Công nghệ tế bào
Chia sẻ bởi Phan Thị Huyền Trân |
Ngày 08/05/2019 |
47
Chia sẻ tài liệu: công nghệ tế bào thuộc Sinh học 12
Nội dung tài liệu:
KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO
MÔN HỌC
GV. Khúc Thị An
NỘI DUNG MÔN HỌC
PHẦN I: Nuôi cấy mô tế bào thực vât (25 tiết)
PHẦN II: Nuôi cấy mô tế bào động vật (20 tiết)
PHẦN I: NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
Mở đầu
Lịch sử phát triển
Cơ sở khoa học
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật
ứng dụng của nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Mở đầu
Lịch sử phát triển công nghệ
Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy tế bào động vật
Nguyên tắc nuôi cấy và duy trì dòng tế bào động vật invitro
Ứng dụng của công nghệ nuôi cấy tế bào động vật.
PHẦN II: NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Đức Lượng, 2004: Công nghệ tế bào, NXB Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh
2. Nguyễn Đức Thành, 2000: Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng. NXB Nông nghiệp Hà nội.
3.Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Tiến Thắng, 1996: Những kiến thức cơ bản về công nghệ sinh học, NXB Giáo dục
4.Nguyễn Văn Uyển, 1996: Những phương pháp công nghệ sinh học, NXB Nông nghiệp
TÀI LIỆU THAM KHẢO
5.Vũ Văn Vụ, Sinh lý thực vật ứng dụng, NXB GD – 1998
6. Công nghệ tế bào, Nguyễn Hoàng Lộc,NXB-2006
7. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, Lê văn Hoàng, NXB KHKT- 2008
8. Roberta H.Smith, 1992 : Plant tissue Culture; Techniques and Experiments. , Second edition. Academic Press, 2000.
Mục tiêu và yêu cầu môn học
Kiến thức:
+ nguyên tắc của một số kỹ thuật cơ bản của nuôi cấy mô và tế bào. Mục đích, ý nghĩa của từng loại kỹ thuật sử dụng
+ ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
Kỹ năng:
+ Nuôi cấy mô và tế bào trên các loại đối tượng: chuẩn bị môi trường nuôi cấy, các thao tác nuôi cấy, theo dõi, đánh giá sự sinh trưởng của tế bào nuôi cấy.
+ Bảo quản giống invitro
Một số yêu cầu
Môn học tiên quyết:
Không nghe điện thoại trong giờ học
Không được vào muộn
Kiểm tra giữa kỳ: 25%
Thi cuối kỳ (viết tự luận): 75%
Mở đầu
Một số thuật ngữ về nuôi cấy mô tế bào TV
Tầm quan trọng và ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Cơ sở khoa học của phương pháp
Một số thuật ngữ
Nuôi cấy tế bào
Tế bào từ các cơ thể nguyên vẹn (động vật và thực vật) có thể được tách riêng và cho nuôi cho phát triển trong các môi trường nuôi cấy có chứa hỗn hợp chất dinh dưỡng và nhân tố tăng trưởng.
Tính toàn năng (totipotency): Một đặc tính của tế bào là có khả năng phát triển thành mọi kiểu tế bào có trong cơ thể trưởng thành mà từ đó nó được tách ra, tức là có khả năng tái sinh thành một cơ thể hoàn chỉnh.
Một số thuật ngữ
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật
Là khái niệm mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng. Nuôi cấy các loại mô tách ra từ một phần nào đó của một cơ quan thực vật: lá, thân, hoa, rễ.
Nhân giống invitro:Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn gọi là vi nhân giống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác.
Lai tế bào soma
Tất cả các dạng nuôi cấy mô đều tiến hành qua 2 bước
Tách rời tế bào, mô hay cơ quan đang tương tác
Đặt trong môi trường thích hợp để nó có thể biếu lộ hết bản chất hoặc khả năng đáp ứng của nó.
(Tiến hành trong đk vô trùng)
Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
A.Mô sẹo từ. (BNuôi cấy dịch tế bào từ (C) Nốt sần (D) Đầu rễ. (E)Tái sinh cây (F) Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của. (H) Phôi vô tính của cây Coffea canephora. (I) Nuôi cấy rễ cây
Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Về mặt lý luận sinh học
Về mặt thực tiễn sản xuất
1.Về mặt lý luận
- Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc bản chất của sự sống.
- Nghiên cứu về đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, sự di truyền và tác dụng của các hoá chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy.
- Nghiên cứu qui luật sinh trưởng và phát triển cùng mối quan hệ của cá thể với môi trường.
2. Về mặt thực tiễn sản xuất
Hiện nay phương pháp nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm trở thành kỹ thuật nông nghiệp phổ biến.
Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn, gấp nhiều lần tốc độ vốn có của nó trong tự nhiên (nhân nhanh các cây trồng quí..) 130.000 cây Hồng/năm từ một gốc hồng.
Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên các tính trạng di truyền của cơ thể mẹ và làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất ở quy mô lớn, tạo sinh khối lớn các chất có hoạt tính SH (alkaloid, steroit)
Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Vi nhân giống
Tạo giống mới
Sản xuất dược liệu
Bảo quản giống invitro
Dựa vào kỹ thuật nuôi cấy để duy trì và bảo quản được nhiều giống cây trồng quý hiếm.
Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp protoplast (tế bào trần) để tạo ra những con lai xa về mặt di truyền mà phương pháp lai giông cổ điển không thực hiện được.
Chuyển các gen mong muốn vào cây trồng.
Sản xuất các chất có hoạt tính sinh học từ tế bào nuôi cấy.
Ứng dụng (tt)
Ứng dụng (tt)
Nuôi cấy mô tế bào còn là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật
Bằng phương pháp nuôi cấy mô, ta hoàn toàn có thể loại bỏ được những cá thể nhiễm bệnh (phục tráng giống)
Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩm cuối cùng, giúp cơ giới hoá được khâu trồng trọt và thu hoạch. Nhờ đó mà năng suất lao động tăng lên. Với công nghệ mới này năng xuất của người nông nghiệp tăng thêm 2500 lần – không có lĩnh cực công nghệ nào có thể sánh nổi.
Chỉ với 3 người, Phòng nuôi cấy mô – Trung tâm Giống và Kĩ thuật cây trồng có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu cầu của kháchhàng.
LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN
4 giai đoạn:
+ giai đoạn I: 1902 – 1930: Thử nghiệm ban đầu, giai đoạn khởi xướng: Haberlandt, Đức (1902): “Tính toàn năng của tế bào thực vật’’. Tuy nhiên ông đã không thành công với các tế bào mô mềm, biểu bì do chúng không thể phân chia được. ko thành công do thiếu thông tin về chất ĐHST, môi trường nuôi cấy…. các yếu tố ảnh hưởng khác.
+ giai đoạn II: 1934- 1954: Phát hiện vai trò của các vitamin, các chất ĐHST (au xin, cytokynin)
+ Xây dựng được môi trường cơ bản: MS, N6, B5.
LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN
+ giai đoạn III: 1957 – 1999: Thực hiện tách và nuôi cấy tế bào đơn,. Biết vai trò và tỷ lệ của Aux/ Cyt, tao protoplast và tái sinh cây. Tạo cây đơn bội từ nuôi cấy hạt phấn. Và từ 1980 là phát triển của CN gen thực vật
+ giai đoạn IV: 1999 – nay: Ứng dụng các thành tựu vào sản xuất với quy mô lớn.
Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô tế bào ở VN
Công nghệ NCMTBTV du nhập vào nước ta từ năm 1960 ở miền Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ năm 1980.
Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng.
Bắt đầu từ 1975, PTN nuôi cấy mô tế bào đầu tiên: Viện CNSH, Viện KHVN (hà nội)
Viện Sinh học nhiệt đới TP HCM
Đại học NN I
Viện KHKT NN Việt nam
Viện di truyền NN
Viện rau quả TW
Sở NN & PTNN ở các tỉnh.
Hiện nay có 6 phòng thí nghiệm trọng điểm và hơn 60 phòng thí nghiệm CNSH
Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô tế bào ở VN
Vi nhân giống khoai tây, dứa, chuối, mía
Cây hoa: Phong Lan, Cúc,cẩm chướng,
Cây rừng: bạch đàn,keo lai..
Cây dược liệu:
Chọn dòng: dòng tế bào kháng bệnh, chịu mặn, chịu hạn
Dung hợp tạo cây lai:
Hiện nay, 100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô.
2008 công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới: Nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh quý hiếm, khôi phục nhiều loài Lan rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng đặc biệt là loài lan Hài hồng - loài lan hài duy nhất có hương thơm trên thế giới…
Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô tế bào ở VN
Chuối
Musa Cavendish
Dứa
Ananas comosus
Trinh nữ hoàng cung
Crinium latifolium
Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô tế bào ở VN
Ở nước ta cây trồng chuyển gen mới chỉ được nghiên cứu ở các viện, các phòng thí nghiệm, mà chưa được sản xuất ở quy mô lớn, đại trà như viện Di truyền Nông nghiệp, viện Công nghệ sinh học, viên Lúa đông bằng sông Cửu Long…và một số chương trình từ dự án quốc gia và quốc tế và thành công trong việc chuyển một số gene diệt sâu, bệnh, kháng thuốc vào một số cây như lúa, ngô, cải bắp…
Đậu tương chuyển gen kháng chất diệt cỏ
Đu đủ chuyển gen kháng virus
Cây không chuyển gen
Cây chuyển gen
Ngô chuyển gen kháng côn trùng
Một số thành tựu
1. Công nghệ Sinh học phục vụ Nông nghiệp. UBKHKT Nhà Nước. (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Văn Uyển, 1981-1985)
2. Vi nhân giống cây khoai môn và khoai sọ. Đề tài do International Foundation for Science (Thụy Điển) tài trợ. (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Văn Uyển, 1982-1986).
3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong vi nhân giống cây cà phê lai Arabusta. MS 52D 01-05, UBKHKT Nhà Nước. (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Văn Uyển, 1987-1990)
4. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân nhanh cây ăn trái, cây dược liệu và cây rừng. KC.08.13, Bộ Nông nghiệp. (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Văn Uyển, 1991-1994).
Một số thành tựu
5. Nghiên cứu nhân nhanh một số dòng điều (Anacardium occidentale L.) cao sản bằng phương pháp quang tự dưỡng và nuôi cấy lớp mỏng. Đề tài nhánh của chương trình KC. 04.08 (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Thị Quỳnh, 2001-2003)
6. Nghiên cứu phương pháp vi nhân giống thích hợp cho một số giống điều (Anacardium occidentale L.) có chất lượng cao để phục vụ cho việc ghép cành. Đề tài nhánh của đề tài trọng điểm cấp Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Thị Quỳnh, 2002 -2003).
7. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên sự tăng trưởng của cây thân gỗ nhiệt đới nuôi cấy in vitro. Đề tài KHCB, MSĐT: 62 07 02, Bộ KH&CN (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Thị Quỳnh, 2002 -2004).
Một số thành tựu
8. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy không đường kết hợp với kỹ thuật tăng cường CO2 và O2 trong hộp nuôi cấy lên sự tăng trưởng của một số cây trồng có giá trị kinh tế cao trong giai đoạn in vitro và ex vitro. Đề tài KHCB, MSĐT: 62 13 05, Bộ KH&CN (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Thị Quỳnh, 2005 -2006).
9. Hoàn thiện quy trình nhân nhanh in vitro bằng mầm chồi cây điều (Anacardium occidentale L.) cao sản. Đề tài cấp Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Thị Quỳnh, 2005 -2006).
10. Nghiên cứu triển khai phương pháp ứng dụng các nguồn hydratcacbon khác nhau trong môi trường nuôi cấy lan Dendrobium và Phalaenopsis ở điều kiện ánh sáng tự nhiên và chuyển giao quy trình nhân giống phong lan nuôi cấy mô tại tỉnh Bình Phước.
Một số thành tựu
11. Nghiên cứu xây dựng công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng bán tự động để sản xuất cây cấy mô (lan Dendrobium và Hông Paulownia) (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Thị Quỳnh, 2007 -2009).
12. Tái sinh cây Hồ tiêu (Piper nigrum L.) in vitro bằng nuôi cấy mảnh lá (CNĐT: Đỗ Đăng Giáp, 2006-2007)
CƠ SỞ KHOA HỌC
Mô hình cấu trúc của tế bào
Đặc điểm của tế bào thực vật
Tính toàn năng của tế bào thực vật
Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật
MÔ HÌNH CẤU TRÚC CHUNG CỦA TẾ BÀO
CẤU TẠO VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO THỰC VẬT
Một số đặc điểm của tế bào thực vật
Có thành xellulô bao bọc
Có lạp thể là cơ quan của sắc tố. Đóng vai trò quan trọng trong quang hợp
Có không bào là nơi chứa chất dự trữ chủ yếu là tinh bột.
Các quá trình chức năng của tế bào
Sinh trưởng và trao đổi chất của tế bào
Sinh tổng hợp protein
Hình thành các tế bào mới
Sinh trưởng và trao đổi chất của tế bào
Quá trình dị hóa (catabolism) nhằm phân huỷ các phân tử hữu cơ phức tạp để thu nhận năng lượng (dưới dạng ATP) và lực khử;
Quá trình đồng hóa (anabolism) sử dụng năng lượng và lực khử để xây dựng các phân tử hữu cơ phức tạp, đặc thù và cần thiết.
Sinh tổng hợp protein
Sinh tổng hợp protein là quá trình tế bào tổng hợp những phân tử protein đặc trưng và cần thiết cho hoạt động sống của mình
Quá trình phiên mã là quá trình tổng hợp những phân tử RNA thông tin dựa trên trình tự khuôn của DNA. Trên khuôn mRNA mới được tạo ra, một phân tử protein sẽ được tạo thành nhờ quá trình dịch mã.
Hình thành các tế bào mới
Phân bào là quá trình sinh sản từ một tế bào (gọi là tế bào mẹ) phân chia thành hai tế bào non
Đây là cơ chế chính của quá trình sinh trưởng của sinh vật đa bào và là hình thức sinh sản của sinh vật đơn bào
Chu trình tế bào
Pha G1: Tế bào lớn lên về kích thước, phiên mã, dịch mã, kiến tạo tế bào
Pha S: DNA nhân đôi
Pha G2: Tổng hợp các chất cần thiết cho phân bào
Pha M: Phân chia nhiễm sắc thể và tế bào chất
Hệ thống các điểm kiểm soát
Kiểm tra các tổn thương của DNA và các sai sót trong các quá trình quan trọng của chu kỳ tế bào
Khi có sự không tương thích nào đó, các điểm kiểm soát có thể chặn quá trình luân chuyển qua các pha của chu kỳ tế bào
Nếu hệ thống này phát hiện có điều gì bất thường, thì một mạng lưới các phân tử dẫn truyền thông tin (signal transduction) sẽ hướng dẫn tế bào ngưng phân chia ngay
SỰ PHÂN BÀO
Thực vật có thể sinh trưởng được nhờ sự phân bào. Có 2 kiểu phân bào:
- Nguyên phân
- Giảm phân
Nguyên phân
2 tế bào con hình thành
Ở thực vật, quá trình phân chia nguyên phân xảy ra ở mô phân sinh
NGUYÊN PHÂN
Giảm phân
Xảy ra ở các tế bào sinh dục (sinh giao tử đực và cái.
Gồm có 2 giai đoạn:
- Giảm phân I: thực hiện sự phân tách các cặp NST tương đồng. Xảy ra sự trao đổi chéo của các NST. Kết quả là hình thành 2 tế bào con có số NST bằng nửa tế bào mẹ
Các tế bào được phân chia theo kiêu gián phân – số NST không thay đổi để tạo nên 4 tế bào mang một nửa số lượng NST của tế bào mẹ ban đầu.
Chúng được gọi là những tế bào đơn bội
Giảm phân II
THỰC VẬT
Cơ thể thực vật được cấu tạo từ những đơn vị hình thái được gọi là tế bào.
Mô: Tập hợp của nhiều TB khác biệt về hình thái hoặc chức năng:mô thịt lá, mô biểu bì…
Cơ quan:tập hợp nhiều mô: thân, lá, rễ…
Cơ thể: tập hợp của nhiều cơ quan
Chu trình sinh trưởng ở thực vật
Sự nảy mầm của hạt
Sự phát triển cây con
Sự tăng trưởng của rễ và thân
Sự biệt hóa của các tế bào.
Sự nảy mầm của hạt
Cơ thể thực vật có phôi phát triển kể từ khi hạt nảy mầm gồm rễ phát triển xuống đất và chồi gồm thân mang lá phát triển trong khí quyển
Sự nảy mầm của hạt
Sự phát triển của cây con
Ðầu tiên cây con tăng trưởng hơi chậm, nhưng sau đó tăng trưởng với một tốc độ nhanh hơn trong một thời gian dài hơn và cuối cùng chậm lại và có thể dừng tăng trưởng khi cây sắp trưởng thành
Sự tăng trưởng của thân và rễ
Sự tăng trưởng của rễ và thân của cây con có được là nhờ sự phân cắt và sự tăng dài của tế bào của hai mô phân sinh ngọn rễ và ngọn thân.
vùng mô phân sinh ngọn rễ, và thân gồm những tế bào nhỏ có khả năng phân chia tích cực
Khi các tế bào được mới được đẩy ra khỏi vùng mô phân sinh ngọn, do số lượng tế bào tăng lên sự phân cắt chậm lại thì sự gia tăng kích thước tế bào loàm cho rễ và thân dài và to lên
Sự tăng trưởng của rễ và thân
Sự biệt hóa của các tế bào
Tất cả những tế bào mới được sinh ra từ mô phân sinh thì cơ bản giống nhau, chúng sẽ trở thành các loại mô khác nhau. Quá trình tế bào thay đổi từ những hình dạng chưa trưởng thành đến trưởng thành gọi là sự chuyên hóa (differentiation).
Các kiểu sinh sản ở thực vật
Thực vật có thể tạo thêm nhiều cá thể mới bằng hai kiểu sinh sản:
- Sinh sản vô tính
- Sinh sản hữu tính
Sinh sản vô tính
Kiểu sinh sản không qua thụ tinh.
Sự tách rời một phần cơ thể mẹ và sự phát triển cá thể mới từ phần đó.
Cơ quan thực vật dùng để sinh sản vô tính là chồi nách, thân, rễ, củ, giò, thân bò…
Không qua thụ tinh và tái tổ hợp gen nên không làm thay đổi nội dung di truyền.
Các hình thức sinh sản vô tính
Sinh sản bằng bào tử:Cơ thể mới được phát triển từ bào tử, bào tử lại hình thành trong túi bào tử từ thể bào tử (rêu, dương xỉ)
Sinh sản sinh dưỡng: giâm, chiết , ghép
Nuôi cây mô tế bào thực vật
Sinh sản hữu tính
Sự tham gia của các yếu tố quy định giới tính: kết hợp hai giao tử đực và cái trong quá trình thụ tinh hình thành hợp tử.
- Ở TV bậc cao (TV có hoa): thụ phấn và thụ tinh
PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ
1. Phòng rửa dụng cụ
2.Phòng chuẩn bị môi trường, hấp tiệt trùng, chứa dụng cụ
3.Phòng cấy vô trùng
4.Phòng nuôi mẫu cấy.
5. Phòng quan sát và thu nhận số liệu
Sơ đồ bố trí các phòng
Phòng rửa dụng cụ
Phải có: bồn rửa, có đường thoát riêng cho axit.
Thiết bị: máy cất nước 1 lần, 2 lần
tủ đựng dụng cụ thuỷ tinh chưa sử dụng
Có kệ để các dụng cụ
2.Phòng sấy hấp
3. Phòng chuẩn bị môi trường
pH meter
Máy khuấy từ
Cân phân tích 10-4 g
Cân kỹ thuật 100-2g
Máy rót môi trường
Bếp điện
Microwave
Tủ lạnh 100-200 l
Tủ lạnh sâu (-20 đến -800C)
4. PHÒNG CẤY VÔ TRÙNG
Laminar (tủ cấy vô trùng)
Quạt thông gió
Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường
Thiết bị lọc không khí
Giá và bàn để môi trường
Bộ dụng cụ cấy, đèn cồn
Một số dụng cụ
5.Phòng nuôi mẫu cấy
Tất cả các mẫu cấy đều được nuôi trong điều kiện nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, độ dài chiếu sáng, độ thông khí thích hợp.
Phòng nuôi có nhiệt độ 15 – 300 tuỳ theo mẫu cấy và mục đích của thí nghiệm.
Ánh sáng: ánh sáng huỳnh quang và có thể điều chỉnh được cường độ và thời gian chiếu sáng.
Các thiết bị trong phòng này
Gồm có các giá có tầng để bình hoặc ống nghiệm nuôi cấy. Các giá có lắp đèn để chiếu sáng. có độ chiếu sáng ở chỗ để bình nuôi cấy từ 2000-3000 lux.
Trong phòng cần có máy móc để kiểm tra chính xác nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, máy điều hoà nhiệt độ.
Phòng nuôi cây
Cải biến hệ thống phát sáng (đèn Compact 3U)
6. Phòng sinh hóa
- Phòng này dùng để tiến hành các phân tích sinh hoá, phân tử và di truyền.
- Phòng này cần các thiết bị: tủ hút, ccân các loại, tủ ấm, máy cắt tiêu bản, máy đo pH, máy điện di, máy PCR, máy sắc ký…
Phòng thí nghiệm
Một số kiểu bình nuôi cấy
Bình serum (đựng dung dịch khoáng trong các bệnh viện)
Các loại hộp nhựa
Cây hoa Lily nuôi cấy trong hộp nhựa (sản xuất tại Mỹ, giá 5 USD)
Cây hoa Lily nuôi cấy trong hộp nhựa (sản xuất tại Viêt Nam, 700 - 1000 đồng)
Túi nhựa (nylon, có bán rộng rãi trên thị trường, giá 30 – 50 đồng/túi)
Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật:
Đảm bảo điều kiện vô trùng.
Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách
Chọn mô cấy và xử lí mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.
1.Đảm bảo điều kiện vô trùng
1.1.Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật
1.2.Khử trùng
Ý nghĩa của việc vô trùng
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin..rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm,khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi.
Có 3 nguồn nhiễm tạp chính:
Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối.
Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử vi khuẩn.
Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên môi trường.
2.Khử trùng
2.1.Khử trùng phòng cấy và tủ cấy
- Bằng hơi formol
- Bằng đèn cực tím
Bằng cồn: lau tất cả bề mặt của tủ cấy trước khi làm việc
Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều vô trùng trước: tủ quần áo choàng, mũ vải, khẩu trang, dao kéo..Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng khi cấy và một cốc đựng cồn 95% để nhúng dụng cụ làm việc
2.2.Khử trùng bình cấy và các dụng cụ khác
Dụng cụ: thủy tinh, kim loại
- Bằng không khí nóng (tủ sấy): 130- 1700 trong 2 – 4 giờ
- Bằng autoclave (hơi nước dưới áp suất thấp):10-15 phút ở 1210C:Nút gòn, vải, các dụng cụ thủy tinh, bình nuôi cấy bằng plastic, nút cao su, pipet, nước, môi trường khoáng… đều có thể khử trùng bằng nồi hấp
b.Khử trùng môi trường khoáng: phương pháp hấp tiệt trùng và lọc bằng màng lọc vô trùng
Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở 1210C (Burgerr, 1988)
Khử trùng mẫu cấy thực vật
Khử trùng mẫu cấy là việc làm khó vì mẫu sống không thể khử bằng nhiệt độ cao mà phải giữ được bản chất sinh học của nó. Do đó mẫu cấy thực vật phải được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng.
Các mẫu cấy khi chọn lựa phải được rửa trước bằng xà phòng dưới dòng nước chảy rồi mới cho vào ngâm trong dung dịch khử trùng
Khi xử lí xong mô cấy được rửa nhiều lần trong nước cất vô trùng (3-5 lần).
Các mô thực vật thường được sử dụng để nuôi cấy là:
Đỉnh sinh trưởng thân, rễ
Chồi bên
Vảy củ
Chồi ngọn
Nhu mô lá, nhu mô vỏ thân
Chồi nảy từ củ
Bao phấn, hạt phấn
Hạt
Các dung dịch khử trùng
Chú ý
Việc xử lí thành công nguồn gây nhiễm phần lớn phụ thuộc vào kỹ thuật xử lí trong nuôi cấy vô trùng. Các nguồn gây nhiễm là bụi tóc, tay, quần áo vì vậy trong khi cấy phải rửa tay,lau bằng cồn 70 tới khủy tay, tay áo phải xoắn cao lên, kẹp tóc gọn.. Không nói chuyện hoặc nhảy mũi trong khi đang cấy. Khi cấy không nên chạm tay vào mặt trong của bình cấy cũng như các dụng cụ cấy. Không đưa vào tủ cấy các bình cấy đã bị nhiễm vì bào tử có thể phát tán trong tủ cấy
2. Môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường
Cách chọn môi trường
Cách pha chế môi trường
Thành phần hóa học của môi trường nuôi cấy mô tế bào TV
Các muối khoáng: đa lượng, vi lượng
Nguồn các bon: các loại đường
Các vitamin
Các chất điều hoà sinh trưởng
Các hợp chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây
Các aminoaxit
Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: Thạch (agar)
Than hoạt tính
2.1.Các chất khoáng
Mg là một phần của phân tử diệp lục,
Ca là thành phần của màng tế bào,
N là thành phần quan trọng của amino axít, vitamin, protein và các axít nucleic.
Fe, Zn và Mo cũng là thành phần của một số enzym.
Vì vậy, muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Các chất khoáng
Muối khoáng là các vật liệu (nguồn N, S, P....) cho sự tổng hợp các chất hữu cơ. Nitơ, lưu huỳnh, phốt-pho là các thành phần không thể thiếu của các phân tử protein, các axít nucleic và nhiều chất hữu cơ khác.
Đóng vai trò như một thành phần không thể thiếu của nhiều enzym (là các co-factor): Magie, kẽm, sắt... và nhiều nguyên tố vi lượng là những phần quan trọng của các enzym.
Các ion của các muối hoà tan đóng vai trò quan trọng ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường và tế bào. K+ và Ca2+ rất quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc của tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt hoá nhiều enzym.
Các muối khoáng đa lượng
Các muối của các nguyên tố như N, P, K, S,
Nitơ (N): nitơ vô cơ dưới dạng nitrat (NO3-) hoặc amonium (NH4+) Amonium được cung cấp dưới dạng (NH4)2SO4 hoặc NH4NO3
Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc NH4NO3
Amonium chủ yếu được dự trữ ở rễ như nguồn nitơ hữu cơ. Nitrat có thể được vận chuyển theo mạch xylem đến các bộ phận của cây, tại đó nó sẽ tham gia vào quá trình đồng hoá nitơ. Nitrat có thể được dự trữ ở không bào và thực hiện chức năng quan trọng trong việc điều chỉnh sự thẩm thấu và cân bằng ion của cây trồng
Phospho (P):
Tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nuclêic và tham gia cấu trúc của màng.
Axit nucleic : P là một nguyên tố thiết yếu trong cấu tạo của DNA và RNA để nối các đơn phân tử axít ribonucleic để tạo thành đại phân tử.
Phospholipid: Phospholipid của màng sinh học cũng có chứa một lượng lớn P.
Quá trình chuyển hoá năng lượng: Phospho ở dạng liên kết cao năng giữa hai nguyên tử P như trong phân tử ATP (P-P = 30 kJ)
Các enzym: P vô cơ trong thành phần của các enzym cũng có khả năng điều chỉnh tốt trong nhiều quá trình trao đổi chất của thực vật: chín của quả, tổng hợp tinh bột của lục lạp.
Photpho được cung cấp dưới dạng mono hay dihydrogenphosphate potasium hay sodium: NaH2PO4, KaHPO4
Phospho (P):
Sự thiếu P làm cây chậm lớn, lá cây có màu xanh thẫm do trong thời gian bị thiếu P, sự phát triển của lá chậm hơn sự tổng hợp diệp lục tố nên làm tăng nồng độ diệp lục tố trong lá cây
Kali (K):
K+ là một cation chủ yếu trong cây, giúp cho cây cân bằng các anion vô cơ và hữu cơ. Ion K+ được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có vai trò chính là điều hòa pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào. Sự thiếu hụt K+ trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thiếu nước.
K+ được cung cấp dưới dạng muối KNO3, KCl. 6H2O, KH2PO4
Vai trò của K+ đối với các enzym: K+ cần thiết cho hoạt động của nhiều enzym. Sự liên kết của K+ với enzym gây ra sự thay đổi cấu hình không gian của enzym, do đó làm tăng ái lực của enzym với cơ chất. Khi thiếu K+ người ta thấy có sự tăng nồng độ đường hoà tan và các hợp chất chứa nitơ, kèm theo sự giảm nồng độ tinh bột
Sự giãn của tế bào: điều chỉnh tính thấm tăng tính thấm
Sự cân bằng ion: K+ có vai trò quan trọng cho việc duy trì cân bằng ion
Lá bình thường, thiếu P, K, N
Lưu huỳnh (S):
các hợp chất có chứa lưu huỳnh như amino axít, protein và enzym
Canxi (Ca):
Trong nuôi cấy tế bào, Ca2+ có vai trò trong sự phát sinh hình thái đồng thời với sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng đặc biệt là auxin và cytokinin
Ca2+ là thành phần quan trọng của thành tế bào và màng tế bào. Pectin là thành phần quan trọng của màng liên kết giữa các bế bào với nhau và được phân huỷ nhờ enzym polygalacturonase. Tuy nhiên, Ca ức chế mạnh hoạt động của polygalacturonaza. Hoạt động mạnh của enzym này được ghi nhận khi thiếu Ca. Nếu nồng độ Ca có đủ thì hầu hết các pectin sẽ tồn tại dưới dạng muối canxipectat. Nhờ vậy, thành tế bào có khả năng chống chịu tốt đối với hoạt động phá huỷ của enzym polygalacturonaza
Canxi (Ca):
Ion Ca2+ có tác động lớn đến sự ổn định của màng tế bào.
Sự thiếu ion Ca2+ sẽ làm tăng khả năng thoát ra ngoài màng tế bào của các hợp chất phân tử lượng nhỏ. Màng tế bào có thể sẽ bị phân huỷ hoàn toàn khi thiếu hụt nghiêm trọng ion Ca2+
Magiê (Mg):
Magnesium là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tổng hợp diệp lục tố và đồng thời nó cũng tham gia vào cấu trúc của một số enzim vận chuyển photphate
Vai trò Mg2+ của đối với quang hợp: Mg2+ là nguyên tử trung tâm trong phân tử chlorophyl của hệ quang hợp I và II. Trong phân tử chlorophyl, các photon được hấp thụ tạo ra dòng điện tử, từ đó tạo ra ATP và NADPH đóng vai trò quan trọng đối với cố định CO2
Vai trò Mg2+ đối với hoạt tính của các enzym: Mg2+ là ion cần thiết cho cấu trúc bậc ba của nhiều phức enzym-cơ chất Mg2+ tham gia vào quá trình tổng hợp protein với nhiều cấp độ khác nhau. Mg2+ tạo thành cầu nối giữa các dưới đơn vị của ribosome. Khi thiếu Mg2+, các dưới đơn vị sẽ bị tách ra và quá trình tổng hợp protein bị ngừng lại
Magiê (Mg):
Sự hoạt động của các enzym như: RNA polymeraza tham gia vào quá trình sinh tổng hợp RNA đòi hỏi phải có mặt Mg2+, do đó thiếu Mg2+ sẽ kìm hãm sinh tổng hợp RNA
Vai trò Mg2+ đối với chuyển hoá năng lượng: đối với sinh tổng hợp ATP (ADP + P vô cơ = ATP) Mg2+ tạo thành cầu nối giữa enzym và ADP, Mg2+ còn có khả năng tạo phức với ATP
MgSO4 là nguồn bổ sung ion Mg+ duy nhất cho mô cấy.
Các nguyên tố vi lượng (Fe, B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Zn...)
a. Sắt (Fe):Trong cây, sắt chủ yếu được gắn với các phức chất (sắt-cacbonhydrate): Các hemoprotein (các protein chứa sắt):
1.cytochrome: Các cytocrome tạo thành một phần hệ thống oxi hoá trong chuỗi truyền điện tử ở lục lạp và ty thể của tế bào thực vật.
2.Các protein sắt-lưu. Ferridoxin là protein chứa sắt lưu huỳnh phổ biến nhất và là chất mang trong các phản ứng truyền điện tử được xúc tác bởi nitrit reductaza, sulphat reductaza, quá trình tổng hợp NADP+ trong quang hợp và khử nitơ được thực hiện nhờ phức hệ nitrogenaza
a. Sắt (Fe):
Sắt rất quan trọng trong sinh tổng hợp chlorophyl: Trong lá xanh 80% sắt nằm trong lục lạp. Khi thiếu sắt, toàn bộ sắt sẽ tập trung ở lá.
Trong lá non, thiếu sắt sẽ dẫn đến sự giảm nhanh nồng độ chlorophyl do quá trình tổng hợp protein bị ngưng lại. Số lượng ribosom cũng giảm mạnh.
Thiếu sắt ở rễ kéo theo những thay đổi hình thái. Sự dài rễ giảm nhưng diện tích và số lượng lông rễ tăng.
B cần thiết cho sự hoạt động của đỉnh sinh trưởng bởi vì nó có mặt trong sự sinh tổng hợp các base nitơ đặc biệt là uracil, cũng như cần thiết cho sự sinh tổng hợp lignin và acid phenolic.
Thiếu B sẽ làm giảm sự sinh tổng hợp cytokinin. Sự phân chia tế bào bị kìm hãm do có sự giảm sinh tổng hợp ARN trong nhân.
b. Bo (B):
Đồng (Cu):
Đồng hiện diện trong hệ thống enzim cytochrome oxidase của chuổi vận chuyển điện tử hô hấp. Trong thực vật, đồng tồn tại dưới dạng ion hóa trị 1 và 2. Nồng độ đồng cao sẽ gây độc cho mô.
Các ion đồng được bổ sung vào dưới dạng sulfate đồng, đôi khi người ta cũng có thể bổ sung đồng dưới dạng CuCl 2 hoặc CuNO3.
Trong tế bào, đồng chủ yếu là thành phần của phức hệ enzym và rất quan trọng trong các phản ứng oxi hoá khử [(Cu2+)/(Cu+)] được thực hiện nhờ những enzym này. Thiếu đồng lập tức dẫn đến sự giảm hoạt độ của các enzym chứa đồng.
Đồng (Cu):
Vai trò của đồng đối với quang hợp: Khoảng 50% đồng trong lục lạp được gắn với plastocyanin, ở giữa chuỗi truyền điện tử, giữa quang hệ I và quang hệ II, có chứa 1 nguyên tử đồng trên 1 phân tử Trong trường hợp thiếu đồng, nồng độ các plastocyanin sẽ bị giảm. Cũng giống như plastocyanin, các plastoquinone đóng vai trò quan trọng trong truyền điện tử giữa quang hệ I và quang hệ II. Do đó, hiện tượng thiếu đồng nhanh chóng kéo theo hiện tượng giảm quang hợp.
Kẽm (Zn):
Thiếu kẽm thì sự sinh tổng hợp protein, acid nuclêic và diệp lục tố sẽ bị giảm đi. Thực vật có đốt thân ngắn, lá nhỏ, đồng thời tế bào trần cũng kém phát triển.
Tổng hợp IAA: kẽm là một thành phần trong enzim có liên quan đến sự tổng hợp tiền chất của IAA là trytophan Thiếu kẽm cũng phá hỏng quá trình tổng hợp indol acetic acid trong cây (Indol ---> Trytophan ---> Indol Acetic Acid)
Nồng độ của kẽm bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy thay đổi từ 0,1-70 mm, như vậy sự dư kẽm trong môi trường nuôi cấy ít gây độc cho mô.
Kẽm được hệ rễ hấp thu dưới dạng Zn2+
Kẽm (Zn):
Tổng hợp protein: Kẽm rất quan trọng trong quá trình tổng hợp protein. Thiếu kẽm gây ảnh hưởng lớn đến quá trình tổng hợp protein. Sự tập trung ribosom và sự tích luỹ các tiền chất của protein như các amino axít và các amin, có thể xẩy ra nhờ kẽm. Zn cần cho hoạt động của RNA polymeraza.
Dưới điều kiện thông thường, RNA polymeraza chứa 2 nguyên tử Zn, tạo ra cấu trúc điển hình của enzym. Hơn nữa, có 1 mối quan hệ nghịch tương ứng giữa nồng độ Zn và hoạt động của RNAse . Nồng độ Zn thấp sẽ làm tăng hoạt động của RNAse
2.2.Nguồn carbon (C)
Trong nuôi cấy invitro, nguồn các bon giúp cho mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối.
Đường sucrose (saccharoza) là nguồn cacbon chủ yếu và được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các môi trường nuôi cấy
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, Các mô và tế bào thực vật trong môi trường nuôi cấy ít có khả năng tự dưỡng và vì thế cần thiết phải bổ sung nguồn carbon bên ngoài để cung cấp năng lượng Vì vậy, việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc
Nồng độ sử dụng tuỳ theo mục đích nuôi cấy : 2- 5% (w/v) %, song cũng còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi có khi giảm xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào) và tăng lên đến 12% (cảm ứng stress nước).
Nguồn cácbon
glucose cũng thường được đưa vào môi trường nuôi cấy và cho hiệu quả tương đương sucrose
Các carbohydrate khác, như: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose, melibiose và trehalose cũng đã được thí nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả
3. Các vitamin
Các vitamin là rất cần thiết cho các phản ứng sinh hoá.
Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có sức sinh trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin Thông thường Thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng.
Các vitamin thường được sử dụng trong nuôi cấy:
Thiamin (B1), Axit nicotinic (PP), pyridoxin HCl (B6) và myo-inositol, axit ascobic (vitamin C), vitamin E.
Nồng độ sử dụng các vitamin này: 1 – 10 mg/l.
Các vitamin khác như biotin, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid, vitamin E (tocopherol), riboflavin và p-aminobenzoic acid cũng được sử dụng
5. Một số chất hữu cơ
Nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, cam, cà chua.
Nước dừa được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay: nước dừa được chứng minh là một myo-inositol và một số axitamin khác. Lượng nước dừa thường dùng là 15 – 29% thể tích môi trường.
Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng
Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác
Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào. Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng trong môi trường nuôi cấy tế bào và nuôi cấy tế bào trần
Các nguồn nitrogen hữu cơ thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate (0,05-0,1%) , L-glutamine (8 mmol/L), L-asparagine, L- glicine ((2 mmol/L), và adenine
6. Than hoạt tính
Có tác dụng khử độc, than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenolđộc do mô tiết ra trong thời gian nuôi cấy.
Than hoạt tính nói chung ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng hoặc làm đen môi trường. Người ta cho rằng tác dụng cản sự tăng trưởng của mô cấy khi có sự hiện diện của than hoạt tính trong môi trường là do nó hút chất điều hòa sinh trưởng có trong môi trường
Thường được bổ sung với nồng độ 0,5 – 3%.
6. Yếu tố làm đặc môi trường (Agar)
Agar là một loại polysaccharide thu được từ một số loài tảo (ngành tảo đỏ-Rhodophyta)
Aga thường được sử dụng để làm đặc môi trường trong nuôi cấy mô.
Đặc tính của agar là không bị thuỷ phân bởi enzym thực vật, không phản ứng với các chất trong môi trường nuôi cấy.
Nồng độ sử dụng: 0,5 – 10%
4. Các chất ĐHST
Chất ĐHST
- Abscisic acid
- Indole-3-acetic acid
- Naphthaleneacetic acid
- 2,4-Dichlorophenoxy
acetic axit
- 6-Fururylaminopurine
- Amino purine
- Gibberellic acid
Viết tắt
ABA
IAA
NAA
2,4D
IBA
Kinetin
Zeatin
GA3
CÁC CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƯỞNG THỰC VẬT
Là các chất hữu cơ có bản chất hoá học khác nhau, được tổng hợp với một lượng nhỏ ở các cơ quan, bộ phận nhất định của cây và từ đấy được vận chuyển đến tất cả các cơ quan, bộ phận khác để điều tiết các hoạt động sinh lý, các quá trình sinh trưởng, phát triển của cây và để đảm bảo mối quan hệ hài hoà giữa các cơ quan, bộ phận trong cơ thể.
CÁC CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƯỞNG THỰC VẬT
Là những chất có bản chất hóa học khác nhau nhưng đều có tác dụng điều tiết quá trình sinht rưởng phát triển của cây.
Phytohoocmon là các chất hữu cơ được tổng hợp với một lượng nhỏ ở các cơ quan, bộ phận khác nhau để điều tiêt các hoạt động sinh lí, quá trình sinh trưởng, phát triển.
Nhóm Auxin
Nhóm cytokinin
Nhóm Gibberelin
Acid absicic. Etylen…
AUXIN
Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indol axetic axit (IAA)
Các Auxin nhân tạo: NAA (napthyl axetic acid), 2,4-D (diclophenoxy axetic acid)
Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng),
MÔN HỌC
GV. Khúc Thị An
NỘI DUNG MÔN HỌC
PHẦN I: Nuôi cấy mô tế bào thực vât (25 tiết)
PHẦN II: Nuôi cấy mô tế bào động vật (20 tiết)
PHẦN I: NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
Mở đầu
Lịch sử phát triển
Cơ sở khoa học
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật
ứng dụng của nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Mở đầu
Lịch sử phát triển công nghệ
Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy tế bào động vật
Nguyên tắc nuôi cấy và duy trì dòng tế bào động vật invitro
Ứng dụng của công nghệ nuôi cấy tế bào động vật.
PHẦN II: NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Đức Lượng, 2004: Công nghệ tế bào, NXB Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh
2. Nguyễn Đức Thành, 2000: Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng. NXB Nông nghiệp Hà nội.
3.Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Tiến Thắng, 1996: Những kiến thức cơ bản về công nghệ sinh học, NXB Giáo dục
4.Nguyễn Văn Uyển, 1996: Những phương pháp công nghệ sinh học, NXB Nông nghiệp
TÀI LIỆU THAM KHẢO
5.Vũ Văn Vụ, Sinh lý thực vật ứng dụng, NXB GD – 1998
6. Công nghệ tế bào, Nguyễn Hoàng Lộc,NXB-2006
7. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, Lê văn Hoàng, NXB KHKT- 2008
8. Roberta H.Smith, 1992 : Plant tissue Culture; Techniques and Experiments. , Second edition. Academic Press, 2000.
Mục tiêu và yêu cầu môn học
Kiến thức:
+ nguyên tắc của một số kỹ thuật cơ bản của nuôi cấy mô và tế bào. Mục đích, ý nghĩa của từng loại kỹ thuật sử dụng
+ ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
Kỹ năng:
+ Nuôi cấy mô và tế bào trên các loại đối tượng: chuẩn bị môi trường nuôi cấy, các thao tác nuôi cấy, theo dõi, đánh giá sự sinh trưởng của tế bào nuôi cấy.
+ Bảo quản giống invitro
Một số yêu cầu
Môn học tiên quyết:
Không nghe điện thoại trong giờ học
Không được vào muộn
Kiểm tra giữa kỳ: 25%
Thi cuối kỳ (viết tự luận): 75%
Mở đầu
Một số thuật ngữ về nuôi cấy mô tế bào TV
Tầm quan trọng và ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Cơ sở khoa học của phương pháp
Một số thuật ngữ
Nuôi cấy tế bào
Tế bào từ các cơ thể nguyên vẹn (động vật và thực vật) có thể được tách riêng và cho nuôi cho phát triển trong các môi trường nuôi cấy có chứa hỗn hợp chất dinh dưỡng và nhân tố tăng trưởng.
Tính toàn năng (totipotency): Một đặc tính của tế bào là có khả năng phát triển thành mọi kiểu tế bào có trong cơ thể trưởng thành mà từ đó nó được tách ra, tức là có khả năng tái sinh thành một cơ thể hoàn chỉnh.
Một số thuật ngữ
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật
Là khái niệm mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng. Nuôi cấy các loại mô tách ra từ một phần nào đó của một cơ quan thực vật: lá, thân, hoa, rễ.
Nhân giống invitro:Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn gọi là vi nhân giống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác.
Lai tế bào soma
Tất cả các dạng nuôi cấy mô đều tiến hành qua 2 bước
Tách rời tế bào, mô hay cơ quan đang tương tác
Đặt trong môi trường thích hợp để nó có thể biếu lộ hết bản chất hoặc khả năng đáp ứng của nó.
(Tiến hành trong đk vô trùng)
Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
A.Mô sẹo từ. (BNuôi cấy dịch tế bào từ (C) Nốt sần (D) Đầu rễ. (E)Tái sinh cây (F) Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của. (H) Phôi vô tính của cây Coffea canephora. (I) Nuôi cấy rễ cây
Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Về mặt lý luận sinh học
Về mặt thực tiễn sản xuất
1.Về mặt lý luận
- Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc bản chất của sự sống.
- Nghiên cứu về đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, sự di truyền và tác dụng của các hoá chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy.
- Nghiên cứu qui luật sinh trưởng và phát triển cùng mối quan hệ của cá thể với môi trường.
2. Về mặt thực tiễn sản xuất
Hiện nay phương pháp nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm trở thành kỹ thuật nông nghiệp phổ biến.
Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn, gấp nhiều lần tốc độ vốn có của nó trong tự nhiên (nhân nhanh các cây trồng quí..) 130.000 cây Hồng/năm từ một gốc hồng.
Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên các tính trạng di truyền của cơ thể mẹ và làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất ở quy mô lớn, tạo sinh khối lớn các chất có hoạt tính SH (alkaloid, steroit)
Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Vi nhân giống
Tạo giống mới
Sản xuất dược liệu
Bảo quản giống invitro
Dựa vào kỹ thuật nuôi cấy để duy trì và bảo quản được nhiều giống cây trồng quý hiếm.
Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp protoplast (tế bào trần) để tạo ra những con lai xa về mặt di truyền mà phương pháp lai giông cổ điển không thực hiện được.
Chuyển các gen mong muốn vào cây trồng.
Sản xuất các chất có hoạt tính sinh học từ tế bào nuôi cấy.
Ứng dụng (tt)
Ứng dụng (tt)
Nuôi cấy mô tế bào còn là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật
Bằng phương pháp nuôi cấy mô, ta hoàn toàn có thể loại bỏ được những cá thể nhiễm bệnh (phục tráng giống)
Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩm cuối cùng, giúp cơ giới hoá được khâu trồng trọt và thu hoạch. Nhờ đó mà năng suất lao động tăng lên. Với công nghệ mới này năng xuất của người nông nghiệp tăng thêm 2500 lần – không có lĩnh cực công nghệ nào có thể sánh nổi.
Chỉ với 3 người, Phòng nuôi cấy mô – Trung tâm Giống và Kĩ thuật cây trồng có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu cầu của kháchhàng.
LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN
4 giai đoạn:
+ giai đoạn I: 1902 – 1930: Thử nghiệm ban đầu, giai đoạn khởi xướng: Haberlandt, Đức (1902): “Tính toàn năng của tế bào thực vật’’. Tuy nhiên ông đã không thành công với các tế bào mô mềm, biểu bì do chúng không thể phân chia được. ko thành công do thiếu thông tin về chất ĐHST, môi trường nuôi cấy…. các yếu tố ảnh hưởng khác.
+ giai đoạn II: 1934- 1954: Phát hiện vai trò của các vitamin, các chất ĐHST (au xin, cytokynin)
+ Xây dựng được môi trường cơ bản: MS, N6, B5.
LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN
+ giai đoạn III: 1957 – 1999: Thực hiện tách và nuôi cấy tế bào đơn,. Biết vai trò và tỷ lệ của Aux/ Cyt, tao protoplast và tái sinh cây. Tạo cây đơn bội từ nuôi cấy hạt phấn. Và từ 1980 là phát triển của CN gen thực vật
+ giai đoạn IV: 1999 – nay: Ứng dụng các thành tựu vào sản xuất với quy mô lớn.
Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô tế bào ở VN
Công nghệ NCMTBTV du nhập vào nước ta từ năm 1960 ở miền Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ năm 1980.
Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng.
Bắt đầu từ 1975, PTN nuôi cấy mô tế bào đầu tiên: Viện CNSH, Viện KHVN (hà nội)
Viện Sinh học nhiệt đới TP HCM
Đại học NN I
Viện KHKT NN Việt nam
Viện di truyền NN
Viện rau quả TW
Sở NN & PTNN ở các tỉnh.
Hiện nay có 6 phòng thí nghiệm trọng điểm và hơn 60 phòng thí nghiệm CNSH
Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô tế bào ở VN
Vi nhân giống khoai tây, dứa, chuối, mía
Cây hoa: Phong Lan, Cúc,cẩm chướng,
Cây rừng: bạch đàn,keo lai..
Cây dược liệu:
Chọn dòng: dòng tế bào kháng bệnh, chịu mặn, chịu hạn
Dung hợp tạo cây lai:
Hiện nay, 100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô.
2008 công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới: Nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh quý hiếm, khôi phục nhiều loài Lan rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng đặc biệt là loài lan Hài hồng - loài lan hài duy nhất có hương thơm trên thế giới…
Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô tế bào ở VN
Chuối
Musa Cavendish
Dứa
Ananas comosus
Trinh nữ hoàng cung
Crinium latifolium
Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô tế bào ở VN
Ở nước ta cây trồng chuyển gen mới chỉ được nghiên cứu ở các viện, các phòng thí nghiệm, mà chưa được sản xuất ở quy mô lớn, đại trà như viện Di truyền Nông nghiệp, viện Công nghệ sinh học, viên Lúa đông bằng sông Cửu Long…và một số chương trình từ dự án quốc gia và quốc tế và thành công trong việc chuyển một số gene diệt sâu, bệnh, kháng thuốc vào một số cây như lúa, ngô, cải bắp…
Đậu tương chuyển gen kháng chất diệt cỏ
Đu đủ chuyển gen kháng virus
Cây không chuyển gen
Cây chuyển gen
Ngô chuyển gen kháng côn trùng
Một số thành tựu
1. Công nghệ Sinh học phục vụ Nông nghiệp. UBKHKT Nhà Nước. (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Văn Uyển, 1981-1985)
2. Vi nhân giống cây khoai môn và khoai sọ. Đề tài do International Foundation for Science (Thụy Điển) tài trợ. (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Văn Uyển, 1982-1986).
3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong vi nhân giống cây cà phê lai Arabusta. MS 52D 01-05, UBKHKT Nhà Nước. (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Văn Uyển, 1987-1990)
4. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân nhanh cây ăn trái, cây dược liệu và cây rừng. KC.08.13, Bộ Nông nghiệp. (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Văn Uyển, 1991-1994).
Một số thành tựu
5. Nghiên cứu nhân nhanh một số dòng điều (Anacardium occidentale L.) cao sản bằng phương pháp quang tự dưỡng và nuôi cấy lớp mỏng. Đề tài nhánh của chương trình KC. 04.08 (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Thị Quỳnh, 2001-2003)
6. Nghiên cứu phương pháp vi nhân giống thích hợp cho một số giống điều (Anacardium occidentale L.) có chất lượng cao để phục vụ cho việc ghép cành. Đề tài nhánh của đề tài trọng điểm cấp Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Thị Quỳnh, 2002 -2003).
7. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên sự tăng trưởng của cây thân gỗ nhiệt đới nuôi cấy in vitro. Đề tài KHCB, MSĐT: 62 07 02, Bộ KH&CN (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Thị Quỳnh, 2002 -2004).
Một số thành tựu
8. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy không đường kết hợp với kỹ thuật tăng cường CO2 và O2 trong hộp nuôi cấy lên sự tăng trưởng của một số cây trồng có giá trị kinh tế cao trong giai đoạn in vitro và ex vitro. Đề tài KHCB, MSĐT: 62 13 05, Bộ KH&CN (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Thị Quỳnh, 2005 -2006).
9. Hoàn thiện quy trình nhân nhanh in vitro bằng mầm chồi cây điều (Anacardium occidentale L.) cao sản. Đề tài cấp Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Thị Quỳnh, 2005 -2006).
10. Nghiên cứu triển khai phương pháp ứng dụng các nguồn hydratcacbon khác nhau trong môi trường nuôi cấy lan Dendrobium và Phalaenopsis ở điều kiện ánh sáng tự nhiên và chuyển giao quy trình nhân giống phong lan nuôi cấy mô tại tỉnh Bình Phước.
Một số thành tựu
11. Nghiên cứu xây dựng công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng bán tự động để sản xuất cây cấy mô (lan Dendrobium và Hông Paulownia) (CNĐT: PGS. TS. Nguyễn Thị Quỳnh, 2007 -2009).
12. Tái sinh cây Hồ tiêu (Piper nigrum L.) in vitro bằng nuôi cấy mảnh lá (CNĐT: Đỗ Đăng Giáp, 2006-2007)
CƠ SỞ KHOA HỌC
Mô hình cấu trúc của tế bào
Đặc điểm của tế bào thực vật
Tính toàn năng của tế bào thực vật
Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật
MÔ HÌNH CẤU TRÚC CHUNG CỦA TẾ BÀO
CẤU TẠO VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO THỰC VẬT
Một số đặc điểm của tế bào thực vật
Có thành xellulô bao bọc
Có lạp thể là cơ quan của sắc tố. Đóng vai trò quan trọng trong quang hợp
Có không bào là nơi chứa chất dự trữ chủ yếu là tinh bột.
Các quá trình chức năng của tế bào
Sinh trưởng và trao đổi chất của tế bào
Sinh tổng hợp protein
Hình thành các tế bào mới
Sinh trưởng và trao đổi chất của tế bào
Quá trình dị hóa (catabolism) nhằm phân huỷ các phân tử hữu cơ phức tạp để thu nhận năng lượng (dưới dạng ATP) và lực khử;
Quá trình đồng hóa (anabolism) sử dụng năng lượng và lực khử để xây dựng các phân tử hữu cơ phức tạp, đặc thù và cần thiết.
Sinh tổng hợp protein
Sinh tổng hợp protein là quá trình tế bào tổng hợp những phân tử protein đặc trưng và cần thiết cho hoạt động sống của mình
Quá trình phiên mã là quá trình tổng hợp những phân tử RNA thông tin dựa trên trình tự khuôn của DNA. Trên khuôn mRNA mới được tạo ra, một phân tử protein sẽ được tạo thành nhờ quá trình dịch mã.
Hình thành các tế bào mới
Phân bào là quá trình sinh sản từ một tế bào (gọi là tế bào mẹ) phân chia thành hai tế bào non
Đây là cơ chế chính của quá trình sinh trưởng của sinh vật đa bào và là hình thức sinh sản của sinh vật đơn bào
Chu trình tế bào
Pha G1: Tế bào lớn lên về kích thước, phiên mã, dịch mã, kiến tạo tế bào
Pha S: DNA nhân đôi
Pha G2: Tổng hợp các chất cần thiết cho phân bào
Pha M: Phân chia nhiễm sắc thể và tế bào chất
Hệ thống các điểm kiểm soát
Kiểm tra các tổn thương của DNA và các sai sót trong các quá trình quan trọng của chu kỳ tế bào
Khi có sự không tương thích nào đó, các điểm kiểm soát có thể chặn quá trình luân chuyển qua các pha của chu kỳ tế bào
Nếu hệ thống này phát hiện có điều gì bất thường, thì một mạng lưới các phân tử dẫn truyền thông tin (signal transduction) sẽ hướng dẫn tế bào ngưng phân chia ngay
SỰ PHÂN BÀO
Thực vật có thể sinh trưởng được nhờ sự phân bào. Có 2 kiểu phân bào:
- Nguyên phân
- Giảm phân
Nguyên phân
2 tế bào con hình thành
Ở thực vật, quá trình phân chia nguyên phân xảy ra ở mô phân sinh
NGUYÊN PHÂN
Giảm phân
Xảy ra ở các tế bào sinh dục (sinh giao tử đực và cái.
Gồm có 2 giai đoạn:
- Giảm phân I: thực hiện sự phân tách các cặp NST tương đồng. Xảy ra sự trao đổi chéo của các NST. Kết quả là hình thành 2 tế bào con có số NST bằng nửa tế bào mẹ
Các tế bào được phân chia theo kiêu gián phân – số NST không thay đổi để tạo nên 4 tế bào mang một nửa số lượng NST của tế bào mẹ ban đầu.
Chúng được gọi là những tế bào đơn bội
Giảm phân II
THỰC VẬT
Cơ thể thực vật được cấu tạo từ những đơn vị hình thái được gọi là tế bào.
Mô: Tập hợp của nhiều TB khác biệt về hình thái hoặc chức năng:mô thịt lá, mô biểu bì…
Cơ quan:tập hợp nhiều mô: thân, lá, rễ…
Cơ thể: tập hợp của nhiều cơ quan
Chu trình sinh trưởng ở thực vật
Sự nảy mầm của hạt
Sự phát triển cây con
Sự tăng trưởng của rễ và thân
Sự biệt hóa của các tế bào.
Sự nảy mầm của hạt
Cơ thể thực vật có phôi phát triển kể từ khi hạt nảy mầm gồm rễ phát triển xuống đất và chồi gồm thân mang lá phát triển trong khí quyển
Sự nảy mầm của hạt
Sự phát triển của cây con
Ðầu tiên cây con tăng trưởng hơi chậm, nhưng sau đó tăng trưởng với một tốc độ nhanh hơn trong một thời gian dài hơn và cuối cùng chậm lại và có thể dừng tăng trưởng khi cây sắp trưởng thành
Sự tăng trưởng của thân và rễ
Sự tăng trưởng của rễ và thân của cây con có được là nhờ sự phân cắt và sự tăng dài của tế bào của hai mô phân sinh ngọn rễ và ngọn thân.
vùng mô phân sinh ngọn rễ, và thân gồm những tế bào nhỏ có khả năng phân chia tích cực
Khi các tế bào được mới được đẩy ra khỏi vùng mô phân sinh ngọn, do số lượng tế bào tăng lên sự phân cắt chậm lại thì sự gia tăng kích thước tế bào loàm cho rễ và thân dài và to lên
Sự tăng trưởng của rễ và thân
Sự biệt hóa của các tế bào
Tất cả những tế bào mới được sinh ra từ mô phân sinh thì cơ bản giống nhau, chúng sẽ trở thành các loại mô khác nhau. Quá trình tế bào thay đổi từ những hình dạng chưa trưởng thành đến trưởng thành gọi là sự chuyên hóa (differentiation).
Các kiểu sinh sản ở thực vật
Thực vật có thể tạo thêm nhiều cá thể mới bằng hai kiểu sinh sản:
- Sinh sản vô tính
- Sinh sản hữu tính
Sinh sản vô tính
Kiểu sinh sản không qua thụ tinh.
Sự tách rời một phần cơ thể mẹ và sự phát triển cá thể mới từ phần đó.
Cơ quan thực vật dùng để sinh sản vô tính là chồi nách, thân, rễ, củ, giò, thân bò…
Không qua thụ tinh và tái tổ hợp gen nên không làm thay đổi nội dung di truyền.
Các hình thức sinh sản vô tính
Sinh sản bằng bào tử:Cơ thể mới được phát triển từ bào tử, bào tử lại hình thành trong túi bào tử từ thể bào tử (rêu, dương xỉ)
Sinh sản sinh dưỡng: giâm, chiết , ghép
Nuôi cây mô tế bào thực vật
Sinh sản hữu tính
Sự tham gia của các yếu tố quy định giới tính: kết hợp hai giao tử đực và cái trong quá trình thụ tinh hình thành hợp tử.
- Ở TV bậc cao (TV có hoa): thụ phấn và thụ tinh
PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ
1. Phòng rửa dụng cụ
2.Phòng chuẩn bị môi trường, hấp tiệt trùng, chứa dụng cụ
3.Phòng cấy vô trùng
4.Phòng nuôi mẫu cấy.
5. Phòng quan sát và thu nhận số liệu
Sơ đồ bố trí các phòng
Phòng rửa dụng cụ
Phải có: bồn rửa, có đường thoát riêng cho axit.
Thiết bị: máy cất nước 1 lần, 2 lần
tủ đựng dụng cụ thuỷ tinh chưa sử dụng
Có kệ để các dụng cụ
2.Phòng sấy hấp
3. Phòng chuẩn bị môi trường
pH meter
Máy khuấy từ
Cân phân tích 10-4 g
Cân kỹ thuật 100-2g
Máy rót môi trường
Bếp điện
Microwave
Tủ lạnh 100-200 l
Tủ lạnh sâu (-20 đến -800C)
4. PHÒNG CẤY VÔ TRÙNG
Laminar (tủ cấy vô trùng)
Quạt thông gió
Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường
Thiết bị lọc không khí
Giá và bàn để môi trường
Bộ dụng cụ cấy, đèn cồn
Một số dụng cụ
5.Phòng nuôi mẫu cấy
Tất cả các mẫu cấy đều được nuôi trong điều kiện nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, độ dài chiếu sáng, độ thông khí thích hợp.
Phòng nuôi có nhiệt độ 15 – 300 tuỳ theo mẫu cấy và mục đích của thí nghiệm.
Ánh sáng: ánh sáng huỳnh quang và có thể điều chỉnh được cường độ và thời gian chiếu sáng.
Các thiết bị trong phòng này
Gồm có các giá có tầng để bình hoặc ống nghiệm nuôi cấy. Các giá có lắp đèn để chiếu sáng. có độ chiếu sáng ở chỗ để bình nuôi cấy từ 2000-3000 lux.
Trong phòng cần có máy móc để kiểm tra chính xác nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, máy điều hoà nhiệt độ.
Phòng nuôi cây
Cải biến hệ thống phát sáng (đèn Compact 3U)
6. Phòng sinh hóa
- Phòng này dùng để tiến hành các phân tích sinh hoá, phân tử và di truyền.
- Phòng này cần các thiết bị: tủ hút, ccân các loại, tủ ấm, máy cắt tiêu bản, máy đo pH, máy điện di, máy PCR, máy sắc ký…
Phòng thí nghiệm
Một số kiểu bình nuôi cấy
Bình serum (đựng dung dịch khoáng trong các bệnh viện)
Các loại hộp nhựa
Cây hoa Lily nuôi cấy trong hộp nhựa (sản xuất tại Mỹ, giá 5 USD)
Cây hoa Lily nuôi cấy trong hộp nhựa (sản xuất tại Viêt Nam, 700 - 1000 đồng)
Túi nhựa (nylon, có bán rộng rãi trên thị trường, giá 30 – 50 đồng/túi)
Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật:
Đảm bảo điều kiện vô trùng.
Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách
Chọn mô cấy và xử lí mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.
1.Đảm bảo điều kiện vô trùng
1.1.Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật
1.2.Khử trùng
Ý nghĩa của việc vô trùng
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin..rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm,khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi.
Có 3 nguồn nhiễm tạp chính:
Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối.
Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử vi khuẩn.
Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên môi trường.
2.Khử trùng
2.1.Khử trùng phòng cấy và tủ cấy
- Bằng hơi formol
- Bằng đèn cực tím
Bằng cồn: lau tất cả bề mặt của tủ cấy trước khi làm việc
Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều vô trùng trước: tủ quần áo choàng, mũ vải, khẩu trang, dao kéo..Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng khi cấy và một cốc đựng cồn 95% để nhúng dụng cụ làm việc
2.2.Khử trùng bình cấy và các dụng cụ khác
Dụng cụ: thủy tinh, kim loại
- Bằng không khí nóng (tủ sấy): 130- 1700 trong 2 – 4 giờ
- Bằng autoclave (hơi nước dưới áp suất thấp):10-15 phút ở 1210C:Nút gòn, vải, các dụng cụ thủy tinh, bình nuôi cấy bằng plastic, nút cao su, pipet, nước, môi trường khoáng… đều có thể khử trùng bằng nồi hấp
b.Khử trùng môi trường khoáng: phương pháp hấp tiệt trùng và lọc bằng màng lọc vô trùng
Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở 1210C (Burgerr, 1988)
Khử trùng mẫu cấy thực vật
Khử trùng mẫu cấy là việc làm khó vì mẫu sống không thể khử bằng nhiệt độ cao mà phải giữ được bản chất sinh học của nó. Do đó mẫu cấy thực vật phải được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng.
Các mẫu cấy khi chọn lựa phải được rửa trước bằng xà phòng dưới dòng nước chảy rồi mới cho vào ngâm trong dung dịch khử trùng
Khi xử lí xong mô cấy được rửa nhiều lần trong nước cất vô trùng (3-5 lần).
Các mô thực vật thường được sử dụng để nuôi cấy là:
Đỉnh sinh trưởng thân, rễ
Chồi bên
Vảy củ
Chồi ngọn
Nhu mô lá, nhu mô vỏ thân
Chồi nảy từ củ
Bao phấn, hạt phấn
Hạt
Các dung dịch khử trùng
Chú ý
Việc xử lí thành công nguồn gây nhiễm phần lớn phụ thuộc vào kỹ thuật xử lí trong nuôi cấy vô trùng. Các nguồn gây nhiễm là bụi tóc, tay, quần áo vì vậy trong khi cấy phải rửa tay,lau bằng cồn 70 tới khủy tay, tay áo phải xoắn cao lên, kẹp tóc gọn.. Không nói chuyện hoặc nhảy mũi trong khi đang cấy. Khi cấy không nên chạm tay vào mặt trong của bình cấy cũng như các dụng cụ cấy. Không đưa vào tủ cấy các bình cấy đã bị nhiễm vì bào tử có thể phát tán trong tủ cấy
2. Môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường
Cách chọn môi trường
Cách pha chế môi trường
Thành phần hóa học của môi trường nuôi cấy mô tế bào TV
Các muối khoáng: đa lượng, vi lượng
Nguồn các bon: các loại đường
Các vitamin
Các chất điều hoà sinh trưởng
Các hợp chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây
Các aminoaxit
Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: Thạch (agar)
Than hoạt tính
2.1.Các chất khoáng
Mg là một phần của phân tử diệp lục,
Ca là thành phần của màng tế bào,
N là thành phần quan trọng của amino axít, vitamin, protein và các axít nucleic.
Fe, Zn và Mo cũng là thành phần của một số enzym.
Vì vậy, muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Các chất khoáng
Muối khoáng là các vật liệu (nguồn N, S, P....) cho sự tổng hợp các chất hữu cơ. Nitơ, lưu huỳnh, phốt-pho là các thành phần không thể thiếu của các phân tử protein, các axít nucleic và nhiều chất hữu cơ khác.
Đóng vai trò như một thành phần không thể thiếu của nhiều enzym (là các co-factor): Magie, kẽm, sắt... và nhiều nguyên tố vi lượng là những phần quan trọng của các enzym.
Các ion của các muối hoà tan đóng vai trò quan trọng ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường và tế bào. K+ và Ca2+ rất quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc của tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt hoá nhiều enzym.
Các muối khoáng đa lượng
Các muối của các nguyên tố như N, P, K, S,
Nitơ (N): nitơ vô cơ dưới dạng nitrat (NO3-) hoặc amonium (NH4+) Amonium được cung cấp dưới dạng (NH4)2SO4 hoặc NH4NO3
Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc NH4NO3
Amonium chủ yếu được dự trữ ở rễ như nguồn nitơ hữu cơ. Nitrat có thể được vận chuyển theo mạch xylem đến các bộ phận của cây, tại đó nó sẽ tham gia vào quá trình đồng hoá nitơ. Nitrat có thể được dự trữ ở không bào và thực hiện chức năng quan trọng trong việc điều chỉnh sự thẩm thấu và cân bằng ion của cây trồng
Phospho (P):
Tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nuclêic và tham gia cấu trúc của màng.
Axit nucleic : P là một nguyên tố thiết yếu trong cấu tạo của DNA và RNA để nối các đơn phân tử axít ribonucleic để tạo thành đại phân tử.
Phospholipid: Phospholipid của màng sinh học cũng có chứa một lượng lớn P.
Quá trình chuyển hoá năng lượng: Phospho ở dạng liên kết cao năng giữa hai nguyên tử P như trong phân tử ATP (P-P = 30 kJ)
Các enzym: P vô cơ trong thành phần của các enzym cũng có khả năng điều chỉnh tốt trong nhiều quá trình trao đổi chất của thực vật: chín của quả, tổng hợp tinh bột của lục lạp.
Photpho được cung cấp dưới dạng mono hay dihydrogenphosphate potasium hay sodium: NaH2PO4, KaHPO4
Phospho (P):
Sự thiếu P làm cây chậm lớn, lá cây có màu xanh thẫm do trong thời gian bị thiếu P, sự phát triển của lá chậm hơn sự tổng hợp diệp lục tố nên làm tăng nồng độ diệp lục tố trong lá cây
Kali (K):
K+ là một cation chủ yếu trong cây, giúp cho cây cân bằng các anion vô cơ và hữu cơ. Ion K+ được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có vai trò chính là điều hòa pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào. Sự thiếu hụt K+ trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thiếu nước.
K+ được cung cấp dưới dạng muối KNO3, KCl. 6H2O, KH2PO4
Vai trò của K+ đối với các enzym: K+ cần thiết cho hoạt động của nhiều enzym. Sự liên kết của K+ với enzym gây ra sự thay đổi cấu hình không gian của enzym, do đó làm tăng ái lực của enzym với cơ chất. Khi thiếu K+ người ta thấy có sự tăng nồng độ đường hoà tan và các hợp chất chứa nitơ, kèm theo sự giảm nồng độ tinh bột
Sự giãn của tế bào: điều chỉnh tính thấm tăng tính thấm
Sự cân bằng ion: K+ có vai trò quan trọng cho việc duy trì cân bằng ion
Lá bình thường, thiếu P, K, N
Lưu huỳnh (S):
các hợp chất có chứa lưu huỳnh như amino axít, protein và enzym
Canxi (Ca):
Trong nuôi cấy tế bào, Ca2+ có vai trò trong sự phát sinh hình thái đồng thời với sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng đặc biệt là auxin và cytokinin
Ca2+ là thành phần quan trọng của thành tế bào và màng tế bào. Pectin là thành phần quan trọng của màng liên kết giữa các bế bào với nhau và được phân huỷ nhờ enzym polygalacturonase. Tuy nhiên, Ca ức chế mạnh hoạt động của polygalacturonaza. Hoạt động mạnh của enzym này được ghi nhận khi thiếu Ca. Nếu nồng độ Ca có đủ thì hầu hết các pectin sẽ tồn tại dưới dạng muối canxipectat. Nhờ vậy, thành tế bào có khả năng chống chịu tốt đối với hoạt động phá huỷ của enzym polygalacturonaza
Canxi (Ca):
Ion Ca2+ có tác động lớn đến sự ổn định của màng tế bào.
Sự thiếu ion Ca2+ sẽ làm tăng khả năng thoát ra ngoài màng tế bào của các hợp chất phân tử lượng nhỏ. Màng tế bào có thể sẽ bị phân huỷ hoàn toàn khi thiếu hụt nghiêm trọng ion Ca2+
Magiê (Mg):
Magnesium là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tổng hợp diệp lục tố và đồng thời nó cũng tham gia vào cấu trúc của một số enzim vận chuyển photphate
Vai trò Mg2+ của đối với quang hợp: Mg2+ là nguyên tử trung tâm trong phân tử chlorophyl của hệ quang hợp I và II. Trong phân tử chlorophyl, các photon được hấp thụ tạo ra dòng điện tử, từ đó tạo ra ATP và NADPH đóng vai trò quan trọng đối với cố định CO2
Vai trò Mg2+ đối với hoạt tính của các enzym: Mg2+ là ion cần thiết cho cấu trúc bậc ba của nhiều phức enzym-cơ chất Mg2+ tham gia vào quá trình tổng hợp protein với nhiều cấp độ khác nhau. Mg2+ tạo thành cầu nối giữa các dưới đơn vị của ribosome. Khi thiếu Mg2+, các dưới đơn vị sẽ bị tách ra và quá trình tổng hợp protein bị ngừng lại
Magiê (Mg):
Sự hoạt động của các enzym như: RNA polymeraza tham gia vào quá trình sinh tổng hợp RNA đòi hỏi phải có mặt Mg2+, do đó thiếu Mg2+ sẽ kìm hãm sinh tổng hợp RNA
Vai trò Mg2+ đối với chuyển hoá năng lượng: đối với sinh tổng hợp ATP (ADP + P vô cơ = ATP) Mg2+ tạo thành cầu nối giữa enzym và ADP, Mg2+ còn có khả năng tạo phức với ATP
MgSO4 là nguồn bổ sung ion Mg+ duy nhất cho mô cấy.
Các nguyên tố vi lượng (Fe, B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Zn...)
a. Sắt (Fe):Trong cây, sắt chủ yếu được gắn với các phức chất (sắt-cacbonhydrate): Các hemoprotein (các protein chứa sắt):
1.cytochrome: Các cytocrome tạo thành một phần hệ thống oxi hoá trong chuỗi truyền điện tử ở lục lạp và ty thể của tế bào thực vật.
2.Các protein sắt-lưu. Ferridoxin là protein chứa sắt lưu huỳnh phổ biến nhất và là chất mang trong các phản ứng truyền điện tử được xúc tác bởi nitrit reductaza, sulphat reductaza, quá trình tổng hợp NADP+ trong quang hợp và khử nitơ được thực hiện nhờ phức hệ nitrogenaza
a. Sắt (Fe):
Sắt rất quan trọng trong sinh tổng hợp chlorophyl: Trong lá xanh 80% sắt nằm trong lục lạp. Khi thiếu sắt, toàn bộ sắt sẽ tập trung ở lá.
Trong lá non, thiếu sắt sẽ dẫn đến sự giảm nhanh nồng độ chlorophyl do quá trình tổng hợp protein bị ngưng lại. Số lượng ribosom cũng giảm mạnh.
Thiếu sắt ở rễ kéo theo những thay đổi hình thái. Sự dài rễ giảm nhưng diện tích và số lượng lông rễ tăng.
B cần thiết cho sự hoạt động của đỉnh sinh trưởng bởi vì nó có mặt trong sự sinh tổng hợp các base nitơ đặc biệt là uracil, cũng như cần thiết cho sự sinh tổng hợp lignin và acid phenolic.
Thiếu B sẽ làm giảm sự sinh tổng hợp cytokinin. Sự phân chia tế bào bị kìm hãm do có sự giảm sinh tổng hợp ARN trong nhân.
b. Bo (B):
Đồng (Cu):
Đồng hiện diện trong hệ thống enzim cytochrome oxidase của chuổi vận chuyển điện tử hô hấp. Trong thực vật, đồng tồn tại dưới dạng ion hóa trị 1 và 2. Nồng độ đồng cao sẽ gây độc cho mô.
Các ion đồng được bổ sung vào dưới dạng sulfate đồng, đôi khi người ta cũng có thể bổ sung đồng dưới dạng CuCl 2 hoặc CuNO3.
Trong tế bào, đồng chủ yếu là thành phần của phức hệ enzym và rất quan trọng trong các phản ứng oxi hoá khử [(Cu2+)/(Cu+)] được thực hiện nhờ những enzym này. Thiếu đồng lập tức dẫn đến sự giảm hoạt độ của các enzym chứa đồng.
Đồng (Cu):
Vai trò của đồng đối với quang hợp: Khoảng 50% đồng trong lục lạp được gắn với plastocyanin, ở giữa chuỗi truyền điện tử, giữa quang hệ I và quang hệ II, có chứa 1 nguyên tử đồng trên 1 phân tử Trong trường hợp thiếu đồng, nồng độ các plastocyanin sẽ bị giảm. Cũng giống như plastocyanin, các plastoquinone đóng vai trò quan trọng trong truyền điện tử giữa quang hệ I và quang hệ II. Do đó, hiện tượng thiếu đồng nhanh chóng kéo theo hiện tượng giảm quang hợp.
Kẽm (Zn):
Thiếu kẽm thì sự sinh tổng hợp protein, acid nuclêic và diệp lục tố sẽ bị giảm đi. Thực vật có đốt thân ngắn, lá nhỏ, đồng thời tế bào trần cũng kém phát triển.
Tổng hợp IAA: kẽm là một thành phần trong enzim có liên quan đến sự tổng hợp tiền chất của IAA là trytophan Thiếu kẽm cũng phá hỏng quá trình tổng hợp indol acetic acid trong cây (Indol ---> Trytophan ---> Indol Acetic Acid)
Nồng độ của kẽm bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy thay đổi từ 0,1-70 mm, như vậy sự dư kẽm trong môi trường nuôi cấy ít gây độc cho mô.
Kẽm được hệ rễ hấp thu dưới dạng Zn2+
Kẽm (Zn):
Tổng hợp protein: Kẽm rất quan trọng trong quá trình tổng hợp protein. Thiếu kẽm gây ảnh hưởng lớn đến quá trình tổng hợp protein. Sự tập trung ribosom và sự tích luỹ các tiền chất của protein như các amino axít và các amin, có thể xẩy ra nhờ kẽm. Zn cần cho hoạt động của RNA polymeraza.
Dưới điều kiện thông thường, RNA polymeraza chứa 2 nguyên tử Zn, tạo ra cấu trúc điển hình của enzym. Hơn nữa, có 1 mối quan hệ nghịch tương ứng giữa nồng độ Zn và hoạt động của RNAse . Nồng độ Zn thấp sẽ làm tăng hoạt động của RNAse
2.2.Nguồn carbon (C)
Trong nuôi cấy invitro, nguồn các bon giúp cho mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối.
Đường sucrose (saccharoza) là nguồn cacbon chủ yếu và được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các môi trường nuôi cấy
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, Các mô và tế bào thực vật trong môi trường nuôi cấy ít có khả năng tự dưỡng và vì thế cần thiết phải bổ sung nguồn carbon bên ngoài để cung cấp năng lượng Vì vậy, việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc
Nồng độ sử dụng tuỳ theo mục đích nuôi cấy : 2- 5% (w/v) %, song cũng còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi có khi giảm xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào) và tăng lên đến 12% (cảm ứng stress nước).
Nguồn cácbon
glucose cũng thường được đưa vào môi trường nuôi cấy và cho hiệu quả tương đương sucrose
Các carbohydrate khác, như: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose, melibiose và trehalose cũng đã được thí nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả
3. Các vitamin
Các vitamin là rất cần thiết cho các phản ứng sinh hoá.
Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có sức sinh trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin Thông thường Thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng.
Các vitamin thường được sử dụng trong nuôi cấy:
Thiamin (B1), Axit nicotinic (PP), pyridoxin HCl (B6) và myo-inositol, axit ascobic (vitamin C), vitamin E.
Nồng độ sử dụng các vitamin này: 1 – 10 mg/l.
Các vitamin khác như biotin, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid, vitamin E (tocopherol), riboflavin và p-aminobenzoic acid cũng được sử dụng
5. Một số chất hữu cơ
Nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, cam, cà chua.
Nước dừa được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay: nước dừa được chứng minh là một myo-inositol và một số axitamin khác. Lượng nước dừa thường dùng là 15 – 29% thể tích môi trường.
Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng
Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác
Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào. Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng trong môi trường nuôi cấy tế bào và nuôi cấy tế bào trần
Các nguồn nitrogen hữu cơ thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate (0,05-0,1%) , L-glutamine (8 mmol/L), L-asparagine, L- glicine ((2 mmol/L), và adenine
6. Than hoạt tính
Có tác dụng khử độc, than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenolđộc do mô tiết ra trong thời gian nuôi cấy.
Than hoạt tính nói chung ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng hoặc làm đen môi trường. Người ta cho rằng tác dụng cản sự tăng trưởng của mô cấy khi có sự hiện diện của than hoạt tính trong môi trường là do nó hút chất điều hòa sinh trưởng có trong môi trường
Thường được bổ sung với nồng độ 0,5 – 3%.
6. Yếu tố làm đặc môi trường (Agar)
Agar là một loại polysaccharide thu được từ một số loài tảo (ngành tảo đỏ-Rhodophyta)
Aga thường được sử dụng để làm đặc môi trường trong nuôi cấy mô.
Đặc tính của agar là không bị thuỷ phân bởi enzym thực vật, không phản ứng với các chất trong môi trường nuôi cấy.
Nồng độ sử dụng: 0,5 – 10%
4. Các chất ĐHST
Chất ĐHST
- Abscisic acid
- Indole-3-acetic acid
- Naphthaleneacetic acid
- 2,4-Dichlorophenoxy
acetic axit
- 6-Fururylaminopurine
- Amino purine
- Gibberellic acid
Viết tắt
ABA
IAA
NAA
2,4D
IBA
Kinetin
Zeatin
GA3
CÁC CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƯỞNG THỰC VẬT
Là các chất hữu cơ có bản chất hoá học khác nhau, được tổng hợp với một lượng nhỏ ở các cơ quan, bộ phận nhất định của cây và từ đấy được vận chuyển đến tất cả các cơ quan, bộ phận khác để điều tiết các hoạt động sinh lý, các quá trình sinh trưởng, phát triển của cây và để đảm bảo mối quan hệ hài hoà giữa các cơ quan, bộ phận trong cơ thể.
CÁC CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƯỞNG THỰC VẬT
Là những chất có bản chất hóa học khác nhau nhưng đều có tác dụng điều tiết quá trình sinht rưởng phát triển của cây.
Phytohoocmon là các chất hữu cơ được tổng hợp với một lượng nhỏ ở các cơ quan, bộ phận khác nhau để điều tiêt các hoạt động sinh lí, quá trình sinh trưởng, phát triển.
Nhóm Auxin
Nhóm cytokinin
Nhóm Gibberelin
Acid absicic. Etylen…
AUXIN
Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indol axetic axit (IAA)
Các Auxin nhân tạo: NAA (napthyl axetic acid), 2,4-D (diclophenoxy axetic acid)
Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng),
* Một số tài liệu cũ có thể bị lỗi font khi hiển thị do dùng bộ mã không phải Unikey ...
Người chia sẻ: Phan Thị Huyền Trân
Dung lượng: |
Lượt tài: 1
Loại file:
Nguồn : Chưa rõ
(Tài liệu chưa được thẩm định)