000s
Thêm 1ml sorbitol 1M lạnh, đảo đều cấy lên đĩa petri
48
Chuyển ADN tái tổ hợp nhờ virut
(thể thực khuẩn)
B5. Chọn lọc và tạo dòng
50
Sàng lọc dòng TB tái tổ hợp bằng chỉ thị kháng sinh
Dựa vào gen kháng kháng sinh được làm gen chỉ thị cài sẵn trong vectơ tái tổ hợp
Nuôi các TB sau biến nạp trong MT dinh dưỡng có bổ sung chất kháng sinh tương ứng
Các khuẩn lạc phát triển là khuẩn lạc có vectơ tái tổ hợp
51
Sàng lọc dòng TB tái tổ hợp bằng gen chỉ thị màu:
Gen thường dùng là LacZ- mã hóa enzym β-galactosidase
Trong MT chứa IPTG và X-gal gen LacZ nguyên vẹn (không có vectơ tái tổ hợp)
c. Sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng lai phân tử
52
53
B6. Thu nhận sản phẩm tái tổ hợp
Sản phẩm tạo thành của các chủng VSV tái tổ hợp là sản phẩm ngoại bào, hoặc nội bào, lựa chọn các kĩ thuật li tâm và tách chiết phù hợp để thu nhận và tinh sạch các chất hoạt tính sinh học
54
Kỹ thuật DNA invitro
PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuyếch đại in vitro các nucleic acid đặc hiệu trong thiết bị điều nhiệt tuần hoàn
55
PCR cho phép khuyếch đại theo hàm số mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200-3000bp
Đoạn DNA được khuyếch đại được nhận dạng nhờ cặp primer đặc hiệu
Đây chính là con đường làm tăng sản xuất treonin ở E. coli với tốc độ tăng từ 40- 50 lần.
56
Kết luận
Rõ ràng việc hoàn thiện genotype của chủng giống là không có điểm dừng và phải được tiến hành thường xuyên. Chính vì vậy mà các chủng giống dùng trong sản xuất ngày càng hoàn hảo hơn, năng suất ngày càng cao, giá thành sản phẩm ngày càng hạ, đáp ứng nhu cầu con người ngày càng tốt hơn
57
Câu hỏi
Câu 1: Nếu phải chịu được những điều kiện bất lợi thì các chủng VSV công nghiệp có phải là cổ khuẩn không?
Trong công nghiệp có người ta sử dụng 7 chủng VSV chủ yếu sau:
Streptomycetes
Lactic
Pseudomonas
Vi nấm
Bacillus
Corynebacteria
Vi tảo
58
Đối với những chủng chịu được những điều kiện bất lợi ( nhiệt độ cao, áp suất cao…) trong quá trình cải tạo chủng VSV người ta chuyển gen của cổ khuẩn vào VSV có đặc tính mong muốn hoặc tiến hành chọn lọc trong môi trường khắc nghiệt nâng cao dần khả năng chống chịu của chúng
59
Câu 2: đặc điểm nào là chủ yếu khiến VSV được ứng dụng trong công nghiệp
Không phải chủng VSV nào cũng được sử dụng trong công nghiệp mà chủng đáp ứng những một số các đặc điểm sau sẽ được sử dụng trong công nghiệp
Chủng phải tạo ra được sản phẩm mong muốn, với năng lực và hiệu quả chuyển hóa tạo sản phẩm cao
Có khả năng sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm như các phụ phẩm, nguyên liệu thô
60
Chủng phải có canh trường giống dạng thuần khiết, ổn định về di truyền và có thể bảo quản giống lâu dài để đảm bảo cấp giống thường xuyên và ổn định cho sản xuất
Chủng phải thích hợp với điều kiện lên men sản xuất lớn, dễ dàng cấy truyền và nhân giống để cung cấp nhanh và đủ giống cho sản xuất
Tốc độ phát triển nhanh và tích tụ các sản phẩm mong muốn trong thời gian ngắn, không tạo sản phẩm phụ trong quá trình sản xuất
61
Ít mẫn cảm với các vi sinh vật tạp nhiễm và thể thực khuẩn
Tách chiết sinh khối hay sản phẩm dễ dàng
Không gây độc với con người, động vật, thực vật (nếu có thì độc tính phải thấp và dễ dàng loại khỏi sản phẩm, đồng thời phải mất hoạt tính nhanh trong điều kiện môi trường ngoài
Có khả năng áp dụng các kĩ thuật tạo giống hiện đại để nâng cao hoạt tính của chủng chọn lọc hoặc tạo ra những biến chủng có đặc tính ưu việt hơn
62
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Công nghệ vi sinh, Trần Thị Thanh, NXBGD,2000
Giáo trình Vi sinh công nghệ, Nguyễn Văn Thanh và cộng sự, trường ĐH Y Dược TPHCM
Nhập môn công nghệ sinh học, Phạm Thành Hổ, NXBGD,1998
Giáo trình công nghệ lên men, Lương Đức Phẩm, NXBGD, 2010
Cở sở công nghệ sinh học, tập 4- công nghệ vi sinh, Lê Văn Nhương và cộng sự, NXB Giáo Dục Việt Nam, 2009
63
màng
CẢM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE
64
GVHD:
TS.Trần Thanh Thủy
Sinh viên thực hiện:
Hoàng Thị Hồng
Ngô Lê Bảo Trung
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HỒ CHÍ MINH
KHOA SINH HỌC
Mục lục
A. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
B. NỘI DUNG
Đặc điểm chủng VSV công nghiệp
Các chủng VSV công nghiệp chủ yếu
Các biện pháp cải tạo chủng VSV công nghiệp
C. KẾT LUẬN
D. TÀI LIỆU THAM KHẢO
2
3
Enzym 1200 tấn/ năm
Rượu 80 triệu lít/ năm
Bia 1,5 tỉ lít/năm
Đường 163 triệu tấn/ năm
Phomat 2098 nghìn tấn/năm
Năng suất cao
Chất lượng ổn định
4
ChủngGiống
Chủng giống cần có những đặc điểm gì?
I. Đặc điểm chủng VSV công nghiệp
Chủng phải tạo ra được sản phẩm mong muốn, với năng lực và hiệu quả chuyển hóa tạo sản phẩm cao
Ví dụ:
Chủng pinicillium tự nhiên tích tụ được 10-15 UI/l
Chủng pinicilium công nghiệp tích tụ được 85000 UI/l
5
Có khả năng sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm như các phụ phẩm, nguyên liệu thô…
→ Giảm giá thành sản xuất, giảm giá thành sản phẩm
Chủng Corynebacterium Glutamicum có khả năng lên men từ tinh bột, ngô, sắn để tạo ra acid glutamic
6
Chủng phải có canh trường giống dạng thuần khiết, ổn định về di truyền và có thể bảo quản giống lâu dài để đảm bảo cấp giống thường xuyên và ổn định cho sản xuất
→ sự ổn định về di truyền ảnh hưởng đến sự ảnh hưởng về chất lượng sản phẩm
7
Chủng phải thích hợp với điều kiện lên men sản xuất lớn, dễ dàng cấy truyền và nhân giống để cung cấp nhanh và đủ giống cho sản xuất
8
Tốc độ phát triển nhanh và tích tụ các sản phẩm mong muốn trong thời gian ngắn, không tạo sản phẩm phụ trong quá trình sản xuất
→nâng cao hiệu suất sử dụng thiết bị, giảm nguy cơ tạp nhiễm và tạo điều kiện thuận lợi trong giám sát và điều chỉnh quy trình sản xuất
9
Ít mẫn cảm với các vi sinh vật tạp nhiễm và thể thực khuẩn vì sự tạp nhiễm sẽ gây ra một số bất lợi như:
Gây mất thuần chủng giống
Tạo độc tố trong sản phẩm
Cạnh tranh dinh dưỡng làm biến đổi đặc tính sinh hóa của giống
→ giảm năng suất
10
Tách chiết sinh khối hay sản phẩm dễ dàng
11
Không gây độc với con người, động vật, thực vật (nếu có thì độc tính phải thấp và dễ dàng loại khỏi sản phẩm, đồng thời phải mất hoạt tính nhanh trong điều kiện môi trường ngoài
12
Có khả năng áp dụng các kĩ thuật tạo giống hiện đại để nâng cao hoạt tính của chủng chọn lọc hoặc tạo ra những biến chủng có đặc tính ưu việt hơn.
II. Các nhóm VSV công nghiệp chủ yếu
14
1. VK lactic
Gồm hai nhóm vi khuẩn
VK đồng hình:
Streptococcus lactic
Lactobacilus delbrueckii ssp .bulgalicus
L.bulgaricus
Pedoicoccus
b. VK dị hình:
Leuconosto
Bifidobacterium
15
2. Pseudomonas
16
17
Bacillus subtilis
món “itohiki”- món truyền thống của người Nhật với sản lượng 108kg/năm
Bacillus thuringensis
thuốc trừ sâu
B.licheniformis và B.amyloliquefaciens
α-amylase chịu nhiệt
B.alcalophilus
serine protease trong bột giặt
3. Bacillus
4. Corynebacteria
18
Corynebacterium glutamicum
5. Streptomycetes
90% kháng sinh được sản xuất từ nhóm VSV này
Kháng sinh đầu tiên là streptomycin
19
6. Vi nấm
20
7. Vi tảo
21
22
Các đặc điểm trên không phải luôn luôn gắn liền với nhau và cùng tồn tại ở một đối tượng VSV nào đó
Trong thực tiễn chủng E.coli và S.cerevisae thỏa mãn hầu hết các tiêu chuẩn trên
23
Các nhà công nghệ vi sinh đã cải tạo chúng bằng cách nào?
III. Các biện pháp cải tạo chủng VSV công nghiệp
24
1. Chọn lọc
Trong quần thể VSV, tế bào đột biến chỉ chiếm một tỉ lệ rất nhỏ (10-7 hoặc 10-8)
Hiện tượng đột biến có thể xảy ra một cách tự nhiên
Người ta lợi dụng đặc điểm này để tiến hành chọn lọc những chủng VSV có hoạt tính sinh học cao, tạo điều kiện cho chúng phát triển phục vụ SX
25
2. Đột biến
26
Tần số đột biến 10-7 hoặc 10-8 là quá nhỏ. Cần chủ động gây ra đột biến để có chủng VSV có hoạt tính cao hơn nữa
Cải tạo genotype
27
Tác nhân đột biến
Các cơ chế gây đột biến
28
29
Chủng gốc NRRL 1951
Chủng NRRL 1951 B25 (200UI)
Chủng X-1612 (500UI)
Chủng Wis-BL-D10 (không có sắc tố
Chủng Wis 47-650
Chủng Wis 47-638
Chủng Wis 47-911
Chủng Wis 47-650
Chủng Wis 47-1564
Chủng Wis 48-701
Chủng Wis 47-749
Chủng SX Wis 49-133
Chủng Wis – Q176 (750UI)
Tuyển chọn
Xử lý tia X
Xử lý tia UV
Xử lý tia UV
Tuyển chọn
xử lý methyldiamin
(2000UI/ml không có sắc tố
2UI/ml
Kết quả một số loại có hoạt tính cao sinh một số kháng sinh (theo Sacharosa và Kbitko)
30
Biện pháp này tạo ra các đột biến liên quan đến quá trình trao đổi chất theo 2 hướng:
Các đột biến cơ cấu: tạo sản phẩm không cần chất cảm ứng
Các đột biến kháng ức chế ngược: tạo sản phẩm nhiều mà không bị ức chế bởi sản phẩm cuối cùng
31
Đây là phương pháp có ý nghĩa quyết định thành công trong việc tạo giống có năng suất cao dưới tác động mạnh mẽ các tác nhân gây đột biến
Ưu điểm bằng phương pháp gây đột biến này tạo được nhiều biến đổi về gen và kết hợp với chọn lọc định hướng như bổ sung các chất vào môi trường mang lại hiệu quả cao
Nhược điểm: quá trình gây đột biến không xác định rõ được kết quả. Nên có thể phải tiến hành nhiều lần
33
Bằng cách nào có thể hạn chế được nhược điểm của phương pháp gây đột biến
3. Kỹ thuật di truyền
Mở đầu cho kỷ nguyên sản xuất protein tái tổ hợp nhờ VSV biến đổi gen là tạo chủng vi khuẩn E.coli tái tổ hợp mang gen mã hóa insulin người của công ty Genetech, 1978
34
Các chủng VSV tái tổ hợp được tạo nên từ các nguồn vật liệu khác nhau (VK,VR, vi nấm), về cơ bản kỹ thuật tạo chủng VSV tái tổ hợp gồm các bước sau
35
1. Tái tổ hợp di truyền
36
B1 . Xác định và tách triết gen đích
Gen đích là gen mã hóa các protein cần thiết cho con người
Ví dụ:
Tách gen mã hóa insulin từ TB β tuyến tụy người
Tách gen mã hóa Interleukin-2 từ TB lách người
Tách gen trừ sâu, muỗi từ gen Cry của Bacillus thuringiensis
37
B2. Lựa chọn loại vectơ tách dòng
Căn cứ vào điểm đặc trưng, nguồn gốc, kích thước của gen đích và loại TB chủ để lựa chọn loại vectơ tách dòng phù hợp
Trong công nghệ vi sinh người ta thường sử dụng vectơ tách dòng là plasmid hoặc phage
38
39
1kb= 1000cặp Nu
B3. Tạo vectơ tái tổ hợp
Dùng enzym cắt cắt mở vòng vectơ tách dòng và gen đích
Nối gen đích và vectơ tách dòng
40
B4. Đưa vectơ tái tổ hợp vào TBVSV để tạo chủng tái tổ hợp
Kỹ thuật sốc nhiệt ở VK E.coli gồm 2 bước:
Chuẩn bị TB khả biến:
Nuôi E.coli trên MT LB (5% cao nấm men + 10% trypton + 10% NaCl)
Lấy 1khuẩn lạc E.coli và 5ml MT ở 370C, lắc với tốc độ 200vòng/phút trong 12-16h → vi khuẩn lắc
41
Lấy 1ml VK lắc + 99ml MT lắc 2-3h, đem kiểm tra mật độ TB bằng quang phổ kế có chỉ số OD600 đạt 0,4-0,6 là được dung dịch nuôi cấy
Lấy dung dịch nuôi cấy để trên đá lạnh 1-1,5h sau đó li tâm với tốc độ 4500-5000 vòng trong 8-10 phút thu cặn TB
42
Cặn TB + 100ml CaCl2 100mM lạnh, để trên khay đá 15 →li tâm thu cặn TB
Cặn TB + 40ml CaCl2 100mM lạnh, để trên khay đá 1h → li tâm 4000 vòng trong 10 phút thu cặn TB
Cặn TB + 500μl CaCl2 100mM +15% glycerol → TB khả biến
43
Thực hiện kỹ thuật
Lấy 50μl TB khả biến ở -750C đến -850C để trên đá lạnh 15 phút thêm 0,5ng vectơ tái tổ hợp đảo nhẹ ống 3-4 lần trên đá khoảng 15-20 phút
Lấy mẫu đặt vào bể ổn nhiệt ở 420C trong 2 phút, đặt nhanh trên đá lạnh 2 phút
Thêm 1000μl MT nuôi trong 370C ở máy lắc trong 30-60 phút → dung dịch sốc nhiệt
44
45
370C trong 12-16h
Kỹ thuật biến nạp bằng xung điện ở nấm men
a. Chuẩn bị TB khả biến:
46
+
=
1 khuẩn lạc nấm men
MT YPD
280C
250 vòng/phút 1 ngày đêm
Dung dịch nuôi cấy
30μl dd nuôi cấy + 100ml MT, lắc 16-18h đo chỉ số mật độ quang OD600 đạt 1,3- 1,5 → dd mẫu
Đặt dd mẫu lên đá lạnh 5-10 phút → li tâm 4500-5000vòng trong 5 phút→ thu cặn TB
Cặn TB + 10ml nước khử ion lạnh→ li tâm thu cặn TB
Cặn TB+ 20ml sorbitol 1M → li tâm 4500 vòng trong 5 phút→ thu cặn TB
Cặn TB + 0,2ml sorbitol → dịch TB khả biến
47
b. Thực hiện
50l dịch TB khả biến + 10-15g vectơ tái tổ hợp xung điện 0.2 cm, o.25F, 200, 1.5kV trong 4/1000 – 5/1000s
Thêm 1ml sorbitol 1M lạnh, đảo đều cấy lên đĩa petri
48
Chuyển ADN tái tổ hợp nhờ virut
(thể thực khuẩn)
B5. Chọn lọc và tạo dòng
50
Sàng lọc dòng TB tái tổ hợp bằng chỉ thị kháng sinh
Dựa vào gen kháng kháng sinh được làm gen chỉ thị cài sẵn trong vectơ tái tổ hợp
Nuôi các TB sau biến nạp trong MT dinh dưỡng có bổ sung chất kháng sinh tương ứng
Các khuẩn lạc phát triển là khuẩn lạc có vectơ tái tổ hợp
51
Sàng lọc dòng TB tái tổ hợp bằng gen chỉ thị màu:
Gen thường dùng là LacZ- mã hóa enzym β-galactosidase
Trong MT chứa IPTG và X-gal gen LacZ nguyên vẹn (không có vectơ tái tổ hợp)
c. Sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng lai phân tử
52
53
B6. Thu nhận sản phẩm tái tổ hợp
Sản phẩm tạo thành của các chủng VSV tái tổ hợp là sản phẩm ngoại bào, hoặc nội bào, lựa chọn các kĩ thuật li tâm và tách chiết phù hợp để thu nhận và tinh sạch các chất hoạt tính sinh học
54
Kỹ thuật DNA invitro
PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuyếch đại in vitro các nucleic acid đặc hiệu trong thiết bị điều nhiệt tuần hoàn
55
PCR cho phép khuyếch đại theo hàm số mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200-3000bp
Đoạn DNA được khuyếch đại được nhận dạng nhờ cặp primer đặc hiệu
Đây chính là con đường làm tăng sản xuất treonin ở E. coli với tốc độ tăng từ 40- 50 lần.
56
Kết luận
Rõ ràng việc hoàn thiện genotype của chủng giống là không có điểm dừng và phải được tiến hành thường xuyên. Chính vì vậy mà các chủng giống dùng trong sản xuất ngày càng hoàn hảo hơn, năng suất ngày càng cao, giá thành sản phẩm ngày càng hạ, đáp ứng nhu cầu con người ngày càng tốt hơn
57
Câu hỏi
Câu 1: Nếu phải chịu được những điều kiện bất lợi thì các chủng VSV công nghiệp có phải là cổ khuẩn không?
Trong công nghiệp có người ta sử dụng 7 chủng VSV chủ yếu sau:
Streptomycetes
Lactic
Pseudomonas
Vi nấm
Bacillus
Corynebacteria
Vi tảo
58
Đối với những chủng chịu được những điều kiện bất lợi ( nhiệt độ cao, áp suất cao…) trong quá trình cải tạo chủng VSV người ta chuyển gen của cổ khuẩn vào VSV có đặc tính mong muốn hoặc tiến hành chọn lọc trong môi trường khắc nghiệt nâng cao dần khả năng chống chịu của chúng
59
Câu 2: đặc điểm nào là chủ yếu khiến VSV được ứng dụng trong công nghiệp
Không phải chủng VSV nào cũng được sử dụng trong công nghiệp mà chủng đáp ứng những một số các đặc điểm sau sẽ được sử dụng trong công nghiệp
Chủng phải tạo ra được sản phẩm mong muốn, với năng lực và hiệu quả chuyển hóa tạo sản phẩm cao
Có khả năng sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm như các phụ phẩm, nguyên liệu thô
60
Chủng phải có canh trường giống dạng thuần khiết, ổn định về di truyền và có thể bảo quản giống lâu dài để đảm bảo cấp giống thường xuyên và ổn định cho sản xuất
Chủng phải thích hợp với điều kiện lên men sản xuất lớn, dễ dàng cấy truyền và nhân giống để cung cấp nhanh và đủ giống cho sản xuất
Tốc độ phát triển nhanh và tích tụ các sản phẩm mong muốn trong thời gian ngắn, không tạo sản phẩm phụ trong quá trình sản xuất
61
Ít mẫn cảm với các vi sinh vật tạp nhiễm và thể thực khuẩn
Tách chiết sinh khối hay sản phẩm dễ dàng
Không gây độc với con người, động vật, thực vật (nếu có thì độc tính phải thấp và dễ dàng loại khỏi sản phẩm, đồng thời phải mất hoạt tính nhanh trong điều kiện môi trường ngoài
Có khả năng áp dụng các kĩ thuật tạo giống hiện đại để nâng cao hoạt tính của chủng chọn lọc hoặc tạo ra những biến chủng có đặc tính ưu việt hơn
62
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Công nghệ vi sinh, Trần Thị Thanh, NXBGD,2000
Giáo trình Vi sinh công nghệ, Nguyễn Văn Thanh và cộng sự, trường ĐH Y Dược TPHCM
Nhập môn công nghệ sinh học, Phạm Thành Hổ, NXBGD,1998
Giáo trình công nghệ lên men, Lương Đức Phẩm, NXBGD, 2010
Cở sở công nghệ sinh học, tập 4- công nghệ vi sinh, Lê Văn Nhương và cộng sự, NXB Giáo Dục Việt Nam, 2009
63
màng
CẢM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE
64
* Một số tài liệu cũ có thể bị lỗi font khi hiển thị do dùng bộ mã không phải Unikey ...
Người chia sẻ: Mai Thị Yến
Dung lượng: |
Lượt tài: 0
Loại file:
Nguồn : Chưa rõ
(Tài liệu chưa được thẩm định)