Chuyên đề Enzyme

CHÀO MỪNG CÔ
ĐẾN THĂM CHUYÊN ĐỀ
CỦA EM.
CHUYÊN ĐỀ ENZYME
GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN:LÊ THỊ XUÂN LAN.
HỌC SINH:
NGUYỄN NGỌC CHÂU BẢO.
Lớp 10A5
NĂM HỌC:2010-2011
Mở đầu
I.Lược sử phát triển enzim (E) học.
1.Lược sử nghiên cứu E.
2.Phân loại và đặt tên E.
II.Các phương pháp nghiên cứu E.
1.Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu E.
2.Các phương pháp xác định hoạt độ E.
III.Cấu trúc phân tử E.
1.Bản chất hóa học của E.
2.Thành phần cấu tạo.
3.Các bậc cấu trúc của phân tử.
4.Hệ thống nhiều E
5.Trung tâm hoạt động của E.
6. Proenzyme(zymogen).
IV.Hoạt động của E.
1.Cơ chế tác động của E.
2.Sự điều hòa hoạt động của E.
V.Tính chất và vai trò của E.
1.Tính chất của E.
2.Định khu của E trong tế bào.
3.Vai trò của E trong chuyển hóa vật chất của tế bào.
MỤC LỤC
VI.Tính đặc hiệu của E
1.Khái niệm.
2.Nguyên tắc lực xúc tác và giải thích tính đặc hiệu của E.
VII.Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng E.
1.Ảnh hưởng của nồng độ E:
2.Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất:
3.Ảnh hưởng của nhiệt độ:
4.Ảnh hưởng của pH:
5.Ảnh hưởng của các chất kìm hãm:
VIII.E Amylaza
1.Nguồn E amylaza.
2.Các loại E amylaza.
IX.Ứng dụng của E.
1.Sử dụng E trong y dược.
2.Sử dụng E trong hóa học.
3.Sử dụng E trong công nghiệp.
4.Sử dụng E trong nông nghiệp.

MỤC LỤC
Các quá trình hóa học diễn ra trong hệ thống sống là những
phản ứng có hiệu quả cao nhất.Đó là nhờ tác dụng
xúc tác của enzyme(E).E hay còn gọi là men là những chất xúc tác sinh
học(là prôtêin hay acid nucleic),có đầy đủ tính chất của
chất xúc tác,ngoài ra còn có những tính chất ưu việt
hơn như:có hiệu suất xúc tác cao ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường, có tính đặc hiệu cao. Các tính chất này vẫn được bảo tồn khi tách E ra ra khỏi hệ thống sống , hoạt động trong điều kiện invitro. Vì vậy, enzyme ngày càng được sử dụng rộng rãi trong thực tế, với qui mô ngày càng lớn,dẫn đến việc hình thành và phát triển ngành công nghệ sản xuất E và công nghệ sản xuất các thiết bị có cấu tử enzim như các biosensor,thận nhân tạo và cả các biochip.Việc sử dụng enzyme trong thực tế không chỉ có ý nghĩa về kinh tế mà còn giải quyết được nhiều vấn đề xã hội ,các vấn đề bức xúc về môi trường. - Hiện nay có khoảng 2000 enzim,trong đó hơn 200 enzim thu nhận ở dạng tinh thể
Để khai thác,sử dụng enzyme có hiệu quả,cần có những hiểu biết về nhất định về enzyme.
Các nội dung trên được trình bày trong 9 mục:
I.Lược sử phát triển enzyme học.
II.Các phương pháp nghiên cứu E.
III.Cấu trúc phân tử E.
IV.Tính đặc hiệu của E.
V.Các chất xúc tác.
VI.Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme.
VII.Công nghệ ADN tái tổ hợp.
VIII.Ứng dụng của enzyme.
IX.Enzyme không tan.
MỞ ĐẦU
I.LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN
ENZYME :
Enzyme là những prôtêin có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp.E có trong các tế bào sống,và nó là chất xúc tác sinh học có hiệu quả cao.E có đầy đủ tính chất của chất xúc tác,nhưng E có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vô cơ khác.E là một chất không những xúc tác được trong tế bào sống mà khi tách nó ra khỏi cơ thể sống ,ở những điều kiện nhất định thì chúng vẫn giữ được hoạt tính
xúc tác.Các chất do E xúc tác gọi là cơ
chất .E là những chất phân tử lớn tồn
tại trong tự nhiên ,hay được tổng hợp
có khả năng xúc tác cho một hay nhiều
phản ứng với mức độ đặc hiệu khác
nhau ở nhiệt độ và áp suất bình thường.
I.LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN
ENZYME :
1.LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU ENZYME.
a.Trước thế kỷ XVII.
-Việc sử dụng E có tính chất kinh nghiệm thuần túy.
-Người cổ xưa đã biết dùng vi sinh vật như là nguồn E trong các quá trình lên men như:làm bánh mì,làm rượu vang,làm giấm,…Người ta cũng đã tìm thấy các tài liệu viết từ xưa về vấn đề này ở Babylon,Roma,Hy Lạp,Egypt,Trung Quốc,Ấn Độ.
b.Thế kỷ XVII đến nửa đầu thế kỷ XVIII.
-Đã đề ra được khái niệm lên men.
-Vanhemon(Vanhemont)người Hà Lan,lần đầu tiên đã quan sát được hiện tượng tạo thành chất khí khác không khí trong quá trình lên men.
-1659,Silvius lần đầu tiên nêu lên rằng,về cơ bản,tất cả các quá trình sống đều là những quá trình hóa học.
c.Nửa cuối thế kỉ XVIII:
-Đã có những thí nghiệm đầu tiên về E.
-Ví dụ:công trình nghiên cứu khả năng tiêu hóa thịt trong dạ dày.công trình này do Reaumur (người Pháp) bắt đầu và sau đó được Spallanzani(người Ý) mở rộng (1729-1799).
I.LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN
ENZYME :
1.LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU ENZYME.
a.Trước thế kỷ XVII.
b.Thế kỷ XVII đến nửa đầu thế kỷ XVIII.
c.Nửa cuối thế kỉ XVIII:
Các tác giả đã cho thịt vào ống kim loại,đưa vào dạ dày nhiều động vật khác nhau ,kể cả người,và thấy rằng thịt bị tiêu hóa.Sau đó Spallanzani đã thí nghiệm thành công việc tiêu hóa thịt invitro ,từ đó Spallanzani đã giải thích rằng ,trong dịch dạ dày có một thành phần hoạt động đặc biệt có khả năng tiêu hóa thịt.Ông cũng chứng minh rằng ,quá trình tiêu hóa này phụ thuộc vào nhiệt độ và thời gian tiêu hóa ,phụ thuộc lượng dịch dạ dày .Ông cũng nhận thấy dịch dạ dày khi ở ngoài cơ thể thì không bền,khả năng tiêu hóa của nó giảm dần theo thời gian.Thời bấy giờ,những kết quả này là khá mới mẻ,thú vị và được nhiều người quan tâm .Năm1836,Schwann đã gọi chất làm tiêu hóa thịt này là pepsin(pepxin).
-Từ năm 1800,người ta cũng đã cho rằng,trong ruột có một E phân giải prôtêin khác.Sau đó Kuhne đã đặt tên E đó là trypsin.
-Protease thực vật được sử dụng khá sớm,từ năm 1700, người dân ở các đảo Thái Bình Dương đã biết dùng quả đu đủ để làm mềm thịt và chữa bệnh chốc lở(ringworm).
-Các kết quả nghiên cứu này đã kích thích việc nghiên cứu có hệ thống các E tiêu hóa vào thế kỷ XIX.













I.LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN
ENZYME :
1.LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU ENZYME.
a.Trước thế kỷ XVII.
b.Thế kỷ XVII đến nửa đầu thế kỷ XVIII.
c.Nửa cuối thế kỉ XVIII:
d.Nửa đầu thế kỷ XIX:
-Người ta đã tách được một số chế phẩm từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau có tác dụng
thủy phân các chất tương ứng ,và bắt đầu tách được các chất tạo nên quá trình lên men.
-Mở đầu là công nghệ nghiên cứu Kiêcgôp(người Nga,1814)chứng minh nước chiết xuất từ
hạt luá mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ từ 40_60 độC.
Năm 1833,Payenvà Perso(Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này,thu được kết tủa có khả năng
phân giải tinh bột thành đường,đặt tên là diastase(xuất phát từ tiếng Hi Lạp,diastatic,có nghĩa
là phân giải,đó là amylase).Tiếp theo,Leuchs(1851)đã phát hiện được nước bọt cũng có khả
năng phân giải tinh bột thành đường.Từ đó người ta đã chia E thành hai loại:E có tổ chức(hoạt
động thông qua hoạt động sống của tế bào vi sinh vật )gọi là ferment và E không có tổ chức
gọi là E.Sự phân biệt này đã bị bác bỏ sau khi Buchner thí nghiệm thành công việc lên men
bằng dịch tiết vô bào từ nấm men.
-Sau công trình này,người ta cũng đã tách được nhiều E khác ở dạng kết tủa.
I.LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN
ENZYME :
1.LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU ENZYME.
a.Trước thế kỷ XVII.
b.Thế kỷ XVII đến nửa đầu thế kỷ XVIII.
c.Nửa cuối thế kỉ XVIII:
d.Nửa đầu thế kỷ XIX:
e.Nửa cuối thế kỷ thứ XIX:
-Đã tinh sạch được một số E và nghiên cứu một số tính chất cơ bản của E.
-Ví dụ:Người ta đã biết dùng phương pháp hấp phụ lựa chọn để tinh sạch E,xác định đặc tác dụng
thuận nghịch của E(Danhilepski 1862);đã xác định tính tác dụng đặc hiệu của E (Fisher 1884),tác
dụng làm bền cơ chất với E.
-Trong thời kì này cũng đã có thông báo ban đầu về cơ chế tác dụng của E :Wurtz(1880)đã chỉ ra
rằng,papain (là một loại men phân giải protein tồn tại trong đu đủ. Enzim papain rất tốt cho hệ tiêu
hóa, giúp tiêu hóa các thức ăn giàu protein một cách dễ dàng hơn. Nó có thể giúp phân giải và loại bỏ
những lớp da chết trên bề mặt cơ thể. Vì vậy, nó thường được dùng trong lĩnh vực chế biến các loại
mỹ phẩm. )tạo thành hợp chất không tan với fibrin(Fibrin (còn gọi là Factor Ia) là một sợi protein
tham gia vào việc đông máu) trước khi thủy phân nó.

I.LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN
ENZYME :
1.LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU ENZYME.
a.Trước thế kỷ XVII.
b.Thế kỷ XVII đến nửa đầu thế kỷ XVIII.
c.Nửa cuối thế kỉ XVIII:
d.Nửa đầu thế kỷ XIX:
e.Nữa cuối thế kỷ thứ XIX:
f.Nửa đầu thế kỷ XX:
-Đã phát hiện được CoE(Harden và Young,1906);xác định ảnh hưởng pH đến hoạt độ E(Sorensen,
1909) ;nghiên cứu động học phản ứng E (Bayliss,1919);kết tinh được E và xác định được bản chất
hóa học của E là prôtêin;xác định được một số hệ thống E xúc tác cho quá trình đường phân
(Embden,Meyerhoff và Parnas,1933);chu trình acid tricacboxylic(Krebs,Knop và Martius,1937).
-Việc xác định cấu trúc phân tử E là vấn đề có tính chất cốt lõi để làm sáng tỏ nhiều vấn đề trong
nghiên cứu E.E đầu tiên được kết tinh là ureasa(James Sumner,1926).Sumner đã chỉ rõ rằng ,
tinh thể ureasa bao gồm prôtêin,khi hòa tan trong dung môi sẽ có hoạt tính E.Điều này đã khẳng định
được thành phần prôtêin của E.Công trình này là một bước ngoặc quan trọng trong lịch sử nghiên
cứu E .Trong vòng 20 năm sau đã có đến 130 E được kết tinh.Việc thu nhận E ở dạng tinh thể có ý
nghĩa quan trọng ở chỗ :nó cho phép sử dụng nhiễu xạ tia X để nghiên cứu cấu trúc phân tử.
I.LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN
ENZYME :
1.LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU ENZYME.
a.Trước thế kỷ XVII.
b.Thế kỷ XVII đến nửa đầu thế kỷ XVIII.
c.Nửa cuối thế kỉ XVIII:
d.Nửa đầu thế kỷ XIX:
e.Nữa cuối thế kỷ thứ XIX:
f.Nửa đầu thế kỷ XX:
•Những thành tựu chính về nghiên cứu E trong nữa cuối thế kỉ XX:
-Đã áp dụng thành công các phương pháp hiện đại trong nghiên cứu E:hoàn thiện phương pháp
xác định cấu trúc bậc 1 phân tử E;nghiên cứu liên quan giữa cấu trúc và chức năng của phân tử.
-Lần đầu tiên đã công bố bảng phân loại và cách gọi tên E một cách có hệ thống.
-Phát hiện các restrictase(E giới hạn)
-Tổng hợp hóa học E.Ribonuclease là E đầu tiên được tổng hợp (1968)bằng 2 phương pháp khác
nhau :kết hợp lần lượt từng amino acid với nhau(nhóm Merifeld) hoặc tổng hợp các đoạn peptide
ngắn ,sau đó nối chúng lại với nhau (nhóm Hirsman).
-Thiết kế E có hoạt tính hay tính đặc hiệu mới bằng cách ghép một E vào một khung cấu trúc khác
-Phát hiện được một số phân tử sinh học thuộc các nhóm chất có hoạt tính sinh học khác cũng có
hoạt tính xúc tác như E :các kháng thể,các ribôzyme.

I.LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN
ENZYME :
1.Lược sử nghiên cứu E:
2.Phân loại và đặt tên E:
Từ năm 1961,Hội Hóa Sinh quốc tế đã thống nhất phân loại các E
thành 6 lớp chính dựa vào kiểu phản ứng do E xúc tác:
1/Oxidoreductase:Xúc tác cho phản ứng oxi hóa_khử .
2/Transpherase:Xúc tác cho phản ứng chuyển vị .
3/Hydrolase:Xúc tác cho phản ứng thủy phân .
4/Lyase:Xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết tạo thành .
2 phân tử nhưng không cần H20;hoặc loại H20 tạo thành nối
đôi,hoặc kết hợp phân tử H20 vào nối đôi .
5/Isomerase:Xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa .
6/Lygase:xúc tác cho phản ứng kết hợp 2 phân tử kèm theo.
cắt đứt liên kết giàu năng lượng của ATP hoặc các nuclêoside
triphosphate khác .

I.LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN
ENZYME :
1.Lược sử nghiên cứu E:
2.Phân loại và đặt tên E:
-Mỗi lớp lại chia thành nhiều tổ,mỗi tổ lại chia thành nhiều nhóm .
-Do đó,trong bảng phân loại E,trước tên E thường có 4 số:
số thứ nhất chỉ lớp ,số thứ 2 chỉ tổ,số thứ 3 chỉ nhóm,và số thứ tư chỉ E.
Khi ghi tên E nào,thường để trong ngoặc đơn mã số của E trong
bảng phân loại(gồm 4 số)thêm tiếp đầu ngữ “E.C”(Enzyme
Commision) .
-Để đặt tên E,lấy tên cơ chất hoặc các cơ chất,thêm tiếp vĩ
ngữ “-ase” .
-Ví dụ:Một E xúc tác cho phản ứng chuyển vị nhóm amin có
tên hệ thống là L-alanine:2-oxoglutarate aminotranspherase
(E.C.2.6.1.2.),E này xúc tác cho phản ứng sau: .
(L-alanine)+(2-oxoglutarate)=pyruvate+(L-glutamate) .
II.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ENZYME:
1.Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu E.
-Như phần đầu đã nói đến,enzyme là những chất xúc tác sinh
học có bản chất protein và rất không ổn định. Trong những điều
kiện bất lợi,chúng rất không bền, có thể dễ dàng bị biến
tính(denaturation) và bị mất hoạt độ.Do đó, khi làm việc với
enzyme,phải luôn luôn chú ý tránh những điều kiện dễ làm
mất hoạt độ của nó.Thông thường phần lớn các enzyme hoạt
động được ở vùng pH trung tính hoặc gần như trung tính
(pH = 7± 2).Vì vậy các yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh dễ gây
biến tính enzyme.
-Những ion kim loại nặng như chì, đồng, thủy ngân... và các điều kiện về nhiệt độ cao cũng thường
làm mất hoạt độ enzyme. Đặc biệt là khi tách và làm sạch enzyme, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp.
Nhiệt độ thường dùng cho các công việc này thông thường từ 0 độ C đến 5 độ C.Đối với các enzyme
không bền,các công đoạn làm sạch có thể được tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn (từ - 50C đến - 200C).
Trong các trường hợp này, người ta hay sử dụng các hỗn hợp lạnh như nước đá với CO2 hoặc nước
đá với muối NaCl, hoặc thậm chí người ta dùng cả hỗn hợp nước đá với sulfuric acid đậm đặc...
Ví dụ về một số hỗn hợp làm lạnh đã được trình bày trên bảng 1.


II.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ENZYME:
1.Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu E.
Bảng 1:






-Như trên đã nói, nhiều enzyme bị mất hoạt tính ở các dung dịch cópH < 5 hoặc pH > 9, tuy rằng có
một số ngoại lệ như pepsin bền trong acid. Do đó, tùy thuộc mỗi loại enzyme, song nên chú ý tránh
pH quá acid hoặc quá kiềm. Khi điều chỉnh pH của dung dịch đệm có chứa enzyme cần phải thêm từ
từ và rất thận trọng các acid hoặc kiềm. Và khi thêm hóa chất để điều chỉnh pH thì nên tiến hành ở 0
độ C. Khi làm việc với enzyme cũngcần chú ý tránh tạo bọt vì nhiều enzyme bị biến tính (mất hoạt
tính) ở mặt phân cách hai pha nước và khí. Để tránh việc tạo bọt có thể xảy ra, người ta thường rót
dung dịch enzyme theo thành ống thủy tinh và không được lắc. Có khi việc tách từng phần enzyme
bằng bột dễ làm mất hoạt tính enzyme. Vì vậy, để khắc phục tình trạng này, người ta thường thêm
ammonium sulfate dưới dạng dung dịch bão hòa của nó.
II.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ENZYME:
1.Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu E.
-Trong khi xử lý các mẫu thí nghiệm như cắt, thái, xay nhỏ
Các mẫu thực vật và động vật (ví dụ lá cây, thịt, các cơ quan
nội tạng...) không dùng các dụng cụ dao kéo dụng cụ
xay đã han rỉ để tránh tác dụng của các ion kim loại nặng
như (Cu, Pb, Fe...) mà dùng dụng cụ inox..
-Khi dùng các dung môi hữu cơ như aceton, alcol để kết
tủa enzyme cần tiến hành ở nhiệt độ thấp. Tách kết tủa
enzyme bằng cách ly tâm lạnh tốt hơn lọc lạnh vì tiến hành
nhanh hơn. Ở một số trường hợp,khi tách và làm sạch enzyme có hiện tượng giảm dần hoạt độ, vì
vậy cầnphải làm thí nghiệm nhanh. Tốt nhất là thực hiện thí nghiệm liên tục,không ngắt quảng. Ví dụ
tách chiết các enzyme chống oxy hóa (antioxidant enzyme) ở ty thể trong vòng 6h và đo luôn nếu
không thì mất hoạt tính. Còn ở microsome thì tiến trình có thể kéo dài hơn vẫn không ảnh hưởng đến
hoạt độ các enzyme chống oxy hóa và các enzyme oxy hóa khử.
-Một điều cần chú ý nữa là trong khi tiến hành xác định hoạt độ của các enzyme, nếu đã xác định
trong khoảng nhiệt độ nào thì tất cả các thành phần của hỗn hợp phản ứng phải được giữ ở nhiệt độ
ấy. Lúc này nhất thiết phải dùng máy ổn nhiệt ( thermostate). Khi hỗn hợp phản ứng đã đạt được nhiệt
độ cần thiết thì mới tiến hành đo. pH trong quá trình này cũngphải được giữ ổn định bằng dung dịch
đệm và phải đảm bảo độ chính xác của pH: những phản ứng tạo acid thì phải thêm kiềm vào và
ngược lại.
II.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ENZYME:
1.Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu E.
-Để đảm bảo kết quả tin cậy, tránh sai số nhiều, phải lấy thật
chính xác lượng dịch enzyme. Người ta thường dùng loại
pipette không chia độ hoặc sau này dùng các loại
micropipette. Trong khi thí nghiệm cần chú ý tránh đánh rơi
enzyme vào dung dịch nghiên cứu. Ví dụ đang làm thí nghiệm
với amylase chẳng hạn thì không nói chuyện nhiều. Khi đã
có chế phẩm enzyme, cần bảo quản chúng ở nhiệt độ thấp.
Một số enzyme ổn định ở dung dịch đậm đặc của
ammonium sulfate. Trong trường hợp này, người ta giữ
các kết tủa ở dạng huyền phù trong dung dịch ammoni sulphate bão hòa và lấy chế phẩm ra bằng
cách ly tâm. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, việc sấy khô chế phẩm enzyme sẽ làm mất hoạt độ
enzyme hoàn toàn. Nhưng ở điều kiện chân không nếu sấy khô ở nhiệt độ thấp hoặc dùng phương
pháp đông khô (lyophilization) thì có thể duy trì được hoạt động bình thường của chúng.
II.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ENZYME:
1.Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu E.
2.Các phương pháp xác định hoạt độ E:
-Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong enzyme học,người
ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định
gián tiếp thông qua xác định độ hoạt động (còn gọi là hoạt độ) của
enzyme. Trong phán ứng có enzyme xúc tác, sự hoạt động của
enzyme được biểu hiện bằng cách làm thay đổi các tính chất vật lý,
hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng. Theo dõi
những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của
enzyme thông qua xác định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm
được tạo thành trong phản ứng.
-Để xác định hoạt độ của enzyme ở các dịch chiết hoặc ở chế
phẩm người ta thường dùng các phương pháp vật lý hoặc hóa học.
Các phương pháp, so màu, đo khí, đo độ phân cực, đo độ nhớt,
chuẩn độ... được dùng phổ biến trong nghiên cứu định lượng các phản ứng enzyme.
II.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ENZYME:
1.Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu E.
2.Các phương pháp xác định hoạt độ E:
a/Các đơn vị đo hoạt động xúc tác của E.
-Hội nghị quốc tế về hóa sinh enzyme đã đưa ra khái niệm đơn vị
enzyme quốc tế (hoặc đơn vị enzyme tiêu chuẩn) vào năm 1961,sử
dụng các đơn vị sau:
-Đơn vị hoạt độ enzyme IU (International Unit) là lượng enzyme có
khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 micromole (1µmol) cơ chất sau
một phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 IU = 1µmol cơ chất (10^-6 mol)/ phút.
-Từ năm 1972 người ta lại đưa thêm khái niệm Katal (Kat)
Katal (Kat) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa
1 mol cơ chất trong một giây ở các điều kiện phân tích(đơn vị kcat
ít được dùng).
1kat=1mol/giây
Như vậy1kat=6.10^7 IU
II.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ENZYME:
1.Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu E.
2.Các phương pháp xác định hoạt độ E:
a/Các đơn vị đo hoạt động xúc tác của E.
b/Hoạt độ riêng(specific activity):
-Đối với chế phẩm enzyme, ngoài việc xác định mức độ hoạt động
còn cần phải đánh giá độ sạch của nó. Đại lượng đặc trưng cho độ
sạch của chế phẩm enzyme là hoạt độ riêng.
-Hoạt độ riêng là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá độ
sạch của chế phẩm E.
-Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị
enzyme/ 1mg protein (IU/mg) cũng có thể 1g chế phẩm hoặc 1 ml
dung dịch.Trong quá trình tinh sạch E,sau mỗi bước tinh sạch,các
prôtêin không không phải là E quan tâm bị loại đi,nên lượng
prôtêin tổng số bị giảm dần,nếu hoạt độ tổng số của Ekhông thay
đổi nhiều ,hoạt độ riêng sẽ tăng lên,chế phẩm có độ sạch cao hơn.
-Cùng với quá trình tinh sạch,khi hoạt độ riêng không tăng lên nữa ,tức là chế phẩm có độ tinh khiết
rất cao nếu có lẫn các prôtêin khác cũng là lượng rất nhỏ,không đáng kể.

II.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ENZYME:
1.Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu E.
2.Các phương pháp xác định hoạt độ E:
a/Các đơn vị đo hoạt động xúc tác của E.
b/Hoạt độ riêng(specific activity):
c/Các phương pháp xác định hoạt độ E:
-Để phân tích hoạt độ E có thể tiến hành bằng một trong hai cách
là phân tích liên tục và phân tích gián đoạn.
•Phân tích liên tục:là phương pháp đo cơ chất bị biến đổi hay sản
phẩm tạo thành một cách liên tục theo thời gian,ví dụ như cách đo
hoạt độ của NADH oxidase(NOX)qua phản ứng:
NADH+ H+ +O2→NAD+ +H2O2 (do enzyme NOX sinh H2O2 xúc tác)
2NADH + 2H+ +O2 →2NAD+ +2H2O (do enzyme NOX sinh H2O xúc tác).
•Phân tích gián đoạn:là phương pháp cho E tác dụng với cơ
chất sau một khoảng thời gian nhất định thì ngừng phản ứng
E và cách thích hợp và sau đó đo lượng cơ chất còn lại hoặc
sản phẩm tạo thành.Đây là cách được sử dụng phổ biến nhất trong các phân tích hoạt độ E hiện nay.
-Để làm ngừng phản ứng E có thể dùng các tác nhân làm bất hoạt E như nhiệt độ cao,thay đổi
pH(bổ sung axit hoặc kiềm),dùng chất tạo phức hay tách E ra khỏi hỗn hợp phản ứng…
-Dựa trên nguyên tắc xác định hoạt độ E ,bằng cách đo liên tục hay gián đoạn,hoạt độ E có thể được
xác định theo một hay một số phương pháp chính sau đây:






II.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ENZYME:
1.Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu E.
2.Các phương pháp xác định hoạt độ E:
a/Các đơn vị đo hoạt động xúc tác của E.
b/Hoạt độ riêng(specific activity):
c/Các phương pháp xác định hoạt độ E:
+Phương pháp đo độ nhớt.
+Phương pháp phân cực kế.
+Phương pháp đo áp suất hay áp kế.
+Phương pháp quang phổ kế
+Phương pháp chuẩn độ.
+Phương pháp sắc kí.
+Phương pháp hóa học.
+Phương pháp phóng xạ.
+Phương pháp huỳnh quang.
II.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ENZYME:
1.Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu E.
2.Các phương pháp xác định hoạt độ E:
a/Các đơn vị đo hoạt động xúc tác của E.
b/Hoạt độ riêng(specific activity):
c/Các phương pháp xác định hoạt độ E:
d/Một số lưu ý khi xác định hoạt độ hay thực hiện phản ứng E:
-Khi xác định hoạt định E cần chọn điều kiện pH và nhiệt độ phân
tích ở vùng thích hợp.
-Bên cạnh pH và nhiệt độ,cũng cần lưu ý đến cơ chất,thành phần
đệm,lực ion hay nồng độ muối ,các chất làm bền.
-Các phân tích hoạt độ E phải thực hiện ở một giá trị pH ổn định.
-Trong phân tích hoạt độ E,cơ chất và sản phẩm ,đều phải đạt cùng
nhiệt độ phân tích khi tiếp xúc với nhau để bắt đầu phản ứng.
-Phải luôn luôn có mẫu kiểm tra thích hợp để tránh sai số.
-Phải lựa chọn phương pháp làm ngừng phản ứng thích hợp.

III.CẤU TRÚC PHÂN TỬ
ENZYME:
-Enzyme có khả năng và hiệu lực xúc tác rất lớn, có tính đặc hiệu rất cao. Để đảm bảo cho
chức năng của enzyme là chất xúc tác sinh học, cấu trúc của enzyme phải rất tinh vi và phức tạp.
1.Bản chất hóa học của E:
-Từ gần một thế kỷ trước đây, các nhà khoa học đã đổ xô vào việc xác định bản chất hóa học của
enzyme. Cho đến nay, có thể nói rằng,ngoài nhóm nhỏ phân tử RNA có hoạt tính xúc tác, tuyệt đại đa
số enzyme có bản chất là protein và sự thể hiện hoạt tính xúc tác phụ thuộc vào cấu trúc bậc 1, 2, 3
và 4 của phân tử protein và trạng thái tự nhiên của chúng.Thực tế là bản chất hóa học của enzyme
chỉ được xác định đúng đắn từ sau khi kết tinh được enzyme. enzyme đầu tiên nhận được ở dạng
tinh thểlà urease của đậu tương (Sumner, 1926), tiếp theo là pepsin và trypsin (Northrop và
Kunitz, 1930, 1931). Sau đó những tác giả khác cũng đã kết tinh được một số enzyme khác và có đủ
bằng chứng xác nhận các tinh thể protein nhận được chính là các enzyme.
-Kết quả nghiên cứu tính chất hóa lý của enzyme đã cho thấy enzymecó tất cả các thuộc tính hóa
học của các chất protein về hình dạng phân tử:đa số enzyme có dạng hình cầu (dạng hạt). Tỷ lệ
giữa trục dài và trục ngắn của phân tử vào khoảng 1 - 2 hoặc 4 - 6.
-Về khối lượng phân tử: các enzyme có
khối lượng phân tử lớn, thay đổi rất rộng từ
12000 dalton đến 1.000.000 dalton
hoặc lớn hơn.
Ví dụ ribonuclease có khối lượng
phân tử là 12700,
glutamatdehydrogenase có khối
lượng phân tử là 1.000.000. Đa
số enzyme có khối lượng phân tử từ 20.000 đến 90.000 hoặc vài trăm nghìn.
III.CẤU TRÚC PHÂN TỬ
ENZYME:
1.Bản chất hóa học của E:
-Do kích thước phân tử lớn,các enzyme không đi qua được màng bán thấm.Enzyme tan trong nước,
khi tan tạo thành dung dịch keo;chúng cũng tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi
hữu cơ có cực khác. Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ cao.
Enzyme bị biến tính thì mất khả năng xúc tác. Mức độ giảm hoạt tính của enzyme tương ứng với
mức độ biến tính của protein trong chế phẩm. Kiềm, acid mạnh, kim loại nặng cũng làm cho enzyme
biến tính. Cũng như protein, enzyme cũng có tính chất lưỡng tính.
III.CẤU TRÚC PHÂN TỬ
ENZYME:
1.Bản chất hóa học của E:
2/Thành phần cấu tạo của E:
-Các E là những prôtein được cấu tạo từ 20 L-α amino acid(nói đúng hơn là từ 19 amino acid(a.a)và
imino acid prolin).
-Cũng như protein, enzyme có thể là protein đơn giản hoặc protein phức tạp. Trên cơ sở đó, người
ta thường phân enzyme thành hai nhóm:enzyme một thành phần (enzyme một cấu tử) và enzyme hai
thành phần(enzyme hai cấu tử). Trường hợp enzyme là một protein đơn giản gọi là enzyme một thành
phần. Trường hợp enzyme là một protein phức tạp nghĩa là ngoài protein đơn giản còn có một nhóm
ngoại nào đó không phải protein gọi là enzyme hai thành phần hay holoenzyme(holoE).Phân tử holoE
gồm 2 phần:phần protein gọi là apoenzyme (ApoE) ,phần không phải protein gọi là coenzyme (CoE).
-Coenzyme là phần không phải protein của enzyme trong trường hợp khi nó dễ tách khỏi phần
apoenzyme khi cho thẩm tích qua màng bán thấm và có thể tồn tại độc lập.Phần không phải protein
của enzyme được gọi là nhóm ngoại hay nhóm prosthetic, khi nó liên kết chặt chẽ với
phần protein của enzyme bằng liên kết cộng hóa trị. 
-Một phức hợp hoàn chỉnh gồm cả apoenzyme và coenzyme được gọi là
holoenzyme. Một coenzyme khi kết hợp với các apoenzyme tạo thành
các holoenzyme khác nhau xúc tác cho quá trình chuyển hóa các chất
khác nhau nhưng giống nhau về
kiểu phản ứng.
III.CẤU TRÚC PHÂN TỬ
ENZYME:
1.Bản chất hóa học của E:
2/Thành phần cấu tạo của E:
-Coenzyme trực tiếp tham gia phản ứng xúc tác, giữ vai trò quyết định kiểu phản ứng mà enzyme
xúc tác và làm tăng độ bền của apoenzyme đối với các yếu tố gây biến tính. Còn apoenzyme có tác
dụng nâng cao hoạt tính xúc tác của coenzyme và quyết định tính đặc hiệu của enzyme. Các
coenzyme thường là các dẫn xuất của các vitamin hòa tan trong nước. Cần chú ý là sự phân biệt
coenzyme và nhóm ngoại chỉ là tương đối, vì khó có thể có một tiêu chuẩn thật rành mạch để phân
biệt “liên kết chặt chẽ” và“liên kết không chặt chẽ”, nhất là trong những năm gần đây, người ta đã
chứng minh rằng, nhiều coenzyme cũng kết hợp vào apoenzyme của chúng bằng liên kết cộng hóa
trị. Do đó, ngày nay người ta ít chú ý đến sự phân biệt coenzyme và nhóm ngoại. Ngoài ra, trong
thành phần cấu tạo,rất nhiều enzyme có chứa kim loại. Thuộc loại enzyme hai thành phần gồm có
hầu hết các enzyme của các lớp 1, 2, 4, 5, 6. Các enzyme thủy phân (lớp 3) thường là enzyme một
thành phần có chứa ion kim loại hoặc đòi hỏi ion kim loại làm cofactor (đồng yếu tố).
III.CẤU TRÚC PHÂN TỬ
ENZYME:
1.Bản chất hóa học của E:
2.Thành phần cấu tạo của E:
3.Các bậc cấu trúc của phân tử E:
-E là protein hình hạt,vì vậy cũng có các bậc cấu trúc như protein:bậc I,II,III và IV.
a/Cấu trúc bậc I:
-Là trình tự sắp xếp các a.a trong phân tử, được giữ vững nhờ liên kết peptid (liên kết cộng hóa trị),
là cấu trúc cơ sở có vai trò quan trọng xác định cách thức cuộn và cấu trúc không gian của phân tử E.
Khi thay một hay một vài a.a trong phân tử có thể làm thay đổi hoạt tính xúc tác của E. Cấu trúc bậc I
của E có thể bị biến đổi trong quá trình tiến hóa, tuy nhiên các gốc a.a có vai trò xúc tác trong trung
tâm hoạt động của E không bị biến đổi.
b/Cấu trúc bậc II:
-Là cấu trúc không gian cục bộ (từng phần của chuỗi polypeptid),phổ biến nhất là cấu trúc xoắn α
(α-helix),phiến gấp nếp β .Ngoài ra còn có kiểu khác như quay β (β-turn),...Cấu trúc bậc II được giữ
vững chủ yếu nhờ liên kết hydrogen.
Hình 1 : Ví dụ cấu trúc xoắn alpha. A:
mô hình giản lược, B: mô hình phân tử, C: nhìn từ đỉnh, D: mô hình không gian
III.CẤU TRÚC PHÂN TỬ
ENZYME:
1.Bản chất hóa học của E:
2.Thành phần cấu tạo của E:
3.Các bậc cấu trúc của phân tử E:
a/Cấu trúc bậc I:
b/Cấu trúc bậc II:
c/Cấu trúc bậc III:
-Là dạng cuộn lại trong không gian của toàn chuỗi polypeptide,tạo thành hình dạng chung của một
chuỗi polypeptide.Đặc tính cấu trúc cũng như độ bền của cấu trúc bậc III chủ yếu nhờ các tương tác
yếu :liên kết hidrogen, tương tác ion giữa các nhóm tích điện trái dấu ,tương tác Van der Waals,
tương tác kỵ nước giữa các nhóm không phân cực…
Hình 2: Ví vụ một của cấu trúc nếp gấp beta (các mũi tên chỉ hướng chuỗi axit amin)
Cấu trúc bậc III của E
III.CẤU TRÚC PHÂN TỬ
ENZYME:
1.Bản chất hóa học của E:
2.Thành phần cấu tạo của E:
3.Các bậc cấu trúc của phân tử E:
a/Cấu trúc bậc I:
b/Cấu trúc bậc II:
c/Cấu trúc bậc III:
d/Cấu trúc bậc IV:
-Trong nhiều trường hợp, các chuỗi polypeptide có cấu trúc bậc ba có thể kết hợp với nhau tạo
thành phân tử enzyme có cấu trúc bậc bốn. Như vậy cấu trúc bậc bốn là cách sắp xếp đặc trưng trong
không gian của các chuỗi polypeptide riêng biệt trong phân tử enzyme. Đến nay người ta đã xác định
rằng số lớn các enzyme trong tế bào đều có cấu trúc bậc bốn. Các enzyme có cấu trúc bậc bốn là
enzyme olygomer và polymer do nhiều đơn vị nhỏ cấu tạo nên, mỗi đơn vị nhỏ là do một
chuỗi polypeptide. Các đơn vị nhỏ trong một phân tử enzyme có thể giống nhau,
nhưng cũng có thểkhác nhau về cấu tạo và chức năng, hoặc cũng có thể một số
giốngnhau, một số khác nhau. Những enzyme do nhiều đơn vị nhỏ cấu tạo nên còn
được gọi là các enzyme polymer và các đơn vị nhỏ được gọi là protomer (các đơn vị
nhỏ còn được gọi là các mảnh hoặc tiểu phần dưới đơn vị)
III.CẤU TRÚC PHÂN TỬ
ENZYME:
1.Bản chất hóa học của E:
2.Thành phần cấu tạo của E:
3.Các bậc cấu trúc của phân tử E:
4.Hệ thống nhiều E:
-Bao gồm các E xúc tác cho dãy phản ứng có trật tự của một quá trình trao đổi chất xác định,sản
phẩm của phản ứng trước là cơ chất của E xúc cho phản ứng kế tiếp . .Có thể biểu diễn hệ thống
gồm 4 E(Ea, Eb, Ec, Ed) như sau:
-Hệ thống nhiều E cũng có thể gắn vào thành phần cấu tạo của tế bào và chỉ có thể tách ra khi dung
giải màng. VD: các E của chuỗi hô hấp xúc tác cho quá trình chuyển điện tử từ cơ chất đến oxy, gắn
chặt vào màng trong ti thể.
III.CẤU TRÚC PHÂN TỬ
ENZYME:
1.Bản chất hóa học của E:
2.Thành phần cấu tạo của E:
3.Các bậc cấu trúc của phân tử E:
4.Hệ thống nhiều E:
5.Trung tâm hoạt động của E:
a/Đặc điểm chung:
-Mặc dù toàn bộ phân tử E có vai trò quan trọng đối với hoạt tính xúc tác
của E,tuy nhiên có một phần nhỏ của phân tử E kết hợp với cơ chất,tham
gia trực tiếp trong việc tạo thành, hoặc cắt đứt các liên kết của phân tử cơ
chất bị chuyển hóa, tạo thành sản phẩm phản ứng,gọi là trung tâm hoạt
động(TTHĐ) của E.
-Toàn bộ cấu trúc không gian của phân tử enzyme có vai
trò quan trọng đối với hoạt tính xúc tác của enzyme.
Tuy nhiên, hoạt động của enzyme liên hệ trực tiếp với
một phần xác định trong phân tử enzyme.Trung tâm
hoạt động của enzyme là phần của phân tử enzyme trực 
tiếp kết hợp với cơ chất, tham gia trực tiếp trong việc tạo
thành và chuyển hóa phức chất trung gian giữa enzyme
và cơ chất để tạo thành sản phẩm phản ứng. Trung tâm
hoạt động bao gồm nhiều nhóm chức năng khác nhau của
amino acid, phân tử nước liên kết và nhiều khi có cả cofactor hữu cơ (coenzyme)
và vô cơ.
.
III.CẤU TRÚC PHÂN TỬ
ENZYME:
1.Bản chất hóa học của E:
2.Thành phần cấu tạo của E:
3.Các bậc cấu trúc của phân tử E:
4.Hệ thống nhiều E:
5.Trung tâm hoạt động của E:
a/Đặc điểm chung:
-Ở các enzyme một thành phần, trung tâm hoạt động thường bao gồm một tổ
hợp các nhóm chức năng của amino acid không tham gia tạo thành trục
chính của sợi polypeptide. Ví dụ nhóm - SH của cysteine - OH của serine,
threonine và tyrosine,ε - NH2 của lysine, -COOH của glutamicacid, aspartic,
vòng imidazol của histidine, indol của tryptophan, nhóm guanidin của
arginine.
-Các nhóm này có thể ở xa nhau trong mạch polypeptide nhưng lại gần
nhau trong không gian, được định hướng xác định trong
không gian cách nhau những khoảng cách nhất định sao
cho chúng có thể tương tác với nhau trong quá trình xúc tác.
-Ví dụ: trung tâm hoạt động của α - chymotrypsin bao
gồm nhóm hydroxyl của Ser - 195, imidazol của His - 57
và nhóm carboxyl của Asp -102. Các gốc này ở khá xa
nhau trong chuỗi polypetide nhưng giữa các nhóm chức năng của chúng chỉ cách nhau từ 2,8 - 3,0 Å.
-Trung tâm hoạt động của các enzyme hai thành phần thường bao gồm nhóm ngoại (vitamin, ion kim
loại ...) và các nhóm chức năng của các amino acid ở phần apoenzyme.
Sự tương ứng về cấu hình không gian giữa trung tâm hoạt động và
cơ chất được hình thành trong quá trình enzyme tiếp xúc với cơ chất.
III.CẤU TRÚC PHÂN TỬ
ENZYME:
1.Bản chất hóa học của E:
2.Thành phần cấu tạo của E:
3.Các bậc cấu trúc của phân tử E:
4.Hệ thống nhiều E:
5.Trung tâm hoạt động của E:
a/Đặc điểm chung:
-Các kim loại thường gặp trong trung tâm hoạt động của E là:Fe,Co ,Mn, Zn, Cu,…Các kim loại này
có thể kết hợp trực tiếp với các a.a,hoặc ở trong thành phần của CoE.Ngoài vai trò xúc tác ,một số
kim loại ,đặc biệt là Ca thường có vai trò làm bền cấu trúc không gian phân tử E.Vì vậy khi sử dụng
các E trong thực tế ,cần lưu ý bổ sung Ca vào môi trường, đặc biệt là khi tiến hành ở nhiệt độ cao.
-Theo quan niệm của Fisher thì trung tâm hoạt động của enzyme đã được hình thành sẵn với một
cấu tạo nhất định chỉ cho phép cơ chất có cấu tạo tương ứng kết hợp vào. Do đó có thể ví sự tương
ứng đó như “ổ khóa với chìa khóa”
-Thuyết này tuy cũng giải thích được một số hiện tượng nhưng không giải thích thỏa đáng được
nhiều kết quả thu được trong thực nghiệm. Vì vậy, Koshland đã đưa ra một giả thuyết khác hấp dẫn
và tế nhị hơn. Theo thuyết này thì đặc điểm của vùng trung tâm hoạt động là rất mềm dẻo và linh
hoạt, các nhóm chức năng của trung tâm hoạt động của enzyme tự do chưa ở tư thế sẵn sàng hoạt
động, khi tiếp xúc với cơ chất, các nhóm chức năng ở trong phần trung tâm hoạt động của phân tử
enzyme thay đổi vị trí trong không gian, tạo thành hình thể khớp với hình thể của cơ chất). Cũng vì
vậy, người ta gọi mô hình này là mô hình “tiếp xúc cảm ứng” hoặc “khớp cảm ứng”.








a b
Mô hình Fisher (a) và mô hình Koshland (b)

Thuyết “ lock and key” của Fisher:
Thuyết “tương ứng cảm ứng” của Kosland
III.CẤU TRÚC PHÂN TỬ
ENZYME:
1.Bản chất hóa học của E:
2.Thành phần cấu tạo của E:
3.Các bậc cấu trúc của phân tử E:
4.Hệ thống nhiều E:
5.Trung tâm hoạt động của E:
a/Đặc điểm chung:
-E allosteric(E dị lập thể hoặc E điều hòa) :Trong phân tử các E này , ngoài TTHĐ còn có một hay
một số vị trí khác ,gọi là trung tâm allosteric (trung tâm dị lập thể hay trung tâm điều hòa).Các chất kết
hợp vào các trung tâm này (nhưng không bị chuyển hóa ) gọi là chất điều hòa allosteric. Khi các chất
này kết hợp với E cũng làm thay đổi cấu hình không gian của phân tử E , của TTHĐ, do đó làm thay
đổi hoạt độ xúc tác của E.Nếu làm tăng hoạt độ ,gọi là chất điều hòa dương ;nếu làm giảm hoạt độ
,gọi là chất điều hòa âm.Cơ