Công nghệ protein & emzim

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN
GVHD : ThS. NGUYỄN THỊ THU SANG
SVTH : NGUYỄN XUÂN THIỆN
TRẦN THỊ HOÀNG THY
BÙI THỊ PHƯƠNG THẢO
PHẠM THỊ THANH THẢO
NỘI DUNG TRÌNH BÀY
Các phương pháp xác định acid amin:
1. Phương pháp xác định acid amin đầu N. C
2. Các phản ứng nhận biết các acidamin đặc trưng
3. Phương pháp định lượng acid amin
Các phương pháp định tính Protein
Các phương pháp định lượng Protein


CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ACID AMIN ĐẦU N, C
XÁC ĐỊNH AMINO ACID ĐẦU N
1. Phương pháp Sanger:
Dựa vào phản ứng của nhóm ? - NH2 của amino acid đầu N
với 2,4 dinitroftorbenzol tạo ra dẫn xuất dinitrophenyl (DNP)
của amino acid cần xác định có màu vàng.
2. Phương pháp Dansyl:
Dựa vào phản ứng giữa dansylchloride với nhóm NH2 của
amino acid đầu N tạo ra dansyl-peptide.
3. Phương pháp Edman:
Dựa vào phản ứng của nhóm NH2 của amino acid đầu N với
phenyllisothiocyanate (PITC )
O2N
NO2
F +
Ala
Gly
Asp
Leu
Arg
Thr
O2N
NO2
Ala
Gly
Asp
Leu
Arg
Thr
O2N
NO2
Ala
Gly
Asp
Leu
Arg
Thr
HCl
Sơ đồ phương pháp Sanger









XÁC ĐỊNH ACIDAMIN ĐẦU C
1. Phương pháp hydrazyl hóa:
Dựa vào sự tác động của hydrazine với nhóm carboxyl của
amino acid đầu C. Sau đó tách phức trên bằng phương pháp
sắc ký bản mỏng và xác định tên của amino acid.
2. Phương pháp Oxazodone:
Dựa vào sự tác động của nhóm COOH của amino acid đầu C
với acetate anhydride trong môi trường kiềm tạo ra dẫn xuất
phóng xạ sau đó tiến hành sắc ký để tách và xác định amino acid
đầu C nhờ phương pháp chụp phóng xạ.

CÁC PHẢN ỨNG NHẬN BIẾT CÁC ACID AMIN DẶC TRƯNG
I. PHAÛN ÖÙNG NINHYDRIN:
Nguyên tắc:
Dựa vào phản ứng giũa acid amin của Protein với ninhydrin tạo hợp chất màu xanh
tím và hấp thụ cực đại ở bước sóng 570nm. Dưới tác dụng của ninhydrin ở nhiệt độ
cao,acid amin tạo thành NH3,CO2 và andehit tương ứng có mạch carbon ngắn hơn
acid amin một carbon; ninhydrin chuyển thành aminodixetohydrinden.






Aminodixetohydrinden,NH3 mới tạo thành tiếp tục phản ứng với 1 phân tử
ninhydrin khác tạo thành hợp chất màu xanh tím có công thức như sau:



Aminodixetohidrinden
II. Phản ứng Xantoprotein:
Nguyên tắc:
Khi đun nóng dung dịch protein với HNO2 đậm đặc tạo thành dẫn xuất Nitơ màu
vàng.





Khi thêm dung dịch kiềm vào sẽ tạo thành muối có cấu tạo Quinoit màu da cam.






Ngược lại, các protein không chứa acid amin vòng như gelatin không cho phản ứng
này.
Dinitrotyrozin (màu vàng)

dinitrotyrozin (màu da cam)

III. Phản ứng Millon :
Nguyên tắc:
Khi thuốc thử tác dụng với nhân phenol của tyrozin sẽ tạo nên hợp chất
nitrotyrozin thuỷ ngân có màu đỏ. Phản ứng Millon được dùng để phát
hiện tyrozin và các hợp chất phenol.

nitrotyrozin(màu đỏ)
IV. Phản ứng Adamkievic:
Nguyên tắc:
Trong môi trường acid, tryptophan phản ứng với nhiều loại
aldehid tạo thành những sản phẩm ngưng kết có màu đỏ tím
đặc trưng.

Bis - 2-tryptophanalilmetan
Đặc biệt riêng aminoacid như prolin khi tạo phức chất với ninhydrin sẽ có màu vàng, khác biệt hẳn với màu do acid amin khác tạo nên trong phản ứng.{Do vậy, ninhydrin còn được sử dụng cho phản ứng màu đặc trưng để phát hiện prolin}.
phức màu vàng
V. PHẢN ỨNG SAKAGICHI:
Nguyên tắc:
Đây là phản ứng phát hiện arginin : khi tác dụng với
hypobromit(NaBrO) và ?-naphtol,arginin sẽ tạo sản phẩm màu đỏ
cam.

Naphtoquinoimin
(maøu ñoû cam)

VI. PHẢN ỨNG FOLIA:(PHẢN ỨNG CỦA CÁC ACID AMIN CHỨA LƯU HUỲNH)
Nguyên tắc:
Các acid amin chứa lưu hùynh như cystin, cystein, methionin
dưới tác dụng của kiềm bị phân hủy tạo thành natri sunfua
(Na2S):
RSH + 2 NaOH Na2S + ROH + H2O
Thêm chì acetat và Na2S sẽ phản ứng tạo thành kết tủa nâu đen
của chì sulfua ( PbS):
Na2S + Pb(CH3COO)2 2(CH3COO)Na + PbS?
(kết tủa màu đen)
VII. PHẢN ỨNG CỦA PROLIN VỚI THUỐC THỬ ISATINE:

Nguyên tắc:
Ngoài phản ứng màu đặc trưng với ninhydrin, prolin còn có thể phát hiện
được dễ dàng nhờ phản ứng với thuốc thử Isatine:

Isatine - prolin(màu xanh lơ đậm)
VIII. PHẢN ỨNG PAULI ĐỂ PHÁT HIỆN HISTIDIN VÀ TYROZIN:
Nguyên tắc
Khi tác dụng với acid diazobenzosunfonic ( thuốc thử diazo),
histidin tạo thành phức chất màu da cam.
Công thức cuả phản ứng như sau:
Sự tạo thành aciddiazobenzosunfonic:

Acid diazobenzosunfonic
Acid sunfanilic
Phản ứng của histidin:
Phản ứng của tyrozin:
2, 5-bis-N-sunforbenzonazo histidin
(màu mận chín)
2,5-bis-N-sunforbenzonazo tirozin
(màu da cam)
IX. PHẢN ỨNG VỚI ACID NITƠ (HNO2)

Nguyên tắc:
Dưới tác dụng của HNO2 , acid amin bị dezamin hóa
tạo thành nitơ ở dạng khí.(Phản ứng này được sử dụng
để định lượng các ?-acid amin( phương pháp Van
Slyke)).
Phản ứng xảy ra như sau:

COOH COOH
| |
H2N - CH + O=N - OH ? OH - CH + N2 + H2O
| |
R R
X. PHẢN ỨNG VỚI NITƠ PRUXIT :
Nguyên tắc
Phản ứng diễn ra tương tự như phản ứng Folia, nhưng ở phản ứng này , natri nitropruxit thay thế vị trí của chì axetat
2 NaOH

R - SH R - SH

Na2S H2O

H2O

Na2Fe( CN)5NO Na4Fe(CN)5NO


H2S
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN
I. PHƯƠNG PHÁP NITƠ FORMOL (PHƯƠNG PHÁP SORENSEN)
Nguyên tắc:
Dựa vào phản ứng giữa acid amin của Protein với Formol tạo thành metylen
(-N=CH2) làm nhóm (-NH2) mất tính kiềm, tính axit của nhóm (-COOH )
được thể hiện và có thể định lượng bằng một chất kiềm với phenolphtalein
làm chỉ thị màu.
R CH COOH + HCHO R CH COOH + H2O
NH2 N =CH2

II. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ GIẤY
Nguyên tắc:
Khi chấm một hỗn hợp các acid amin lên một tờ giấy lọc rồi
nhúng đầu tờ giấy vào một dung môi thích hợp (phenol,
butanol, .) thì dung môi sẽ thấm trên tờ giấy. Kết quả là hỗn
hợp acid amin được phân tích ra thành từng acid amin riêng
biệt.
CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH PROTEIN
I. Phản ứng Biure:
Nguyên tắc:
Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptid, trong
môi trường kiềm mạnh, liên kết peptid trong phân tử
Protein phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu
xanh tím,tím đỏ
II. PHẢN ỨNG LOWRY

Nguyên tắc:
Đặc trưng cho sự tạo thành phức màu của các gốc acid amin
vòng với thuốc thử Folin - xiocanto.
III. PHƯƠNG PHÁP TẠO TỦA VỚI TCA
Nguyên tắc:
TCA là một acid hữu cơ (tricloacetic) khi cho TCA
vào dung dịch thì nó làm kết tủa Protein sau đó ta
đem lọc và rửa kết tủa sẽ thu được protein.
CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN
ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDHL
Nguyên tắc:
Protein được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ tổng số và kết quả nhân với 6,25.
Trong thực tế bên cạnh Protein thật còn có các chất hữu cơ khác có chứa nitơ như: alcaloic, amin, amoniac, acid nitric..Các chất này gọi là nitơ phi Protein. Vì vậy trong trường hợp này cần phải xác định nitơ tổng số và nitơ phi Protein sau đó xác định nitơ Protein.
Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein
? Nitơ protein = Nitơ tổng số - Nitơ phi protein

ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ THEO PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL
1.1 Nguyên tắc: gồm 2 giai đoạn
Giai đoạn vô cơ hóa: (quá trình tiến hành trong tủ hotte)
h?p ch?t ch?a N? (NH4)2SO4
Giai đoạn cất đạm: (quá trình xảy ra trong máy cất đạm)
(NH4)2SO4 + NaOH ? Na2SO4 + NH3 + H2O
NH3 + H2SO4 ? (NH4)2SO4 + H2SO4 dư
NaOH + H2SO4 ? Na2SO4 + H2O
1.2 Công thức tính toán

Trong đó:
X: % khối lượng nitơ trong mẫu
Vo: số ml H2SO4 đem hấp thụ NH3
V1: số ml NaOH 0,01N tiêu tốn khi khi chuẩn độ H2SO4
thừa
m: khối lượng mẫu đem vô cơ hóa
0,0014: lượng gam nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N
Nếu là chất lỏng thì:


trong đó: Vm là thể tích mẫu

2. ĐỊNH LƯỢNG NITƠ PHI PROTEIN

Nguyên tắc:
Dùng các dung môi thích hợp để kết tủa
tất cả các dạng nitơ Protein.Lọc kết tủa
Protein, rửa kết tủa nhiều lần ta được
dung dịch phi Protein. Vô cơ hóa dung
dịch, cất đạm. tương tự định lượng nitơ
tổng số.
3. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TRONG NGUYÊN LIỆU

Cách 1: xác định trực tiếp
Protein = Nitơ Protein * 6,25
Cách 2: xác định gián tiếp
Nitơ tổng số = Nitơ Protein + Nitơ phi Protein
Nitơ Protein = Nitơ tổng số - Nitơ phi Protein
? Protein = Nitơ Protein * 6,25
II. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BIURE

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng tạo màu giữa Protein và Cu+2 trong môi trường
kiềm tạo phản ứng màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 540nm










Phản ứng Biure



III. ÑÒNH LÖÔÏNG PROTEIN BAÈNG PHÖÔNG PHAÙP LOWRY

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng màu của Protein và thuốc thử Folin để tạo phức màu xanh đặc trưng có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 750nm và dựa vào đường chuẩn Protein để từ đó dịnh lượng hàm lượng Protein.

IV. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BRADFORD (COOMASSIE BRILLIANT BLUE G - 250):

Nguyên tắc: Dựa phản ứng màu của Protein với xanh
Coomassie. Trong môi trường axit Coomassie Brilliant Blue G
250 liên kết chặt chẽ với Protein, tương tác với cả nhóm kỵ
nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử Protein
làm dung dịch có màu xanh và có khả năng hấp thụ ánh sáng ở
bước sóng 595nm.


V. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG BICINCHONINIC ACID (BCA)
Nguyên tắc:
Dựa vào phản ứng giữa Protein và thuốc thử BCA trong môi
trường kiềm tạo màu đỏ tía (tím), có độ hấp thu cực đại ở bước
sóng 562nm.





Phản ứng cho axit bincinchoninic (BCA)
VI. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ
Nguyên tắc: Dựa vào sự hấp thụ tia cực tím ở bước
sóng 280nm của Protein. Các Protein hấp thụ tia cực
tím cực đại ở bước sóng 280nm do các acidamin
Tryptophan, Tyrozin và một phần là Phenylalanin
VII. PHƯƠNG PHÁP HUỲNH QUANG O- PHTHALALDEHYDE (OPA)

Nguyên tắc:
Dựa vào phản ứng giữa O-Phthalaldehyde (OPA) với
các amin có mặt trong chuổi polypeptide (từ đầu đến
cuôi mạch kể cả chính và phụ). Phản ứng xảy ra
nhanh trong sự có mặt của mercaptoethanol tạo sản
phẩm huỳnh quang có màu xanh và hấp thụ cực đại ở
bước sóng 340nm -450nm.
IX. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMONIAC.

Nguyên tắc :
Dựa vào phản ứng của nitơ dưới dạng vô cơ với MgO thì những
loại nitơ nói trên sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, nên chúng sẽ
được lôi cuốn theo hơi nước qua một bình đựng lượng thừa axit.
Sau đó đem định phân lượng axit dư, cho phép ta xác định
được loại nitơ này.
2(NH4)+ + Mg(OH)2 2NH3 + 2H20 + Mg2+
2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4

XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE