Công nghệ sinh học

Cán bộ HDKH: TS. Đào Xuân tân
Học viên: Đào thị ngọc anh
K11- Sinh học thực nghiệm
1.1 Cấu trúc phân tử insulin
Insulin là một hoocmon protein do tế bào tuyến tụy sinh ra. Phân tử protein insulin có khối lượng khoảng 6000da. Cấu tạo bởi hai chuỗi polypeptit A và B. Các chuỗi A và B liên kết với nhau bằng hai cầu nói đisulfua. Hầu hết các loài chuỗi A gồm 21aa; chuỗi B có 30aa.
Hình 1: Cấu trúc phân tử insulin
1.2 Vai trò sinh học của insulin
Insulin là một trong những hoocmon điều hoà nồng độ glucoz trong máu.
1.2.1. Insulin và trao đổi hydratcacbon
-Insulin tuần hoàn trong máu, khi gắn với thụ thể trên màng tế bào tạo ra phức hợp thụ thể - insulin làm phát tín hiệu truyền thông tin chuyển glucoz ra khỏi huyết tương.
Hình 2:Insulin gắn với thụ thể trên màng tế bào và tuần hoàn trong máu
- Insulin thúc đẩy gan dự trữ glucoz ở dạng glycogen. Glucoz bị photphoryl hoá nhờ enzym hexokinase nhờ đó glucoz bị bẫy vào trong tế bào.
- Insulin ức chế hoạt động của glucoz - 6 photphatase. Khi không có mặt insulin, quá trình tổng hợp glycogen bị dừng lại và các enzym phân huỷ glycogen hoạt động.
Insulin ngăn cản lượng đường quá cao trong máu nên không được có quá nhiều insulin, do đó enzym insulinase kiểm soát mức độ insulin.
Khi lượng insulin quá cao enzym insulinase sẽ phân huỷ hoocmon này với thời gian 6 phút.
Quá trình này đảm bảo cho hàm lượng insulin được ổn định trong máu và lượng glucoz không bị giảm xuống mức nguy hiểm.
Hình 3: insulin điều hoà glucoz trong máu
1.2.2. Insulin và trao đổi lipit
a- Insulin thúc đẩy sinh tổng hợp các axit béo trong gan.
Khi lượng glycogen trong gan quá cao (> 5% lượng thô của gan) thì quá trình tổng hợp bị ức chế. Lượng glucoz hấp thụ vào tế bào gan chuyển sang tổng hợp axit béo và chuyển khỏi gan ở dạng lipoprotein.
Các lipoprotein đi vào vòng tuần hoàn, cung cấp các axit béo tự do cho các mô khác như mô mỡ để tổng hợp triglyxerit.
b- Insulin ức chế phân huỷ chất béo trong mô mỡ: bằng cách ức chế quá trình thuỷ phân triglyxerit thành glixerol và axit béo tự do.
Enzym nhạy cảm với hoocmon này trở nên hoạt động được khi photphoryl hoá. Insulin làm ngăn cản sự kết hợp với thụ thể trên màng tế bào. Do đó làm tăng sự tích tụ triglyxerit trong tế bào các mô mỡ.
1.2.3. Những tác động khác của insulin

- Insulin làm tăng tính hấp thụ của các axitamin.
- Insulin làm tăng tính thấm các ion kali, magie và photphat vô cơ tạo điều kiện cho quá trình photphoryl hoá và sử dụng glucoz.
Hình 4: Insulin làm tăng tính thấm các ion kali,
magie và photphat vô cơ

1.3. Tổng hợp insulin trong cơ thể
Insulin được tổng hợp trong tế bào β của tuyến tụy. Insulin được tạo ra từ một phần của một protein lớn hơn để đảm bảo sự gấp nếp đúng.
mARN dịch mã protein preproinsulin. Preproinsulin gồm một trình tự đầu aa để tiền chất này đi qua lưới nội chất tham gia vào quá trình sau dịch mã.
Tại quá trình sau dịch mã preproinsulin bị thuỷ phân tạo thành dạng proinsulin. Sau khi hình thành 3 cầu đisulfua một số peptitdaza cắt proinsulin thành insulin hoàn chỉnh và hoạt động.
Insulin được đóng gói và chứa trong các hạt tiết tích tụ trong tế bào chất đến khi được kích hoạt để giải phóng.
Hình 5: Tổng hợp insulin trong cơ thể
Hình 6: Các bước cải biến sau dịch mã của phân tử insulin
Hiện nay công nghệ ADN tái tổ hợp được sử dụng để sản xuất.
2.1. Phương pháp 1
Tạo ra các chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học hoặc tạo một tiền chất chuỗi đơn proinsulin người, sau đó phân cắt để tạo thành insulin hoàn chỉnh.
Bước 1: Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học phân tử tách được gen mã hoá proinsulin người trên nhiễm sắc thể số 11.
Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người. Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen. Do hầu hết các mARN của người đều có đuôi polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với đuôi polyA đó.
Sử dụng sắc kí ái lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho quá trình dịch mã; còn lại loại bỏ ADN và các ARN khác.
Cắt bỏ cầu nối A - T thu được mARN.

Hình 7: Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người


Bước 2: Tách và thiết kế plasmit tái tổ hợp.
- Cắt gen mã hoá proinsulin và plasmit bằng một loại enzym giới hạn. Nối bằng ADN ligase của phageT4.
-Thiết kế các trình tự mã hoá cho các protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin ra ngoài tế bào chất.
+Nếu sử dụng mARN tách được từ trên tiến hành như sau:
- Sao mARN tinh khiết thành cADN nhờ enzym phiên mã ngược và nhờ các dNTP (trong phản ứng RT - PCR)
- Cài đoạn cADN mã hoá insulin hoàn chỉnh vào plasmit đứng sau một promoter mạnh. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli.
Bước 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện. Sau quá trình biến nạp, cần chọn lọc được những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn.
Hình 8: Tách và biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli




Bước 4: Các vi khuẩn chuyển gen sau đó được đưa vào lên men.
Nuôi chúng trong nồi lên men sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục, các chất dinh dưỡng được bổ xung thường xuyên để đảm bảo sự tăng trưởng của vi khuẩn theo hàm số mũ.
Sau 20 phút có hàng triệu vi khuẩn được nhân lên qua nguyên phân. Chỉ sau một thời gian ngắn, sinh khối tăng lên rất nhanh và gen insulin được tổng hợp.
Hình 9: Đưa các vi khuẩn chuyển gen
vào nồi lên men.

Bước 5: Tiền tinh sạch
Sau khi lên men cần tách tế bào và khử trùng nhiệt.
Dùng enzym lizozyme phá vỡ màng tế bào, sau đó dùng hỗn hợp chất tẩy rửa để tách lớp màng lipit.
Bằng phương pháp ly tâm và lọc tách được proinsulin.
Hình 10: Proinsulin được lọc tách

Bước 6: Hoạt hoá.
Do hệ thống E.coli có khả năng biểu hiện gen insulin nhưng không có khả năng hoạt hoá insulin.
Hoạt hoá proinsulin invitro bằng cách xử lý dung dịch đệm, giúp nó đạt cấu trúc bậc 4, sau đó dùng enzym đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin. Khi đó sản phẩm thu được mới có hoạt tính cần thiết.

Hình 11:Hoạt hoá proinsulin thành insulin hoàn chỉnh
Bước 7: Hỗn hợp tinh sạch chỉ còn có insulin.
Bằng phương pháp sắc ký, tách và phương pháp miễn dịch gắn enzym.
Độ tinh sạch của insulin được đánh giá qua mỗi giai đoạn trung gian của quá trình sản xuất nhờ phòng thí nghiệm chuyên hoá. Cuối cùng insulin được tinh thể hoá.

Hình 12: Các tinh thể insulin





2.2. Phương pháp 2
- Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B.
- Xác định trình tự ADN để sản xuất chuỗi A và B. Qua đó tổng hợp và tách hai dòng gen này.
- Mỗi ADN được chèn vào plasmit. Sau đó sản xuất tương tự như sản xuất proinsulin.
- Cuối cùng hai chuỗi A và B được trộn với nhau và hình thành cầu nối đisulfua qua phản ứng tái oxi hoá khử nhờ một chất oxi hoá nhất định.
Ngày nay, nấm men cũng được sử dụng để sản xuất insulin. Có nhiều ưu điểm: tế bào nấm men tạo phân tử insulin người gần như hoàn chỉnh với cấu trúc không gian hoàn hảo.
Điều đó làm giảm tối đa tính phức tạp và giá thành của các giai đoạn tinh sạch.
Hình 13: Sản xuất insulin bằng cách tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B.