CURCUMINVÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH

CURCUMIN
V� M?T S? ?NG D?NG TRONG PH�N T�CH
GVHD: Trần Mai Liên
SVTH: Dương Ngọc Lan Đài
MSSV: 10043961
LHP: 210415701
D? T�I
GI?I THI?U

Chất curcumin là một chất chống oxy hóa tự nhiên, nó cũng được coi là một hợp chất rất hữu ích trong các vấn đề sức khỏe, và được sử dụng trong điều trị tim mạch và bệnh viêm khớp. Hiện nay, nó cũng là sử dụng như chống viêm, chống oxy hóa và chống ung thư.
Curcumin được sử dụng rộng rãi như một thuốc thử màu trong phương pháp so màu xác định hàm lượng vết Bo trong những vật liệu khác nhau. Sự hình thành phức được sử dụng trong phương pháp so màu. Phương pháp rosocyanin có độ nhạy cao và phương pháp rubrocurcumin có độ nhạy thấp nhất hơn nhưng tính chọn lọc cao.
Việc phân tích định lượng Protein rất quan trọng trong nghiên cứu hóa sinh và kĩ thuật sinh học. Có nhiều phương pháp truyền thống như phương pháp Lowry, phương pháp Bradford, các phương pháp quang phổ… Người ta phát hiện ra rằng Protein và sodium dodecyl sulphonate (SDS) có thể làm tăng sự cộng hưởng ánh sáng tán xạ (RLS) của curcumin. Dựa trên tính chất này người ta phát triển một phương pháp định lượng Pro mới.
PHẦN A: CƠ SỞ LÝ THUYẾT

I.THUỐC THỬ HỮU CƠ CURCUMIN
I.1 Công thức, tên gọi

Danh pháp IUPAC:
(1E,6E)-1,7-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione
Tên khác:
- Curcumin
- Diferuloylmethan
- C.I. 75300
- Natural Yellow 3
CTPT: C21H20O6
M = 368,39 đvC
I.2 Ứng dụng
Phát hiện ra: B, Ba, Ca, Hf, Mg, Mo, Ti, V, W, Zr. Phản ứng đo độ sáng của Boron,
cách sử dụng như xịt lên tờ giấy sắc ký.
I.3 Tính chất của thuốc thử
Là bột màu vàng cam, nhiệt độ sôi 1830C, không tan trong nước, tan ít trong ether, dễ tan trong methanol, ethanol, acetone, và acid acetic băng. Nó phản ứng với dung dịch kiềm cho màu vàng.

Mặc dù thuốc thử có β–diketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nào phù hợp cho hằng số phân ly của enolic proton. Hình 1 minh hoạ phổ hấp thụ của Curcumin ở điều kiện một vài dung dịch khác nhau.
Hình 1: Minh hoạ phổ hấp thụ của Curcumin ở điều kiện một vài dung dịch khác nhau
II. BORON
II.1 Công thức, tên gọi, vị trí trong bảng HTTH
Ký hiệu: B
Số hiệu nguyên tử bằng 5

Là á kim, chu kì II, phân nhóm chính nhóm 3.
Hình 2: Một vài số liệu về nguyên tử Boron
II.2 Tính chất vật lý
Hình 3: Bảng các hằng số vật lý của Boron
III. PROTEIN
III.1. Giới thiệu chung
Protein (Protit hay Đạm): là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axít amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein.
III.2. Tính chất
Axit amin được cấu tạo bởi ba thành phần:
Một là nhóm amin (-NH2)
Hai là nhóm cacboxyl (-COOH)
Cuối cùng là nguyên tử cacbon trung tâm đính với 1 nguyên tử hyđro và nhóm biến đổi R quyết định tính chất của axit amin.

Người ta đã phát hiện ra được tất cả 20 axit amin trong thành phần của tất cả các loại protein khác nhau trong cơ thể sống.
Cấu trúc chung của Protein
Cấu trúc không gian của Protein
IV. SỰ TẠO PHỨC CỦA CURUCUMIN
IV.1. Tạo phức với kim loại
IV.2. Tạo phức với Boron
Có hai dạng sau
Rosocyamin

Rubrocurcumin
Phổ hấp thụ của Rosocyamin và Rubrocurcumin
PHẦN B: THỰC NGHIỆM

V. SỬ DỤNG CURCUMIN ĐỂ XÁC ĐỊNH BORON BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU
V.1. Hóa chất
- Acetone: tinh khiết phân tích, tạp chất có thể bay hơi là 0,001%
- Pha dung dịch Boron gốc: hòa tan 0,5716 g acid boric trong 1lít nước. ta có dd 1mg Boron/ 1ml hay 100Y
+ Dung dịch Boron chuẩn A: lấy 100ml dung dịch gốc trên pha thành 1lít dd bằng nước tinh khiết, ta được dung dịch 0.01mg Boron/ 1ml dd hay 10 Y
+ Dung dịch Boron chuẩn B: lấy 10ml dd gốc pha thành 1lít dung dịch bằng nước cất ta được 0.001mg Boron/ 1ml dd, hay 1 Y
- Dung dịch Curcumin: hòa tan 0.0625g curcumin trong 5ml carbitol, sau đó pha thêm 500ml acetone. Dung dịch này bền trong vòng 2, 3 tháng.
- Acid chlohydric: pha 50ml dung dịch HCl (trọng lượng riêng 1,2) với 200ml nước. dựng trong chai thích hợp
V.2. Dụng cụ
Dụng cụ thủy tinh sử dụng chứa acid Boric phải là dụng cụ mới và được rửa bằng acid HCl, rồi rửa bằng acetone, sau đó tráng lại bằng nước cất.
Máy quang phổ Beckman, model DU, hoặc tương đương.
Burets thủy tinh
Giấy lọc : Whatman no. 40, size. 9cm
Phễu thủy tinh
Pipets
Nồi sứ chịu nhiệt 1000ml để làm bay hơi dung dịch kiềm.
Bình định mức
V.3. Tiến hành
Dùng pipet hút một lượng dung dịch chứa từ 0 – 20 μg Boron, vào chén sứ chịu nhiệt, và thêm 0.1 g bột sodium carbonate. Làm bay hơi dung dịch đến khô, tốt nhất là thực hiện trong lò nung, ở nhiệt độ 110 – 1300C, làm lạnh, thêm 1 giọt chỉ thị phenolphthalein, chuẩn độ bằng HCl đến khi màu hồng biến mất rồi thêm 0.5 ml HCl nữa. Lượng acid HCl sử dụng từ 1 – 4 ml tuy nhiên thông thường là 1ml, thêm vào đó 0,5 ml dd acid oxalic 5% và 3ml thuốc thử Curcumin, chưng cách thủy dung dịch này ở nhiệt độ 550C (±30C). Xuất hiện các tinh thể trong dung dịch sau đó làm lạnh. Nhìn thấy àu đỏ trong dung dịch acetone, lọc dung dịch vào bình định mức 25ml, rửa tinh thể và giấy lọc bằng acetone, rồi định mức đến 25ml bằng acetone. Lắc đều. Giữ ở nhiệt độ 220C đến 250C. Quan sát màu của dung dịch, hoặc tốt hơn là dùng quang kế. Dùng máy đo quang phổ Beckman với khe hở 0.3 x10-6m và ở bước sóng 535nm.
Phổ hấp thụ thu được từ quang phổ Beckman cho thấy mật độ quang A là 1.0cm. mẫu không có Boron.
V.4. Các yếu tố ảnh hưởng
Acid oxalic. Để nghiên cứu sự ảnh hưởng của lượng acid oxalic khác nhau, ta thêm một lượng acid oxalic 1ml với 1-4 ml HCl, 1 giọt phenolphthalein, 3ml hỗn hợp Curcumin – acetone.
Hình 1: Mô tả rõ ràng ảnh hưởng của axit oxalic trong việc xác định từ 0 đến 50 Y
Boron, các yếu tố khác không thay đổi. Ảnh hưởng của acid oxalic tập trung ở vùng lân cận 2ml dung dịch 5%, nhưng kết quả cho thấy chỉ đạt được 0,25ml. Khác biệt lớn nhất là ở 0.5ml.
Acid chlohydric: để xác định sự ảnh hưởng nếu dư HCl, cho 1ml sodium carbonate 10% cộng với 6ml là hỗn hợp: 1 – 4 ml HCl, 1giọt phenolphthalein, 0,25ml acid oxalic 5%, và 3ml dung dịch hỗn hợp Curumin – acetone.
Hình3: Đồ thị cho thấy lượng dư acid HCl 5ml là môi trường acid thuận lợi nhất.
Trong thí nghiệm nên thêm dư 0.5ml dd HCl là tốt nhất, việc thêm vào 0.5ml HCl được cho phép khi lượng Boron ít hơn 10y, nhưng kết quả không tốt khi lượng Boron lớn hơn 10y
Ảnh hưởng qua lại giữa các loại acid
Dung dịch chỉ chứa 0-0,5 ml dung dịch axit hydrochloric và 0-1ml dung dịch axit oxalic là không đầy đủ tính axit và cho kết quả kém. Dung dịch có chứa 1 ml dd hydrochloric và 0,25 ml dung dịch axit oxalic cho kết quả chính xác hơn.
Currumin. Ảnh hưởng của lượng curcumin thay đổi được kiểm tra với lượng một lượng dung dịch curcumin 0.0125% với 1ml acid HCl, 1 giọt phenolphthtalein, 10ml dd acid oxalic 5%, lượng curcumin có thể thay đổi tùy ý theo hình 4, nồng độ acid oxalic cao hơn nồng độ curcumin cho phép. Lượng curcumin tối thiểu cho 0 – 10 boron là 3ml. Hình 4.

V.5. Kết luận
Sự chính xác trong việc xác định Bo phụ thuộc vào hàm lượng của nó trong mẫu, trong khoảng từ 0 – 0,2 μg, tổng thể tích mẫu giới hạn là 10ml, trong khoảng từ 0,2 – 2 μg Boron thì tổng thể tích giới hạn của mẫu là 25ml, chính xác đến 0,05 μg, trong khoảng từ 2 – 25 μg tổng thể tích là 25ml, với độ chính xác 95%, nếu trên 25 μg, giới hạn là 50ml. tổng thể tích cho 50 μg Boron là 100ml… với độ chính xác 95%.
Các kiểm tra cho thấy rằng phgương pháp so màu là một phương pháp tốt với lượng acid boric thấp khoảng 0- 25 μg, cũng chính xác trong khoảng từ 25 – 100 μg, nhưng không tốt khi hàm lượng cao hơn nữa.
VI.NGHIÊN CỨU SỰ TƯƠNG TÁC CỦA PROTEIN VỚI CURCUMIN VÀ SDS VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH
VI.1. Giới thiệu
Gần đây, kĩ thuật RLS đã trở thành một phương pháp mới và thu hút để phân tích một lượng rất nhỏ các đại phân tử sinh học, vì nó có độ nhạy cao, đơn giản và nhanh chóng. Việc xác định chủ yếu dựa trên sự nhuộm màu trên các đại phân tử sinh học làm tăng mạnh RLS. Huang et al, người đầu tiên sử dụng kĩ thuật cộng hưởng ánh sáng tán xạ thiết lập một phương pháp mới xác định DNA, sau đó kĩ thuật này đã được sử dụng để xác định Protein.
Bài viết này giới thiệu một phương pháp RLS mới để xác định Pro bằng Curcumin, chất hoạt động bề mặt anionic, và SDS (sodium dodecyl sulphonate).
VI.2. Thiết bị dụng cụ
- Máy cường độ RLS: Hitachi F-2500 spectrofluorometer (Nhật Bản)
- Máy đo phổ UV-4100 (Hitachi, Nhật Bản)
- Máy đo nồng độ axit PHS-2F kỹ thuật số (Leici, Thượng Hải).
- DXD IImicro dụng cụ điện di.
VI.3. Hóa chất
- Dung dịch gốc của Protein được chuẩn bị bằng việc hoà tan huyết thanh súc vật (Shanghai Boao Biochemical Techology Co., China) và huyết thanh con người. (Sigma) trong dung dịch nước cất. (nước cất là một loại nước tinh khiết không có các ion muối khoáng như natri, canxi, sắt, đồng, clorua, và bromide.) tổng nồng độ BSA và HAS là 100 μg ml‑1
- Dung dịch gốc Curcumin (1.00×10−3 mol l−1) được chuẩn bị bằng cách hòa tan Curcumin trong ethanol rồi pha loãng đến 5.00×10−5 mol l−1 với dung môi athanol.
- Hệ dung dịch đệm Briton–Robinson (H3PO4 +H3BO3 + HAc + NaOH) dùng để đều chỉnh pH.
- SDS gốc (1.00×10−2 mol l−1) được chuẩn bị bằng cách hòa tan SDS trong nước cất sau đó pha loãng đến 5.00×10−4mol l−1 sử dụng làm dung môi.
Các dung dịch trên được bảo quản ở nhiệt độ 0.0 – 4.0 0C
Tất cả các hóa chất phải đạt tinh khiết phân tích và nước sử dụng trong suốt quá trình là nước cất 2 lần.
VI.4. Tiến hành
- Lấy một ống nghiệm khô 10ml, cho các dung dịch vào theo trình tự sau đây: 2.5 ml đệm BR (pH 3.5), 1.0 ml của Curcumin (5.00 × 10-5 mol l-1), BSA chuẩn (hoặc dung dịch mẫu) và 1.5 ml SDS (5.00 × 10-4 mol l-1). Sau đó để yên trong 20 phút.
Tất cả quang phổ thu được bằng cách quét RLS đồng thời các kích thích và phát xạ đơn sắc ( nghĩa là từ λ = 0 nm) của máy spectrofluorometer từ 220 đến 600 nm. Cường độ của RLS được đo ở bước sóng λ = 288 nm trong một phân tử thạch anh với một khe hở 0.5nm cho các kích thích và bức xạ đi qua. Cường độ RLS tăng lên gây ra bởi Protein được tính bằng :
ΔIRLS = IRLS −I0RLS
IRLS : cường độ RLS khi có Protein
I0RLS : cường độ RLS khi không có Protein
Tất cả các phổ UV cũng được ghi lại cùng lúc bởi máy quang đo quang phổ UV-4100.
VI.5. Kết quả và thảo luận
VI.5.1. Các tính năng của phổ cộng hưởng ánh sáng tán xạ
Hình. 1 (1) - (6) cho thấy quang phổ ánh sáng tán xạ của CU, CU-BSA, CU-SDS và CU-SDS-BSA.
Các đỉnh của phổ RLS và phổ UV của dung dịch nằm lân cận 288, 375, 470, và 500 nm. Như có thể thấy, cường độ RLS của Curcumin, BSA là yếu. Khi thêm BSA hoặc SDS thì các RLS này tăng đáng kể. Điều này cho thấy đã có một sự tương tác
của Curcumin với BSA hoặc SDS. Hơn nữa, khi cho cùng lúc BSA và SDS vào dd, cường độ tán xạ ánh sáng cộng hưởng của dung dịch Curcumin-BSA-SDS là cao hơn nhiều hơn so với dung dịch Curcumin-BSA và Curcumin -SDS. Điều này chứng tỏ là một phức chất lớn đã hình thành trong dung dịch CU-BSA-SDS. Bằng cách so sánh sự tán xạ ánh sáng và quang phổ hấp thụ ta có thể được thấy rằng các đỉnh của sự tán xạ ánh sáng tại 288, 375, và 500 nm tương ứng với các đỉnh của băng hấp thụ UV ở 250, 365 và 428 nm. Theo lý thuyết của RLS, các đỉnh của ánh sáng tán xạ tại 288, 375, và 500 nm được gán cho băng hấp thụ của CU ở 250, 365, và 428 nm, tương ứng. Phổ tán xạ ánh sáng không chỉ phụ thuộc vào bản chất của dung dịch nghiên cứu mà còn phản ánh những đặc điểm riêng của vật chứa. Đỉnh RLS khoảng 470 nm có thể là sự phát xạ của đèn xenon. Cường độ RLS tối đa của dd CU-protein SDS là ở 288 nm, do đó, 288 nm được lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn.
Hình. 1 (1) - (6) cho thấy quang phổ ánh sáng tán xạ của CU, CU-BSA, CU-SDS và CU-SDS-BSA.
VI.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ Curcumin
Qua hình trên ta thấy hàm lượng Curcumin 5 × 10-6 mol l-1 cho IRLS tối đa.

VI.5.3. Ảnh hưởng của các ion lạ khác
Qua bảng 3 ta thấy nồng độ các ion khác không làm ảnh hưởng đến RLS của hệ, ngoại trừ DNA, các ion này không tác động lên viêc xác định Protein, sai số cho phép là ±5%.
VI.5.4. Giới hạn phát hiện
VI.5.5. So với một số phương pháp khác
VI.6. Kết luận

Trong tác bài báo này, ta thấy được sự tương tác qua lại giữa Curcumin với protein và SDS, và sự gia tăng RLS đáng kể của dung dịch Curcumin – SDS khi có mặt một lượng rất nhỏ protein. Vì vậy, đây chính là một phương pháp mới và có độ nhạy cao trong việc xác định protein ở mức nanogram được đề xuất. Giới hạn phát hiện đạt 10-11 g ml-1. Phương pháp này có ưu điểm là độ nhạy cao, chọn lọc, ổn định và nhanh chóng. Ngoài ra, cơ chế tương tác giữa protein và hệ SDS-CU cũng được nghiên cứu bằng cách sử dụng nhiều kỹ thuật khác nữa.
CÁM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ CHÚ Ý LẮNG NGHE!!!...