Công nghệ sinh học_ ĐaH Tây Nguyên

NUÔI CẤY ĐỘNG VẬT
Sinh viên trình bày: Nguyễn Viết Trụ
Phạm Tấn Vũ
Nguyễn Chí Tín
MỞ ĐẦU
I
Năm 1949, J.F. Enders nuôi mô động vật thành công và đã cho thấy virus gây bại liệt (poliovirus) có thể phát triển trong các tế bào nuôi in vitro.
Đầu thập niên 1950, tế bào động vật có vú được nuôi với số lượng lớn để nuôi nhiều virus bại liệt (poliomyelite virus) dùng chế vaccine chống bệnh bại liệt.
Nuôi tế bào động vật có vú là một trong những lĩnh vực phát triển mạnh của công nghệ sinh học. Nó được ứng dụng chủ yếu vào lĩnh vực như sản xuất vaccine virus; sản xuất các protein, hormon trị liệu, r-protein bằng các tế bào động vật; sản xuất các kháng thể đơn dòng.
MỞ ĐẦU
NỘI DUNG
II
1. Những khó khăn trong nuôi cấy tế bào động vật có vú
Chúng có nhiều kiểu biểu hiện đặc biệt và không phát triển được đến cơ thể trưởng thành. Trong quá trình nuôi thường xuất hiện các loại tế bào với số bội thể khác nhau

Mật độ tế bào nuôi rất thấp

Nồng độ tế bào cao trong nuôi cấy

Sinh sản rất chậm

Rất nhạy cảm với các yếu tố môi trường nuôi cấy
2. Phương pháp xác định các tế bào để nuôi
Khởi đầu một mảnh mô được tách ra trong các điều kiện vô trùng rồi đem xử lí với enzyme protease, thường là trypsin, để cắt mô tách các tế bào rời nhau ra. Sau khi lấy trypsin ra, dịch tế bào được cấy vào bình thủy tinh hay bình nhựa có đáy phẳng rộng chứa môi trường dinh dưỡng lỏng thích hợp cho sự phát triển của tế bào. Các tế bào sau khi trải qua pha lag sẽ bám vào đáy bình chứa và bắt đầu nguyên phân.
Tạo dòng nuôi sơ cấp (primary culture): bắt nguồn trực tiếp từ mô đã được biệt hoá.
Để nhân các dòng tế bào sơ cấp qua xử lí trypsin thuận tiện hơn cả là sử dụng các mô của phôi như: mô cơ – da, thận, phổi,…
Các tế bào dòng nuôi sơ cấp có thể tách khỏi bình bằng xử lí với trypsin hay EDTA (tác nhân kiềm)
Dòng nuôi tế bào có thể nhận được từ bất kì mô nào.
Các loại tế bào thường dùng
Tế bào biểu mô Nguyên bào sợi Tế bào bạch huyết
3. Các dòng tế bào liên tục
(continuous cell lines)


Không phải tất cả các tế bào cơ thể động vật đều cho các dòng sơ cấp mà tất cả các thế hệ thứ cấp của chúng đều chết.

Trong quá trình cấy chuyền, hàng loạt dòng tế bào chịu những biến đổi rất mạnh. Ví dụ, mật độ tế bào khi ngừng phân chia có nhiều xu hướng tạo thành cục hơn là tạo lớp đơn và các tế bào định hướng lẫn nhau không đều.

Các dòng tế bào như vậy được gọi là bị biến đổi (transformed) và nói chung là mô ung thư
Mô tế bào ung thư phổi
4. Môi trường dinh dưỡng và cách pha chế



Môi trường nuôi tự nhiên: như các cục máu đông, dịch huyết tương, nước ối bào thai, dịch chiết phôi,…


Môi trường nuôi tổng hợp: thành phần không thể thiếu là huyết tương của máu, chiếm khoảng 5 – 10%, bổ sung thêm thêm thành phần căn bản là dung dịch sinh lí hay dung dịch muối cân bằng gồm hỗn hợp các muối vô cơ, mà chức năng của nó là duy trì pH, áp suất thẩm thấu và cung cấp chất vô cơ.
4. Môi trường dinh dưỡng và cách pha chế

Các thành phần căn bản của môi trường:
Ngoài các chất trong huyết tương, cần bổ sung các loại amino acid (khoảng 20 loại) và 7 loại vitamin. Môi trường dinh dưỡng phải thỏa mãn các điều kiện:

Có đủ những ion vô cơ căn bản (Na, Ca, K…).
Áp suất thẩm thấu phải chính xác.
pH phải chính xác (thường được giữ ở 7-7,3).
Nguồn năng lượng lấy từ glucose.
Có phenol để dễ theo dõi pH.
4. Môi trường dinh dưỡng và cách pha chế
Thiết bị nuôi: Có thể dùng bình Roux và bình trụ để nuôi ở quy mô nhỏ. Trong sản xuất công nghiệp nuôi bình lớn trên giàn kệ. Sau này người ta cải tiến dùng bi trong bioreactor loại mới bằng túi plastic dùng nuôi tế bào côn trùng.

bioreactor
5. Quy trình khái quát và xử lý thu các loại sản phẩm
Tế bào nuôi

Pha loãng trong môi Lấy môi trường cạn dung dịch ra
Trường và Acid butyric

Lấy môi trường kiệt Thêm môi trường duy trì Tinh sạch, cô đặc
Chất dinh dưỡng ra

Cho vào môi trường Vius sống Kháng thể, hormone
Kích thích tạo
Interferon

Tách tế bào Thử


Tinh chế Interferon Vaccine


6. Các ứng dụng của nuôi tế bào động vật
Quy trình sản xuất vaccine virus:
6. Các ứng dụng của nuôi tế bào động vật

Sản xuất vaccine virus:
Đến nay, một số vaccine chủ yếu đã được sản xuất :

Vaccine chống bệnh bại liệt, viêm gan virus B.
Vaccine chống bệnh quai bi, bênh sởi, bệnh dại.
Vaccine chống 1 loại virus gây bệnh sán lá ở động vật.
Vaccine chống lở mồm, long móng ở gia súc (hơn 1,5 tỉ liều/năm).
6. Các ứng dụng của nuôi tế bào động vật

Sản xuất các protein như interferon, kháng thể và các hormone dùng trị liệu.

Sản xuất các protein trị liệu như các α-,β-interferon, thymosin, iterleukine, plasmanogen activator (t-pA) do tế bào sản xuất ra có hoạt tính tốt.

Sản xuất các protein tái tổ hợp bằng chuyển gen như tPA, các nhân tố máu VIII và IX, erythropoietine,…
6. Các ứng dụng của nuôi tế bào động vật

Các chế phẩm miễn dịch chủ yếu được sản xuất là các kháng thể đơn dòng: Các kháng thể này dùng cho chuẩn đoán bệnh, thuốc hướng đúng mục tiêu chữa trị (ví dụ, các tế bào ung thư) và dùng trong nghiên cứu.
6. Các ứng dụng của nuôi tế bào động vật
6. Các ứng dụng của nuôi tế bào động vật







Các hormone như hormone tăng trưởng của người, prolactin được sản xuất nuôi tế bào (tương tự trường hợp interferon).

Sản xuất virus diệt côn trùng bằng nuôi tế bào côn trùng và cho nhiễm virus rồi thu chế phẩm.
6. Các ứng dụng của nuôi tế bào động vật
Nuôi sâu

Cấy dịch huyền phù virut vào thức ăn

Thu ấu trùng chết

Sấy khô ở 33-35oC

Nghiền nhỏ

Trộn với dung dịch sinh lý

Lọc

Thu chế phẩm


Quy trình sản xuất thuốc trừ sâu với virut Baculo
7-9 ngày
KẾT LUẬN
III
CNSH động vật có nhiều ứng dụng trực tiếp cho con người. Tế bào động vật có vú khó nuôi nhất do sinh sản chậm, mật độ tế bào thấp và rất nhạy cảm với nhiều yếu tố khác nhau. Việc tách dòng tế bào để nuôi và môi trường nuôi cũng phức tạp. Tuy nhiên, nuôi tế bào động vật có hàng loạt ứng dụng quan trọng như sản xuất các vaccine virus, các protein trị liệu, các chế phẩm miễn dịch, hormon và chế phẩm diệt côn trùng.
Sự ra đời của kháng thể đơn dòng mở ra hướng kết hợp các kĩ thuật tế bào gốc với nuôi tế bào đem lại nhiều ứng dụng to lớn và khó lường. do vậy vấn đề được bàn cãi là có nên cho phép nghiên cứu hay không, nghiêm cấm nhân bản vô tính người là vấn đề dứt khoát.
Cấy gép cơ quan và can thiệp vào sinh sản đã có những ứng dụng trong y dược học và chăn nuôi. Vì thế đẩy mạnh nghiên cứu nuôi cấy tế bào người và động vật là vấn đề mang tính thời sự và cần thiết.


KẾT LUẬN
Thank you!