CLONING

NHÓM 9
NGUYỄN THỊ SON
LÊ THỊ CẨM NHIÊN
LÊ CẨM TÚ
LÊ CHÍ NGUYỆN
LÊ MINH ĐIỆP
NGUYỄN HOÀNG TUẤN
TRƯƠNG THÚY UYÊN
NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC
GVHD. ThS: TRẦN THỊ THANH XÀ
KĨ THUẬT CLONING
DNA tái tổ hợp.
Sinh sản vô tính.
Nhân bản điều trị.
có ba loại công nghệ nhân bản:

Qui trình cloning gồm 4 phần cơ bản sau:

Phương pháp tạo ra các đoạn DNA
Phản ứng kết nối DNA và vecter tạo ra recombinant DNA
Phương tiện du nhập “recombinant” (phân tử tái tổ hợp) nhân tạo này vào tế bào chủ, ở đó nó có thể tự tái bản được
Phương pháp chọn lọc hoặc tạo thanh lọc dòng vô tính nào đó của dòng tế bào nhận, tế bào này tạo ra được phân tử tái tổ hợp này.
Các bước cơ bản trong kỹ thuật cloning
Kĩ thuật cloning một gen mục tiêu
Một đoạn phân tử DNA chứa gen mục tiêu được clone hóa là đoạn DNA được gắn vào một vectơ có dạng DNA vòng tròn.
Trong tế bào vi khuẩn , chúng thực hiện chức năng phân chia tế bào và sinh sản phát triển

Các vectơ được nhân nhanh trong tế bào chủ , nhân bản lên gấp nhiều lần, các bản sao giống hệt bản gốc.

Mỗi clone có chứa đoạn DNA tái tổ hợp
Kiểu vecto thông dụng nhất là plasmid với khả năng tự tái bản rất tốt.

Phương pháp cloning sẽ cho ta một đoạn phân tử DNA mục tiêu tinh khiết.
Người ta tìm ra kĩ thuật ñôn giản để phân lập vi khuaån
sau đó nhặt các colony này ra đĩa pêtri.
vi khuẩn sẽ mang một đoạn DNA khác nhau từ cá thể vi khuẩn ban đầu.
Thư viện gen
Kỹ thuật tạo cDNA
Lai DNA-DNA
Khi nhiệt độ nóng lên (94’C), dây xoắn đôi của DNA bị biến tính thành sợi đơn. Người ta gọi đó là thuật ngữ denature (biến tính) hoặc melting(nóng chảy).Khi làm lạnh trở lại , sợi đôn sẽ được lai với một sợi đơn phân tử thăm dò ,(probe) tương thích tại vị trí đúng của các cặp baze tương ứng với nhau bắt cặp trở lại để hình thành dây đôi (annealing).
Phân tử probe được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ P32
Các colony có thể cấy trong đĩa pêtri
Một trong những cách làm đơn giản nhất do Lang và ctv. (1981) thực hiện là hình thành đuôi dc của dây đơn cDNA, theo sau đó là phản ứng “priming”bằng oligo (gD) để tổng hợp dây thöù hai,hiện tượng vòng “hair pin” không xảy ra, không cần xử lí nuclease Sl và kết quả cuối cùng tạo ra dây cDNA có chiều dài nguyên vẹn.
Hai phương pháp cải tiến của Okayama và Berg (1982), Heidecker và Messing (1983) cũng có hiệu quả rất cao, nhằm hạn chế tối đa việc sử dụng nuclease Sl.
Lợi ích của phương pháp Okayama và Berg là cDNA có thể được gắn vào vectơ có định hướng rõ ràng.Đó là một daïng ứng dụng để gắn cDNA vào vectơ thực khuẩn thể T3, T7 hoặc SP6 promoter .
=> Sử dụng các primer ngẩu nhiên trong kĩ thuật cloning c DNA

Có ba hạn chế trong phương pháp này:
Không phải tất cả các RNA đieàu mang chuỗi mã poly(A) có “3”-terminal”. Người ta có thể thêm vào chuỗi mã poly(A) in vitro với poly (A) polymerase thuần khiết , nhưng điều này có thể gây ra nhiều vấn đề bất lôïi.

Phân tử mRNA có kích thước lớn có thể khó xử lý, có kích thước có thể khó xử lí , bởi vì người ta không hi vọng sẽ tổng hợp và chạy sequence các clone có quan hệ với primer dạng oligo(Dt).

Sai lệch ở đầu 3’:phản ứng “priming” xảy ra tại đầu 3’ của poly (A)+ mRNA, sinh tổng hợp cDNA thường không hoàn toàn ,cho nên thư viện cDNA thường rất giàu chuỗi mã 3’-terminal.
PCR & thư viện cDNA và thư viện DNA của genome
Với nhiều thành tựu diệu kỳ của PCR trong những năm gần đây, người ta có xu hướng thực hiện các thư viện DNA của genome và thưviện cDNA trên cơ sở PCR . Nó cho chúng ta một phương pháp nhanh hơn, đơn giản hơn trong quá trình xây dựng thư viện và thanh lọc đánh giá thư viện.
Vectơ sử dụng trong Công nghệ DNA tái tổ hợp:
Có nhiều loại vector nhân dòng khác nhau như plasmid, bacteriophage, cosmid, YAC (yeast artificial chromosome), BAC (bacterial artificial chromosome) tuỳ theo kích thước ñoạn DNA cần nhân dòng mà sử dụng loại vector thích hợp.
Đặc tính lý tưởng cho một vector nhân dòng:

Có khả năng tự sao bản độc lập và tạo ra nhiều copy trong một tế bào chủ
vector được phân lập và làm tinh khiết một cách dễ dàng
Dễ dàng đưa vào tế bào chủ
Khi mục tiêu là chuyeån gene vector phải có khả năng tự tổng hợp và DNA chèn vào nó phải được đưa vào genome của tế bào chủ
Vector phải có một hoặc nhiều chỉ thị di truyền chọn lọc (maker gene). Cho phép deã dàng phát hiện thí dụ như gen kháng sinh, gen xúc tác cho tính tạo maøu, điều này cần thiết cho sự chọn lọc các tế bào đã được nhận vector

Vector lý tưởng phải chứa duy nhất vị trí mà tại đó được nhiều enzyme giới hạn nhận biết và cắt tại đó để DNA chèn vào có thể được tổng hợp mà không có sự rối loạn chức năng thiết yếu.
Nhật Bản nghiên cứu đã chỉ ra rằng con chuột nhân bản sống trong sức khỏe người nghèo và chết sớm.
Khoảng một phần ba của con bê nhân bản sinh sống đã chết trẻ, và nhiều người trong số họ đã lớn bất thường.
Nhiều động vật nhân bản đã không sống đủ lâu để tạo ra dữ liệu tốt về độ tuổi bắt chước làm thế nào.
động vật đã được nhân bản?

Các nhà khoa học đã được nhân bản động vật trong nhiều năm.
Năm 1952, các động vật đầu tiên, một tadpole, được nhân bản.
Trước khi việc tạo ra Dolly, các động vật có vú đầu tiên nhân bản từ các tế bào của một động vật cho người lớn, bắt chước được tạo ra từ các tế bào phôi thai.
. Kể từ khi Dolly, các nhà nghiên cứu đã nhân bản một số loài động vật lớn nhỏ bao gồm cả cừu, dê, bò, chuột, lợn, mèo, thỏ, và một bò tót.
Những rủi ro của nhân bản
Sinh sản vô tính là rất tốn kém và không hiệu quả.
Hơn 90% các nỗ lực nhân bản để sản xuất con cái không khả thi.
Hơn 100 thủ tục chuyển giao hạt nhân có thể là cần thiết để tạo một clone khả thi.
Ngoài giá thành thấp, động vật nhân bản có xu hướng có nhiều bị tổn hại chức năng miễn dịch và tỷ lệ lây nhiễm cao, khối u tăng trưởng, và các rối loạn khác.
MỘT VÀI HÌNH ẢNH CỦA CLONING
Hi !!!

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Google.com.vn/công nghệ sinh học việt nam …..
Google.com.vn/biotechnology…
Trong sách phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học…….
Di truyền phân tử.giáo sư tiến sĩ Bùi Chí Bửu - Nguyễn Thi Lang….
Chân thành cảm ơn cô và các bạn đã theo dõi !!!