Công nghệ DNA

CÔNG NGHỆ GENE
(GENETICS ENGENEERING)

Nguyễn Vũ Phong
Chương II
QUY TRÌNH TIẾN HÀNH
Bước 1: Nuôi tế bào chủ và tế bào cho
Bước 2: Tách DNA plasmind và DNA tế bào cho
Bước 3: Cắt DNA plasmid và DNA mục tiêu
Bước 4: Nối 2 loại DNA bằng enyme nối tạo DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh
Bước 5: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận (thường là vi khuẩn E.coli)
Bước 6: Chọn lọc và nhân dòng vi khuẩn mang gene tái tổ hợp
Bước 7: Nghiên cứu điều kiện để gene biểu hiện ra sản phẩm
1. Enzyme
1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE)
1962: hạn chế sự sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn
Hệ thống hạn chế - biến đổi (restriction – modification system) giúp bảo vệ tế bào khỏi sự xâm nhập của DNA lạ.
Trình tự nhận biết: trình tự 4-6 cặp nu đối xứng đảo ngược (palindrom)
Cắt tạo thành đầu so le (sticky end) hay đầu bằng (cohesive end) .
1. Enzyme
1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE)
Khoảng 3000 RE với 230 trình tự nhận biết khác nhau.
Quy tắc đặt tên: EcoRI
Eco: Escherichia coli
R: dòng vi khuẩn
I: thứ tự RE được tìm ra (I: đầu tiên)
1. Enzyme
1.2. Enzyme nối (Ligase)
- Nối : hình thành cầu phosphodiester
Ligation. (ligere = latin ‘to join’)

1. DNA Ligase reacts with an AMP donor in an ATP (or NAD+ dependent manner depending on the source of ligase)  activated enzyme.
2. Activated enzyme donates AMP to free 5’-PO4= at the nick in the lower strand of the DNA duplex, creating a high-energy diphosphate group on one side of the nick.
3. Cleavage of the di-phosphate bond liberates energy to create a new phosphodiester bond. Seals the nick in the DNA.

N.B. Reaction can occur on Both Strands, allowing joining of two independent DNA molecules.
1. Enzyme
1.3. Enzyme phiên mã ngược
(reverse transcriptase)
Tổng hợp DNA một mạch c-DNA (complementary DNA) từ một sợi mRNA hoặc từ polyribonucleotide tổng hợp
c-DNA có thể tổng hợp thành c-DNA kép (c-DNA duplex) nhờ DNA polymerase. c-DNA kép được dùng trong việc tạo dòng c-DNA
1.4. Các enzyme khác
1. Enzyme
2. Các vector chuyển gene
Plasmid:
DNA vòng tròn
Sao chép độc lập trong tế bào
Có khả năng mang một số gene có khả năng biểu hiện thành protein

Vector:
Có khả năng tự tái bản
Tồn tại độc lập trong tế bào
Mang được gene mong muốn
Yêu cầu đối với vector chuyển gene.
Có trình tự khởi đầu sao chép (ori)
Trình tự nhận biết cho RE
Trình tự điều hòa (promoter)
Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp
Có gene đánh dấu (marker) để dễ dàng nhận biết.


2. Các vector chuyển gene

Ứng dụng của vector chuyển gene
Tạo dòng và khuyếch đại trình tự DNA
Nghiên cứu sự biểu hiện của đoạn trình tự DNA
Chuyển gene
Sản xuất RNA
Sản xuất protein từ gene được tạo dòng.

2.1. Vector chuyển gene plasmid
Plasmid của vi khuẩn và bacteriophage.
pBR322
2. Các vector chuyển gene
2.2. Phage λ
Có hệ thống xâm nhập tự động và sinh sản
Có dạng tròn hoặc dạng thẳng, 2 đoạn cos (12 nu) ở 2 đầu mút, dùng tạo cosmid và phagemid
Mang được đoạn DNA (15-23Kb)
Dùng trong thành lập ngân hàng gene
2. Các vector chuyển gene
2.3. Cosmid :
Plasmid gắn thêm đoạn cos của phage,
Có thể chứa đoạn gene dài đến 45kb
Dùng lập thư viện gen
2. Các vector chuyển gene
2.4. Phagemid
2.5. Phage M13:
DNA mạch đơn
Dùng xác định trình tự nucleotide của gene
Sản xuất mẫu dò (probe)
Gây đột biến điểm định hướng (site-directed mutagenesis)
2. Các vector chuyển gene
2.5. Plasmid Ti
Agrobacterium tumefaciens
Chuyển gen ở thực vật
200Kb
Chuyển và gắn ngẫu nhiên vào bộ gene của tế bào
2. Các vector chuyển gene
2.6. Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men (YAC-yeast artificial chromosome)
- Plasmid vòng tròn 2m
Chứa đoạn DNA lạ dài đến 2000Kb
2. Các vector chuyển gene
2.7. Các nhiễm sắc thể nhân tạo khác
BAC (Bacterial artificial chromosome)
MAC (Mammalian artificial chromosome)
P1AC (P1 bacteriophage derived artificial chromosome)
3. Hệ thống tế bào chủ (Host)
Mục đích:
Nhân nuôi tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng.
Biểu hiện gene
Sản xuất protein tái tổ hợp.
3.1. Escherichia coli (E.coli)
Dễ nuôi cấy và nhân dòng
Dễ chấp nhận các loại vector khác nhau.
Vi khuẩn Gram-, hình que,
Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base

3. Hệ thống tế bào chủ (Host)
3.2. Saccharomyces cerevisiae
Đối tượng nghiên cứu của vi sinh vật Eukaryote
Phân lập được nhiều promotor hoạt động mạnh
Thực hiện biến đổi sau dịch mã tạo protein có đủ hoạt tính sinh học.
Sản xuất protein tái tổ hợp
Sinh vật an toàn

3.3. Hệ thống tế bào thực vật
3.4. Hệ thống tế bào động vật
Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney)
Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney)
Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney
Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary)
Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều hiện protein người
Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans
3. Hệ thống tế bào chủ (Host)
Lai nucleic acid
Tách chiết và tinh sạch DNA và RNA
Điện di trên gel
Small
Large
Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
Lai nucleic acid
Lai trên pha rắn
Southern blot, Northern blot, Western blot, Dot và slot blot
Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
Lai nucleic acid
Lai trên pha rắn

Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
Dot và slot blot
dùng cho RNA và DNA
Lai nucleic acid
Lai trên pha rắn
Lai tại chổ
(in situ hybridisation): nghiên cứu nucleic acid tại chổ không cần phải tách chiết ra ngoài

Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
2. Thu nhận gene
Thu nhận DNA từ bộ gene
* Shotgun
* Ngân hàng/thư viện DNA bộ gene (Bank/Library of genomic DNA)
Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học
Lập ngân hàng c-DNA
* Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (no intron)
* Xác định đúng dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobine
Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
2. Thu nhận gene
Thu nhận DNA từ bộ gene
Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học






Lập ngân hàng c-DNA
* Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (no intron)
* Xác định đúng dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobine
Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
3. Tạo plasmid tái tổ hợp
Dùng đầu so le

Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
3. Tạo plasmid tái tổ hợp
Dùng đầu so le
Dùng các đoạn nối (linkers)

Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
3. Tạo plasmid tái tổ hợp
Dùng đầu so le
Dùng các đoạn nối (linkers)
Dùng enzyme terminal transferase

Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào
Hóa biến nạp
Tế bào vi khuẩn không có plasmid có khả năng dung nạp (competent cell)
Ủ hỗn hợp, xử lý CaCl2 lạnh + sốc nhiệt (42oC, 2 phút)






Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào
a) Hóa biến nạp
b) Điện biến nạp (electroporation)

Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào
a) Hóa biến nạp
b) Điện biến nạp (electroporation)
c) Vi tiêm (micro-injection)
d) Bắn gene
....

Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gene
a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp
Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gene
a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp
Kỹ thuật và
phương pháp căn bản
b) Tạo dòng
c) Sự biểu hiện của gene được tạo dòng
Vector biểu hiện
Yêu cầu:
Số lượng hợp lý bản sao cho mỗi tế bào
Promotor biểu hiện
Trình tự bám vào ribosome (rbs) và DNA phụ cho dịch mã tốt
Sự ổn định lâu dài
Tránh sự thủy giải protein (proteolysis) do các enzyme trong tế bào

PCR
(Polymerase Chain Reaction)
1985, Kary Mullis
1. Nguyên tắc











2. Các thành phần của phản ứng
Primer
Polymerase chịu nhiệt
dNTP
Dung dịch đệm
PCR dựa trên 3 bước ở nhiệt độ khác nhau. 1.

1. Biến tính: tạo dây đơn DNA với nhiệt độ 94oC
2. Bắt cặp: lai giữa primers và dây đơn DNA. Nhiệt độ thay đổi tùy theo, khoảng 50oC
3. Kéo dài : tạo dây DNA bổ sung với tác động của polymerase và dNTPs: 72oC.

Lập lại chu kỳ khoảng 30-40 lần sẽ tạo ra số lượng DNA cần khuếch đại đủ quan sát trên gel qua quá trình điện di
PCR
(Polymerase Chain Reaction)
3. Ý nghĩa
Thời gian
Hiệu quả kinh tế
Thực hiện
4. Cách dạng PCR khác
RT-PCR
Competitive RP-PCR
Real Time PCR
PCR- ELISA
Sequencing
Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert
Sequencing
Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert
Phương pháp didesoxy của F. Sanger
Ứng dụng công nghệ gene
Khai thác DNA các bộ gene
1.1. Genomics:
Xác định trình tự nucleotide của bộ gene và chức năng của chúng
Phát hiện, bảo tồn sự đa dạng sinh học, sử dụng chúng.
1.2. Proteomics
Nghiên cứu cấu hình (conformation), vị trí (localization), các biến đổi (modification), sự tương tác (interactions), chức năng (function)
Tạo hormone, vaccin tái tổ hợp dùng chữa trị bệnh.
1.3. Human Genome Projet
1.4. Các ngành học khác
Cellomics
Metabolomics
Ionomics
Ứng dụng công nghệ gene
Khai thác DNA các bộ gene
Công nghệ RNA

rRNA, mRNA, tRNA
ribozyme
RNAi, microRNA
Mạng lưới RNA
Thụ động
Slipcing
Postranscriptional
regulation
Công nghệ RNA
Antisense RNA
Interfering RNA và microRNA
Các ribozyme

Ứng dụng công nghệ gene
Khai thác DNA các bộ gene
Công nghệ RNA
Công nghệ protein tái tổ hợp
- Sản xuất r-protein

Ứng dụng công nghệ gene
Khai thác DNA các bộ gene
Công nghệ RNA
Công nghệ protein tái tổ hợp
Sản xuất r-protein
Chế tạo protein
* Nối các đoạn gene tạo protein dung hợp (fusion protein)
* Làm mất đoạn hoặc tăng đoạn gene
* Thay thế nucleotide

Ứng dụng công nghệ gene
Khai thác DNA các bộ gene
Công nghệ RNA
Công nghệ protein tái tổ hợp
Chẩn đoán phân tử
Dựa trên phương pháp lai DNA
DNA marker
Biomarker
DNA fingerprinting
Micro array và Biochips
5. Vi sinh vật chuyển gene
6. Thực vật chuyển gene
7. Động vật chuyển gene
Khai thác DNA các bộ gene
Công nghệ RNA
Công nghệ protein tái tổ hợp
Chẩn đoán phân tử
5. Vi sinh vật chuyển gene
6. Thực vật chuyển gen
7. Động vật chuyển gene
8. Công nghệ gene đối với sức khỏe con người

Xét nghiệm SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
* Thiết kế thuốc cho từng bệnh nhân
* Nhận dạng từng nhóm bệnh, xác định phương thức điều trị

Pharmacogenomics:
Cung cấp cách chữa bệnh an toàn và hiệu quả cho từng cá nhân

Gene therapy:
* Dùng rprotein hoặc bổ sung enzyme
* Thay thế gene

Ứng dụng công nghệ gene
Hết chương II
Còn 4 chương lý thuyết và 8 seminars
Hẹn tuần sau !