Công nghệ sinh học dại cương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP
KHOA: LÂM HỌC
Tiểu luận: Công nghệ nuôi cấy bao phấn và hạt phấn In vitro
Giáo viên hướng dẫn: Th.s Nguyễn Thị Hồng Gấm
Nhóm sinh viên thực hiện: Nhóm 1
Hà Nội, tháng 10 - 2008
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay công nghệ sinh học là một ngành khoa học mũi nhọn được cả thế giới quan tâm.
Tốc độ phát triển nhanh chóng của Công nghệ Sinh học không kém gì sự bùng nổ thông tin và tạo ra một cuộc cách mạng Sinh học trong nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, y dược, và đặc biệt là trong nông nghiệp trồng trọt. Nhờ ứng dụng các biện pháp của nó chủ yếu là kĩ thuật nuôi cấy mô, dung hợp TB trần, Kĩ thuật chuyển gen, ngành công nghệ tạo giống đã tạo ra những tiến bộ vượt bậc, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn là một trong các hướng tạo nên tiến bộ vượt bậc ấy.
NỘI DUNG
1. Hiện tượng sinh sản hữu tính ở thực vật.
2. Khó khăn của việc tạo dòng thuần trong tự nhiên.
3. Quy trình và những điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn và hạt phấn.
4. Ưu điểm, nhược điểm.
5. Thành tựu và hiện trạng.

1. Hiện tượng sinh sản hữu tính ở thực vật
Nhị hoa
Nhuỵ hoa
Nhuỵ hoa
Nhị hoa
1.1. Cấu tạo của hoa
Bao phấn
Hạt phấn
Chỉ nhị
Bao phấn phóng to
1.2. Quá trình hình thành hạt phấn và túi phôi :
a. Quá trình hình thành hạt phấn :
Từ tế bào 2n trong bao phấn của Nhị hoa
4 tiểu bào tử đơn bội (n)
Giảm phân
Mỗi tiểu bào tử đơn bội (n)
Nguyên phân
Hạt phấn có 2 tế bào:1 tế bào sinh sản và 1 tế bào ống phấn
b. Quá trình hình thành túi phôi:
Noãn
4 Đại bào tử đơn bội (n)
Từ tế bào 2n của Noãn trong bầu nhuỵ
Giảm phân
Nguyên phân 3 lần
Túi phôi có nhiều nhân,trong đó có 1 tế bào trứng và 1 tế bào nhân tâm (2n) tham gia vào quá trình thụ tinh
1 Đại bào tử đơn bội (n) sống sót
Tế bào trứng
Tế bào nhân tâm (2n)
Bầu nhuỵ
1.3. Quá trình thụ phấn và thụ tinh:
a. Thụ phấn:
Tự thụ phấn và thụ phấn chéo
Có 2 hình thức:
b. Thụ tinh:
Thụ tinh là sự hợp nhất của nhân giao tử đực với nhân của tế bào trứng trong túi phôi hình thành hợp tử
Thụ tinh kép: Là hiện tượng cả 2 nhân tham gia thụ tinh, nhân thứ nhất hợp nhất với trứng tạo thành hợp tử. Nhân thứ hai hợp nhất với nhân lưỡng bội (2n) tạo thành tế bào tam bội (3n).
Hợp tử(2n)
Nhân nội nhũ (3n)
1.4. Quá trình hình thành hạt, quả:
a. Hình thành hạt:
Noãn đã thụ tinh phát triển thành hạt. Hạt chứa hợp tử phát triển thành phôi và tế bào tam bội hình thành nên nội nhũ.
Có 2 loại hạt: Hạt có nội nhũ và hạt không có nội nhũ
b. Hình thành quả:
Quả do bầu nhuỵ phát triển thành, chứa hạt, bảo vệ hạt và giúp phát tán hạt.
2. Khó khăn của việc tạo dòng thuần trong tự nhiên và hướng khắc phục.
Trong chọn giống thực vật để tạo ra dòng thuần chủng người ta tiến hành tự thụ phấn bắt buộc qua nhiều thế hệ, việc này tốn rất nhiều thời gian.





Vì vậy vấn đề đặt ra là làm thế nào trong một thời gian ngắn, chúng ta có thể tạo ra được dòng thuần chủng. Năm 1934, Stow đã phát hiện ra sự phát triển khác thường của hạt phấn thành những cấu trúc giống túi phôi đã xảy ra ở một số loài thực vật ở Hyacinthus. Hiện tượng này đã cho thấy các hạt phấn có khả năng phân chia để hình thành các tế bào mới hoặc các mô khi được sinh trưởng trong các điều kiện thích hợp và chúng tiếp tục phát triển thành cây đơn bội

Tự thụ phấn qua nhiều thế hệ
Ưu thế của việc tạo dòng thuần chủng từ nuôi cấy bao phấn, hạt phấn.
Tính đồng hợp tử có được chỉ sau một đời nuôi cấy trong khi đó chọn dòng thuần thông thường phải mất 5 - 6 đời tự thụ phấn.
Cây lưỡng bội hoá tính đồng hợp tử tuyệt đối, trong khi tự thụ phấn thông thường qua nhiều đời mà vẫn còn tồn dư dị hợp tử.
Sự đa dạng di truyền ở quần thể cây lưỡng bội hoá từ nuôi cấy bao phấn hạt phấn lớn hơn quần thể tự thụ phấn tạo dòng thuần sau các đời tự thụ.
Những gen lặn có thể bị che khuất ở các cây nhị bội dị hợp tử nhưng ở cây đơn bội hoặc lưỡng bội hóa từ hạt phấn lại có cơ hội biểu hiện ngay ra thành kiểu hình.
Cây đơn bội có thể dùng trong chọn lọc hồi quy để tạo giống chống bệnh.
Cấy truyền liên tục các dòng callus từ nuôi cấy bao phấn có thể tạo ra biến dị giao tử là nguyên liệu cho chọn giống.
3. Quy trình và những điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn và hạt phấn.
Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tạo cây đơn bội là nhờ sự cảm ứng phát sinh phôi từ những lần phân chia lặp lại của các bào tử đơn bội, các tiểu bào tử, các hạt phấn non. Giai đoạn phát triển đặc thù của bao phấn tại thời điểm nuôi cấy là nhân tố quan trọng nhất đối với sự thành công của phát sinh phôi.
Thực vật hạt kín, mỗi chồi hoa có thể chứa các bao phấn ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Vì vậy, mỗi chồi hoa phải được kiểm tra để xác định tất cả các giai đoạn phát triển giúp lựa chọn những bao phấn có độ tuổi phù hợp cho nuôi cấy.
3.1 Đặc điểm của nuôi cấy bao phấn và hạt phấn.
3.2. Các phương pháp cơ bản sử dụng trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn.
Có 2 phương pháp cơ bản được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là:
Phương pháp1: Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc môi trường lỏng và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn.
Phương pháp 2: Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn hoặc bằng phương pháp cơ học, hoặc do nứt nẻ tự nhiên của bao phấn và được nuôi trên môi trường lỏng.

3.3 Quy trình nuôi cấy
Chọn bao phấn: Bao phấn thích hợp nhất có chứa hạt phấn bắt đầu từ thể 4 nhân đến ngay sau lần nguyên phân thứ nhất. Bao phấn của các hoa đầu tiên cho kết quả tốt hơn bao phấn của hoa muộn.
Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để nuôi cấy, nhằm kích thích sự phân chia của hạt phấn và từ đó tạo cây đơn bội.
Chọn môi trường tái sinh cây thích hợp: Tùy theo đối tượng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn mà chúng ta lựa chọn môi trường thích hợp tương ứng.
Chọn lọc cây đơn bội: có nhiều cách để xác định cây đơn bội như: làm tiêu bản để đếm số lượng nhiễm sắc thể, đo hàm lượng DNA trong tế bào, so sánh cây tái sinh từ bao phấn với cây mẹ về khả năng sinh trưởng, hình thái, kích thước.

Sơ đồ tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn:
Tách các bao phấn
Khử trùng bề mặt
Nhuộm acetoarmine để xác định
GĐPT của hạt phấn
Nuôi cấy trên
mt đặc
Nuôi cấy trên
mt lỏng
Phát triển phôi
Loại bỏ chỉ nhị
Cây đơn bội
Hoa
3.4 Nhị bội hóa cây đơn bội
Để cây đơn bội trở nên hữu thụ phải tiến hành nhị bội hóa số lượng NST của cây đơn bội bằng các cách sau:
Tái sinh qua phương pháp nuôi cấy mô: Những thể lưỡng bội được hình thành từ sự nhân đôi xảy ra thường xuyên trong quá trình nuôi cấy mô thực vật đơn bội. Thường sử dụng mô lá của cây đơn bội nuôi cấy.
Cảm ứng nhị bội hóa với cochicin: Cochicin được sử dụng ở nồng độ 0.05 – 0.5% tùy theo từng loài thực vật và loại mô cần được xử lý.
3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo cây đơn bội trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn in vitro
Cây đơn bội chỉ thu được khi cấy bao phấn chứa hạt phấn ở giai đoạn phát triển thích hợp, bắt đầu từ thể 4 nhân cho đến ngay sau lần nguyên phân đầu tiên.
a. Tuổi hạt phấn.
b. Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn và hạt phấn
Kết quả tạo cây đơn bội phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của cây bố, mẹ cho bao phấn, hạt phấn. Trạng thái sinh lý lại liên quan đến điều kiện môi trường mà cây sinh trưởng như: quang chu kỳ, cường độ ánh sáng, nhiệt độ và môi trường dinh dưỡng khoáng.
Khả năng thành công cao nhất với những bao phấn thu được trong lần trổ hoa đầu tiên và giảm dần trong những lần trổ hoa tiếp theo.
Sử dụng bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh sáng cao, ngày ngắn sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao hơn.

c.Tiền xử lý bao phấn và hạt phấn
Hiệu quả nuôi cấy bao phấn, hạt phấn cao hơn khi tiến hành xử lý mẫu trước khi cấy.
Xử lý Nhiệt độ lạnh đã làm tăng khả năng tạo mô sẹo và cây từ bao phấn, đồng thời cho phép bảo quản mẫu lâu hơn.
Bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh sáng cao, trong điều kiện ngắn ngày sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao hơn.
d. Mật độ bao phấn, hạt phấn
Phản ứng sinh trưởng trong nuôi cấy đơn bội bị chi phối bởi mật độ bao phấn, hạt phấn nuôi cấy trên môi trường và thay đổi tùy theo loài thực vật.
e. Dinh dưỡng, hoocmon và các nhân tố khác
Môi trường nuôi cấy được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn là: MS-1962, LS-1965, B5-1968, N6-1976.
Các Auxin ngoại sinh (IAA, NAA, IBA, 2,4 D) và cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin ,) cần được đưa vào môi trường để thúc đẩy quá trình phát sinh phôi.
Các nguồn chất hữu cơ không xác định như: dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, cà chua… và các axit amin, glutamin có tác động tích cực với sinh trưởng trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn.
Than hoạt tính có tác dụng kích thích phát sinh phôi vô tính cũng như thúc đẩy sự khởi đầu của phôi từ mô bao phấn đơn bội.
Khi sử dụng môi trường đặc cần lựa chọn thạch có độ tinh khiết cao sẽ cho hiệu quả tạo mô sẹo và cây con cao hơn.
Hàm lượng đường cho vào môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy.
4. Ưu điểm và nhược điểm
Nuôi cấy bao phấn:
Vì bao phấn có kích thước lớn nên thao tác dễ dàng.
Môi trường nuôi cấy đơn giản.
Nuôi cấy hạt phấn:
Tạo ra giống cây trồng sạch bệnh.
Giống tạo ra có phẩm chất di truyền đồng đều.
Phát sinh phôi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy.
Tạo cây đơn bội thuận lợi cho việc nghiên cứu di truyền.
Tóm lại, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ra đời đã làm giảm thời gian, đồng thời làm tăng vọt số lượng các cá thể đơn bội thu được.
a. Ưu điểm
b. Nhược điểm
Nuôi cấy hạt phấn:
Khó thao tác do hạt phấn có kích thước nhỏ.
Các giai đoạn phát triển của hạt phấn không đồng đều nên hiệu suất tạo cây đơn bội không cao.
Hạt phấn là vật liệu quan trọng để gây đột biến và chuyển nạp gen, tuy nhiên nó ít được sử dụng vì làm giảm tỉ lệ tái sinh cây
Nuôi cấy bao phấn:
Khó sàng lọc cây đơn bội.
Khi nuôi cấy bao phấn thường gặp hiện tượng bạch tạng
Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tạo cây đơn bội phức tạp, phụ thuộc nhiều yếu tố: tuổi hạt phấn, trạng thái sinh lý của bao phấn và hạt phấn, kiểu gen, kinh nghiệm…



5. Thành tựu và hiện trạng
Thành tựu:
Các cây đơn bội có nguồn gốc hạt phấn đã được tạo ra ở 216 loài thuộc 78 giống, 31 họ và nhiều loài khác cũng được nghiên cứu thành công (Hu và Zhang, 1985).
Thông qua nuôi bao phấn đã tạo các giống lúa thuần như Khao 85, Khao 1105, VH2. Đặc biệt thông qua chọn dòng tế bào soma thu được các giống DR1, DR2, DR3 đang mở rộng ra qui mô sản xuất. Kết hợp biến dị tế bào soma với gây đột biến đã tạo giống lúa KDM39. Trong nghiên cứu lúa lai đang áp dụng kỹ thuật lai xa, cứu phôi, đột biến tạo dòng TGMS và CMS mới.


Trong lĩnh vực nông nghiệp, các kết quả nghiên cứu về công nghệ tế bào - mô phôi thực vật giúp chúng ta nhanh chóng tạo ra các giống cây trồng thuần. Hàng loạt dòng thuần ở lúa (ĐV2, MT4, DT26...) đã được tạo ra bằng kĩ thuật đơn bội nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn. Đặc biệt, chúng ta đã sản xuất được dòng lúa thuần mang gene quý như gene bất dục đực tế bào chất, bất dục đực nhân (gen TGMS, PGMS). Đối với ngô, đã tạo được 5 dòng ngô thuần và hai tổ hợp ngô lai có triển vọng.
Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào phát triển nhanh và ngày càng hiện đại mở tiềm năng to lớn cho cho nuôi cấy bao phấn hạt phấn tạo cây đơn bội từ đó tạo dòng thuần, đáng chú ý là ở các đối tượng có tầm quan trọng như: lúa gạo, lúa mạch, đại mạch, thuốc lá, ngô, khoai tây….

Hiện trạng
Hiện tại người ta mới nuôi cấy hạt phấn trưởng thành để tạo cây đơn bội thành công qua con đường phôi hoá, hoặc tạo thành mô sẹo, từ đó tạo cây đơn bội. Còn nuôi cấy hạt phấn non chưa đạt được nhiều hiệu quả, hiện tại chỉ có một số kết quả về nuôi cấy hạt phấn non thành công như nuôi cấy hạt phấn non cây Trillium electum (Saparov và cs,1955), cây hành Allium cepa (Vasil,1959), ở cây Atropa belladonna (Bajaj,1974).
Hầu hết các cây ngũ cốc và các cây họ đậu nuôi cấy bao phấn rẩt khó thành công hoặc tỉ lệ thành cây thấp, tỉ lệ cây bạch tạng cao.
Nhiều gen có khả năng thành cây thấp thường không được ứng dụng trong nuôi cấy bao phấn nhưng có khi gen lại có giá trị kinh tế cao. Ví dụ cấy bao phấn giống lúa Japonica dễ thành công hơn hơn giống lúa Indica, tuy nhiên giống Indica lại có vai trò quan trọng hơn nhiều giống Japonica
KẾT LUẬN
Công nghệ sinh học hiện đại là cơ hội cho các nước nghèo, đặc biệt là các nước nghèo có tiềm năng thiên nhiên lớn và có đội ngũ cán bộ khoa học có trình độ và đông đảo như nước ta. Là cơ hội vì nó tạo điều kiện cho ta đi tắt, vượt qua một số giai đoạn phát triển mà các nước đi trước phải trải qua trong nhiều năm, tiết kiệm cho ta nhiều tiền của và năm tháng mày mò.
Đặc biệt khi nói đến bao phấn và hạt phấn, mặc dù hiện tại chưa thực sự được quan tâm nhưng trong tương lai thì chúng thực sự có tiềm năng rất lớn. Vấn đề chỉ còn ở chúng ta, những nhà Công nghệ sinh học tương lai.

NHÓM SINH VIÊN THỰC HIỆN
Nguyễn Văn Chiến
Nguyễn Thị Chính
Sỹ Danh Chung
Chu Sỹ Cường
Kiều Mạnh Cường
Vũ Thu Đoàn
Lê Hoàng Đức
Nguyễn Anh Đức
Lê Hồng Gấm
Dương Thị Thu Hà