Chuyển gen trực tiếp

Trường Đại học Nha Trang
Viện Công nghệ sinh học và môi trường
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT
Đề tài : Phương pháp chuyển gene trực tiếp vào tế bào thực vật

Giáo viên hướng dẫn:
Phạm Ngọc Minh Quỳnh

Danh sách nhóm:
An Thị Tươi
Nguyễn Châu Sa
Phạm Trà My
Bùi Thị Minh
LêThị ThuTrang
Vài nét về kỹ thuật chuyển gene
Các phương pháp chuyển gene trực tiếp
Ứng dụng và thành tựu
Nội dung
I. VÀI NÉT VỀ KỸ THUẬT CHUYỂN GENE
Công nghệ chuyển gene là gì?
- Là việc chuyển gene của một sinh vật này sang sinh vật khác bắt buộc chuỗi DNA của sinh vật đó tiếp nhận DNA mới
Tại sao phải tạo cây chuyển gene?
-Theo phương pháp truyền thống, nhà tạo giống tìm cách tổ hợp lai các gene giữa hai cá thể thực vật nhằm tạo ra con lai mang những tính trạng mong muốn.
Tuy nhiên phương pháp này có một số hạn chế:
Chỉ có thể thực hiện được giữa cá thể cùng loài hoặc có họ hàng gần
Phải mất nhiều thời gian mới thu được kết quả mong muốn và thường là đặc tính quan tâm lại không tồn tại trong loài có họ hàng gần
͢ Kỹ thuật chuyển gene cho phép những nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một thực vật những gene mong muốn từ những sinh vật sống khác nhau.
Cây chuyển gene (transgenic plant)
- Là cây mang một hoặc nhiều gene được đưa vào bằng phương thức nhân tạo thay vì thông qua lai tạo như trước đây.
- Những gene được tạo đưa vào (gene chuyển ) có thể được phân lập từ những loài thực vật có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn
II. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GENE TRỰC TiẾP
Ngoài các hệ thống chuyển gene dựa vào Agrobsscterium và Virus , còn có các phương pháp đưa DNA trực tiếp vào các tế bào thực vật.
Cản trở lớn nhất của phương pháp này là thành tế bào vì thành tế bào khá vững chắc là rào cản ngăn chặn sự hấp thụ DNA vào tế bào TV do đó các phương pháp chuyển DNA trực tiếp đều phải giải quyết được rào cản này.
Để làm mất thành TB người ta thường sử dụng enzyme và dưới những điều kiện thích hợp có thể tạo ra TB trần. TB trần tiếp nhận DNA dễ dàng hơn.
Trực tiếp
Hóa chất
Ống phấn
Vi tiêm
Súng bắn gene
Xung điện
1. Phương pháp chuyển gene trực tiếp nhờ hóa chất
Là phương pháp chuyển gene vào protoplast nhờ các chất hóa học như polyethylene glycol (PEG)
Khi có mặt PEG thì màng của protoplast bị thay đổi và protoplast có thể thu nhận DNA ngoại lai vào bên trong tế bào
Ưu điểm: Phương pháp chuyển gene bằng hóa chất có thể áp dụng với nhiều loại tế bào thực vật.
Nhược điểm: Tần số chuyển gene rất thấp do không kiểm soát được quá trình chuyển gene.
2. Chuyển gene trực tiếp bằng súng bắn gene
Nguyên tắc của phương pháp này là ngâm các viên đạn nhỏ (vi đạn) bằng vàng hoặc tungsten có kích thước cực nhỏ, đường kính khoảng 0,5-1,5µm với dung dịch có chứa DNA ngoại lai cần chuyển vào tế bào thực vật
Các vi đạn này được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng có kích thước 0,5-0,9 cm.Đĩa kim loại này được gắn vào đầu một viên đạn lớn bằng nhựa hoặc vật liệu nhẹ. Viên đạn lớn có kích thước vừa khít đầu nòng súng bắn gene
2. Phương pháp chuyển gene bằng súng bắn gene (t.t)
Khi bắn áp suất hơi sẽ đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao. Tới đầu nòng súng, viên đạn lớn sẽ bị cản lại bởi một lớp lưới thép mịn. Còn các viên đạn nhỏ (vi đạn) vẫn tiếp tục di chuyển với vận tốc lớn tới 1300m/s đến đối tượng bắn rồi xuyên vào tế bào.
Súng bắn gene
2. Phương pháp chuyển gene bằng súng bắn gene (t.t)
Sau khi bắn ta tách mô, tế bào và nuôi cấy invitro để tái sinh cây. Chỉ có một tỷ lệ nào đó của tế bào mang gene chuyển, vì vậy cần phải chọn lọc. Người ta thường dùng khí nén helium áp lực cao để bắn gene
2. Phương pháp chuyển gene bằng súng bắn gene (t.t)
Ưu điểm:
Thao tác dễ dàng
Có thể chuyển gene vào nhiều loại tế bào và mô
Các tế bào được biến nạp có tỷ lệ sống cao, cho phép đưa các gene vào tế bào ở vị trí mong muốn
Nhược điểm: thiết bị đắt tiền.
3.Chuyển gene trực tiếp bằng xung điện
Trong công nghệ di truyền thực vật người ta thường dùng phương pháp xung điện để chuyển gene vào protoplast thực vật
Ở điện thế cao,trong thời gian ngắn có thể tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần làm cho DNA bên ngoài môi trường có thể xâm nhập vào bên trong tế bào.
3. Chuyển gene trực tiếp bằng xung điện (t.t)
Người ta chuẩn bị một huyền phù protoplast với các plasmid tái tổ hợp đã mang gene mong muốn cần chuyển vào tế bào thực vật
Dùng thiết bị xung điện tạo điện thế cao (200-400V/cm) trong khoảng thời gian 4-5 phần nghìn giây
3. Chuyển gene trực tiếp bằng xung điện (t.t)
Kết quả là màng tế bào xuất hiện các lỗ thủng tạm thời giúp cho các plasmid tái tổ hợp có thể xâm nhập vào hệ gene của tế bào thực vật.Quá trình này được thực hiện trong cuvet chuyên dụng.
Sau khi xung điện đem protoplast nuôi cấy trong môi trường thích hợp, môi trường chọn lọc để tách các protoplast đã được biến nạp. Sau đó nuôi cấy invitro, tái sinh cây và chọn lọc cây chuyển gene.
3. Chuyển gene trực tiếp bằng xung điện (t.t)

Ưu điểm: Áp dụng đối với nhiều loại thực vật
Nhược điểm:
Tỷ lệ các tế bào được chuyển gene còn thấp
Sức sống của tế bào giảm đột ngột, khó phục hồi.
4. Chuyển gene trực tiếp bằng ống phấn
Là phương pháp chuyển không qua nuôi cấy invitro
Nguyên tắc của phương pháp này là DNA ngoại lai chuyển vào cây theo đường ống phấn, chui vào bầu nhụy cái. Thời gian chuyển gene là vào lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy và lúc đưa tinh vào thụ tinh.
4. Chuyển gene trực tiếp bằng ống phấn (t.t)
Tốt nhất là sự chuyển gene xảy ra đúng khi quá trình thụ tinh ở noãn và cho tế bào hợp tử chưa phân chia. Như vậy sự chuyển gene chỉ xảy ra ở một tế bào cái duy nhất
4. Chuyển gene trực tiếp bằng ống phấn (t.t)
Ưu điểm: hiệu suất cao
Nhược điểm:
Đòi hỏi thao tác, kỹ thuật cao.

Quy trình trên cây lúa:
Lúa trồng trong chậu với các điều kiện: nước, phân, nhiệt độ, chiếu sáng thích hợp. Khi lúa trổ, chọn các hoa có hai vỏ trấu mở hoàn toàn và đánh dấu để khỏi nhầm lẫn với các hoa khác.
Dùng một kéo sắt cắt bỏ 2/3 đến 3/4 phần trên của hoa. Vòi nhị cái như vậy cũng bị cắt ngắn.
Dùng một ống mao quản ( đường kính trong 0,2 mm) đặt vào chỗ cắt 2-3 µl dung dịch DNA nồng độ 50 µg/ml , trong đệm TE.
Bao bông lúa đã thành thục. Sau đó thường bảo quản ở 4˚C.
Gieo hạt tạo cây và xác định sự có mặt của gene ngoại lai.
5. Chuyển gene trực tiếp bằng vi tiêm
Chuyển gene bằng vi tiêm là chuyển gene trực tiếp vào tế bào protoplast bằng cách sử dụng vi tiêm nhỏ, kính hiển vi và các vi thao tác.
Ưu điểm : đưa các gene chính xác vào tế bào, tối ưu hóa được lượng DNA đưa vào tế bào
Nhược điểm: Phương pháp này cần có thiết bj có độ chính xác cao, kỹ thuật và kỹ năng của người thực hiện phải chính xác
III. Ứng dụng, thành tựu và triển vọng
Ứng dụng:
Tạo các giống cây trồng có năng suất cao, chất lượng tốt
Đảm bảo ổn định đa dạng sinh học
Sử dụng hiệu quả nguồn nguyên liệu từ bên ngoài cho nông nghiệp và môi trường

Cây bông chuyển gen kháng sâu Bt
Cà chua chống chịu mặn
- Tiến sĩ Blumwald, đại học Califorina, Mỹ, đã tách ra một gene từ một loại cỏ nhỏ thuộc họ cải, sau đó chèn vào hạt cà chua rồi đem trồng.
- Gene này cho phép cây sản sinh ra một loại protein có thể tách muối ra khỏi nước, dồn vào các khoang dự trữ trong tế bào lá. Vì vậy theo cơ chế thẩm thấu, nước sẽ từ ngoài môi trường vào cơ thể mang theo nước và chất dinh dưỡng giúp cây tăng trưởng
Cà chua chuyển gene
Cà chua chữa bệnh ung thư
- Mới đây, các nhà khoa học Anh và Hà Lan đã thành công khi cấy một gene quy định việc tạo ra chất flavonol của loài hoa dạ yên thảo vào cây cà chua. Flavonol là hợp chất cho phép cơ thể chống lại bệnh ung thư và tim mạch.

Đặc biệt là ngô mang gene Bt (gene kháng sâu bệnh) được gieo trồng rộng rãi và thu được hiệu quả kinh tế cao.
Ngoài ra người ta còn tạo ra được giống đậu tương mới có khả năng kháng được thuốc diệt cỏ nên nông dân đỡ được rất nhiều công sức trừ cỏ.
Ngoài việc chuyển được những gene kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, người ta còn chuyển được những gene kháng được bệnh do virus, vi khuẩn gây ra, và cả một số gene có khả năng chịu hạn.
Triển vọng
Trong tương lai có thể tạo ra các thực vật chuyển gene tạo ra vaccin có thể ăn được, những thực vật này nhận kháng nguyên từ vi sinh vật hay loài kí sinh rồi nhiễm vào đường tiêu hóa của người và một ngày nào đó con người có thể đưa ra cách chữa bệnh an toàn, rẻ tiền và cung cấp vaccin trên toàn thế giới.
Triển vọng
Dự kiến tới đây người ta còn tạo ra một số cây trồng khác mang gen có thể bẻ gãy gene RDX thành các chất metalotes, không độc và sử dụng như các nguồn nitơ
RDX là một chất gây nổ độc hại, một loại hợp chất gây độc cả nguồn đất lẫn nguồn nước và tự nó rất khó phân hủy trong môi trường tự nhiên.
Triển vọng
Trong tương lai chuối chuyển gene được coi như là một lọai nồi phản ứng sinh học mang kháng nguyên để thay thế cho vaccine phòng chống bệnh viêm gan B do HBV gây nên, điều này người ta đã làm thành công ở khoai tây và cà chua.
Nồi phản ứng sinh học (bioreactor) sản
Xuất thay vaccine)