Chuyên đề: Cơ chế can thiệp RNA ( RNA interference- RMAi)

Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên
Khoa : Nông Hoc

Báo Cáo Chuyên Đề :
“ Quá trình can thiệp RNA ”
( RNAi – RNA interference )
Báo Cáo Chuyên Đề
Nhóm sv thực hiện : . Nguyễn Thị Hoà
. Đỗ Mạnh Cường
. Phùng Thị Ánh

Lớp : 39 CNSH



Thái Nguyên : 20/10/2009
Tổng Quan Chuyên Đề
A. Đặt vấn đề
B. Nội Dung
Một số thuật ngữ :
I . Giới thiệu về RNAi
1. Dòng thông tin di truyền trong tế bào
2. Khái niệm và vai trò của RNAi trong tế bào
2.1 Khái niệm
2.2 Vai trò
3. Lịch sử nghiên cứu
II. Khám phá cơ chế RNAi và giải thưởng Nobel y học 2006
1. Quá trình nghiên cứu khám phá ra sự can thiệp RNA của Z.Fire và C.Mello
1.1 Thí nghiệm nghiên cứu
1.2 Những suy luận từ kết quả thí nghiệm :
2. Ý nghĩa của công trình nghiên cứu
Tổng Quan Chuyên Đề
III. Bộ máy can thiệp RNAi
1. các thành phần tham gia vào quá trinh can thiệp RNAi
1.1 siRNA :
1.2 miRNA :
2. Con đường hình thành các bộ máy can thiệp RNAi
2.1. Con đường hình thành siRNA :
2.2. Con đường hình thành miRNA :
3.Sự khác nhau giữa siRNA và miRNA
IV. Cơ chế can thiệp RNA
1. Cơ chế chung
2. Cơ chế phân tử
2.1 Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA
2.2 Cơ chế làm tắt gene bởi miRNA
V. Những thành tựu và triển vọng của việc nghiên cứu ứng dụng RNAi
1. Những thành tưu khoa học ứng dụng RNAi
2. Triển vọng của việc nghiên cứu ứng dụng RNAi
C. Kết Luận :
Đặt vấn đề
Như chúng ta đã biết, trong tế bào có nhiều loại RNA khác nhau, mỗi loại đảm nhận một chức năng sinh hoc riêng biệt

Một số chức năng quan trọng của RNA:
Chức năng vận chuyển thông tin di truyền
Chức năng tham gia tổng hợp và vận chuyển Protein
Chức năng hoàn thiện các phân tử RNA
Ngoài ra RNA còn có các chức năng quan trọng khác
Đặc biệt gần đây các nhà sinh học phân tử đã phát hiện ra chức năng điều hoà biểu hiện gene của RNA

Kể từ khi khám phá ra RNAi thì việc nghiên cứu cơ chế và ứng dụng của nó ngày càng trở thành một vấn đề lý thú thu hút sự quan tâm của các nhà sinh học góp phần tạo nên cơn sốt “ Thế giới RNA – RNA word ) .
Một số thuật ngữ :
RNAi : RNA inteference ( RNA can thiệp )
dsDNA : double strand DNA ( DNA mạch kép dài)
miRNA : micro RNA ( tiểu RNA )
RISC : RNA – incluced silencing complex ( phức hệ tắt gene tích ứng bởi RNA)
Dicer : RNase III ( Một loại enzyme endonuclease )
siRNA : small interfeing RNA ( RNA can thiệp kích thước nhỏ )
I . Giới thiệu về RNAi
1.Dòng thông tin di truyền trong tế bào :
Dòng thông tin di truyền trong tế bào
Thông tin di truyền lưu trữ trong DNA được sao chép sang RNA và sau đó được dùng để tổng hợp protein

Tuy nhiên không phải mọi thông tin di truyền đều được sử dụng mà chỉ có một phần thông tin di truyền trong hệ gene được sử dụng trong mỗi loại tế bào.

Việc gene nào được biểu hiện là do cơ chế kiểm soát của bộ máy sao chép DNA sang mRNA trong quá trinh phiên mã

Quá trình phiên mã cũng bị điều khiển bởi nhiều nhân tố khác và được con người nghiên cứu, tìm hiểu ngày càng rõ.
2. Khái niệm RNAi
“ RNA can thiệp ” ( RNAi ) là một hệ thống bên trong các tế bào sống , giúp kiểm soát được các gene đang hoạt động. Đó là những đoạn RNA ngắn có thể ức chế sự biểu hiện của các gene có trình tự tương đồng với nó.
Các phân tử RNAi này có thể gây lên các hiêu ứng:
Ức chế dịch mã đơn vị mRNA
Ức chế sự phiên mã của gene ở trong nhân
Phân giải mRNA
Vai trò RNAi
RNAi có rất nhiều chức năng quan trọng trong tế bào :

Bảo vệ tế bào chống lại gene ký sinh trùng, virut và các yếu tố di truyền vận động ( Transposon)

Điều hoà biểu hiện gene


Điều khiển sự phát triển của tổ chức

Giữ gìn NST và tăng cường phiên mã

Có thể RNAi còn có nhiều chức năng khác mà con người chua khám phá ra hết, và sẽ được khám phá dần dần trong tương lai
3. Lịch sử nghiên cứu
Trong lịch sử , sự can thiệp RNA được biết đến với những tên gọi khác như : RNA silening , quelling, cosuppresion, RNA inteference . . . .

Năm 1984, Pesthea và các cộng sự đã nghiên cứu kỹ thuật Antiense-RNA trên vi khuẩn Escherichia Coli

Đến những năm dầu thâp niên 1990 một số nhà khoa học công bố kết qua nghiên cứu trên các tạp chi quốc tế ( Napoli và cộng sự , Vander và cộng sự ).

Năm 1994 Cogoni và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm tăng màu cam của nấm Neurospora crassa

Năm 1995 trên tạp chí Cell số 81, nhóm nghiên cứu của Guo và Kemphues đã đưa ra bằng chứng đầu tiên trên tuyến trùng Caenorhabditis elegans rằng : Phân tử RNA chiều thuận ( sense RNA ) cũng gây ra sự ức chế gene.
3. Lịch sử nghiên cứu
Đến năm 1998, nhóm nghiên cứu Fire đã giải thích được điều nghịch lý này băng những thí nghiệm trên tuyến trùng C. elegans.

Năm 2000, trên tạp chí Nature cũng công bố việc phát hiện hiện tượng RNAi trên loài ruồi dấm ProSophila do nhóm nghiên cứu của Richard Cathew tiến hành

Năm 2001, lần đầu tiên RNAi được mô tả trong các tế bào động vật có vú ( Tuschl và cộng sự )

Năm 2006 giải thưởng Nobel sinh lý và y học cho phát hiện cơ chế RNAi của 2 nhà bác học Mỹ là Andrew Fire (ĐH Stanford) và Craig Mello (ĐH Massachusetts).
2 nhà bác học Mỹ đạt giải thưởng Nobel Năm 2006
Andrew Z.Fire ( ĐH Stanford)
Craig C.Mello ( ĐH Massachusetts)
Quá trình nghiên cứu khám phá ra sự
can thiệp RNA của Z.Fire và C.Mello
Andrew Fire và Craig Mello đã tiến hành nghiên cứu về cơ chế điều khiển biểu hiện gien ở giun tròn Caenorhabditis elegans(C.elegans.).

Hai ông đã thực hiện hàng loạt các thí ngiệm ngoạn mục nhằm kiểm tra kiểu hình ảnh hưởng của việc tiêm RNA vào bộ phận sinh dục của C.elegans.
Thí nghiệm nghiên cứu
Thí nghiệm nghiên cứu
Tiêm các phân tử mRNA mã hoá một protein cơ bắp ( sợi “ có nghĩa “ ) => không làm thay đổi hành vi của giun tròn.

Khi tiêm RNA “vô nghĩa” ( antisence RNA) cũng không tháy hiện tượng gì .



Thí nghiệm nghiên cứu
Tuy nhiên, khi Fire và Mello tiêm cả RNA “sence" và “antisence" vào cơ thể giun tròn, thấy giun có những chuyển động lạ, cụ thể là co giật.

Các chuyển động tương tự cũng xảy ra ở những con giun hoàn toàn thiếu một gien chịu trách nhiêm tạo protein cơ bắp .


Những suy luận từ kết quả thí nghiệm
RNA chuỗi đôi có thể làm các gien ngừng hoạt động (bất hoạt gen )

Cơ chế can thiệp RNA này mang tính đặc trưng đối với gien mang mã di truyền giống với mã di truyền của phân tử RNA được tiêm vào.

Ngoài ra, cơ chế can thiệp RNA có thể lan giữa các tế bào và thậm chí được di truyền sang đời sau. Chỉ cần tiêm một lượng nhỏ phân tử RNAi cũng có thể đạt được kết quả mong muấn. Do vậy, có thể coi cơ chế can thiệp RNAi là một quá trình xúc tác.
Ý nghĩa khoa học của công trình nghiên cứu
Công trình nghiên cứu này của hai nhà bac hoc Z.Fire và C.Mello đã được công bố trên tạp chí Nature vào ngày 19/2/1998 .

Kết quả của nghiên cứu này vô cùng quan trọng :

Cung cấp lời giải thích cho các hiện tượng nghiên cứu ở thuạc vật.: Phiên mã bổ nhiệm gen im lặng ( PTGS- post transcriptional gene silening ) => làm sáng tỏ nhiều quan sát thí nghiệm mâu thuẫn và khó hiểu trong nhiều năm trước đây.
Ý nghĩa khoa học của công trình nghiên cứu
Đồng thời nó tiết lộ một cơ chế tự nhiên để kiểm soát dòng thông tin di truyền trong tế bào

RNAi được sử dụng trong khoa học cơ bản nghiên cứu chức năng của gene.

Ý nghĩa của công trình nghiên cứu
Với nghiên cứu mới này , giới khoa học cũng đang tìm ra các ứng dụng của RNAi trong những nghiên cứu y học chữa bệnh băng liệu pháp gene, các ứng dụng trên cây trồng, vật nuôi trong nông nghiệp nhằm tạo ra các sản phẩm với chất lượng tốt hơn.

Từ kết quả của nghiên cứu này đã mở ra nhiều hướng nghiên cứu và được tạp chí Science bình chọn là “ Break Through in 1998 “(Bước đột phá của năm 1998 ) dựa theo số lượng ra tăng cấp số nhân các bài báo khoa học đăng trên các tạp chí khoa học quốc tế hàng đầu.
Các thành phần tham gia vào quá trinh can thiệp RNAi

Quá trình can thiệp RNAi được thực hiện bởi 2 cơ chế :
+ siRNA
+ miRNA
1. siRNA : các thành phần tham gia :

dsRNA ( double strand RNA – RNA sợi đôi ) : là những đoạn RNA dài mạch kép có trình tự bổ xung với gene đích ( target RNA ) có 2 đầu thò là 3’OH

Dicer : là một loại enzyme endonuclease ( Ribonuclease III ) chịu trách nhiệm hoàn thiện sợi dsRNA.

Phức hệ RISC (RNA – incluced silencing complex ) : Phức hệ gắng gene kích ứng bởi RNA. Phức hệ này có chứa enzyme helicase và một số protein trong đó quan trọng nhất là protein thuộc họ Agronaut ( liên kết RNA ) hoạt động như một endonuclea và cắt mRNA .

siRNA (small interfeing RNA ) : là RNA can thiệp kích thước nhỏ được tạo ra từ dsRNA
2. miRNA
Là những đoạn RNA ngắn khoảng từ 19 – 24 nu, không tham gia vào quá trình tổng hợp protein. Bộ máy miRNA bao gồm :

Pri- mRNA ( primary-mRNA ) : chuỗi mRNA nguyên thuỷ , dài hàng nghìn nu và mang đầu 5’CAP, đuôi poly A. Pri- mRNA chữa ít nhất một hay nhiều vòng kẹp tóc ( hairpin ) mỗi vòng dài khoảng 70 nu.

Phức hệ RISC (RNA – incluced silencing complex ): Phức hệ gắng gene kích ứng bởi RNA. Phức hệ này có chứa enzyme helicase và một số protein trong đó quan trọng nhất là protein thuộc họ Agronaut ( liên kết RNA ) hoạt động như một endonuclea và cắt mRNA .

Hai enzyme cắt : + Drosha : ở trong nhân tế bào
+ Dicer : ở ngoài tế bào chất
2. Con đường hình thành bộ máy can thiệp RNAi
2.1 Con đường hình thành siRNA :

Quá trình hình thành siRNA diễn ra ở tế bào chất (cytoplasma )

Các đoạn dsRNA sợi kép được cắt bởi enzyme Dicer tạo ra những đoạn RNA ngắn ( siRNA )

Sau đó các siRNA được tháo xoắn dưới táuc dụng của enzyme helicase và biến tính thành 2 mạch đơn khi gắng với phức hệ RISC.


2. Con đường hình thành các bộ máy can thiệp RNAi

+ trong 2 mạch đơn này, chỉ mạch nào có đầu 5’ có hoạt lực với Agronauttrong phức hệ RISC mới gằn được với phức hệ RISC => tạo phức hợp siRNA-RISC

+ Mạch còn lại đầu 5’ không có hoạt lực với Agronaut => không liên kết với RISC được .

Sự xuất hiện của mạch đơn siRNA sẽ hoạt hoá RISC thành trạng thái hoạt động (RISC* )
2.2 Con đường hình thành miRNA

Quá trình hình thành miRNA diễn ra ở nhân tế bào (nuclear ) và trong tế bào chất ( cytoplasma)

*Trong nhân :
Các phân tử miRNA được tạo ra thông qua quá trình phiên mã từ các gen gọi là các phân tử miRNA nguyên thuỷ ( pri- miRNA ), các phân tử này có chúa các cấu trúc kẹp tóc ( hairpin )

Con đường hình thành miRNA

Các phân tử pri- miRNA được cắt bởi enzyme Drosha để tạo thành những sợi Pre- miRNA ( phân tử tiền microRNA ) => gọi là quá trình chế biến pri- miRNA

Các phân tử Pre- miRNA sẽ được di chuyển ra ngoài tế bào chất .

2.2 Con đường hình thành miRNA
* Tại Tế bào chất :
Pre- miRNA sau khi được di chuyển ra ngoài tế bào chất => sẽ được enzyme Dicer cắt thành những đoạn RNA nhỏ ( khoảng 19 – 21 nu )

Các đoạn miRNA được tách đôi => tạo ra các sợi miRNA đơn. Trong đó sợi có dầu 5’ có hoạt lực vói Agronaut trong phức hợp RISC => sẽ kết hợp với phức hợp RISC tạo thành phức hệ miRNA-RISC .
Sự khác nhau giữa siRNA và miRNA
IV. Cơ chế can thiệp RNA
1. Cơ chế chung
Quá trình can thiệp RNA được kích hoạt khi phân tử RNA tồn tại trong tế bào với cấu trúc sợi đôi.

RNA sợi đôi kích hoạt một cơ chế hoá sinh dể phân huỷ các phân tử mRNA có mã di truyền giống với nó.

Khi các phân tử mRNA này biến mất => gene tương ứng bi bất hoạt => không có protein nào do gên đó má hoá được tạo thành.
2. Cơ chế phân tử
2.1 Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA
Trong tế bào, sự biểu hiện hoặc cảm ứng của RNA mạch kép dài là kết quả của sự bắt cặp giữa mạch mang mã ( sợi có nghĩa ) và mạch đối mã ( sợi vô nghĩa )

Các đoạn dsRNA sợi kép dài được cắt bởi enzyme Dicer tạo ra những đoạn RNA ngắn ( siRNA ) khoảng 21-28 nu .
2.1 Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA


Sau đó các siRNA được tháo xoắn dưới táuc dụng của enzyme helicase và một mạch được nạp vào phức hợp protenin một cách chon lọc gọi là phức hợp cảm ứng bất hoạt RISC

Sự xuất hiện của mạch đơn siRNA sẽ hoạt hoá RISC thành trạng thái hoạt động (ký hiệu là RISC* )
Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA
Cuối cùng phức hợp siRNA-RISC* này sẽ tìm kiếm các transcriptome ( sản phẩm của quá trinh phiên mã) một cách đặc hiệu và nhưng RNA mục tiêu tiềm năng .

Sợi đơn siRNA sau khi được nạp vào RISC được gọi là mạch hướng dẫn, nó đóng vai trò chỉ đạo trong việc đưa phức hợp siRNA-RISC* đến các phân tử mRNA có trình tự bổ xung với nó.Việc chỉ đạo của siRNA thông qua một endonuclease có trong RISC là Agronaute protein

Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA
RISC* cũng có thể xâm nhập được vào nhân tế bào và kết cặp với trình tự tương đồng trên phân tử DNA hệ gen.
Lúc này RISC* huy động một số protein làm cải biến chất nhiễm sắc quanh vị trí promoter của gene
=> sự kìm hãm phiên mã.

Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA
Cơ chế tắt gen lúc này phụ thuộc vào mức độ tương đồng giữa siRNA và mRNA đích.

+ Nếu Sự tương đồng giữa siRNA và mRNA đích là hoàn toàn => phân tử mRNA có xu hướng bị cắtvà phân giải ( do hoạt tính nuclease của RISC ) => không có mRNA mã hoá cho protenin đó.

+ Nếu Sự tương đồng giữa siRNA và mRNA chỉ là một phần thì xu hướng xảy ra là sự ức chế dịch mã do khi chung bám trên mRNA => ngăn cản sự dịch chuyển của Ribosome trong quá trình dịch mã => quá trình dịch mã bi ngưng lại => không tạo ra được protein.
Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA
Cơ chế tắt gene bởi siRNA có hiệu quả rất cao, chỉ cần một lượng nhỏ siRNA được đưa vào tế bào cố thể đủ để làm tắt hoàn toàn sự biểu hiện của một gene nào đó ( vốn có rất nhiều bản sao trong cơ thể đa bào).
2.2 Cơ chế làm tắt gene bởi miRNA


Trong tự nhiên, ngoài cơ chế điều oà biểu hiện gene bằng sợi siRNA còn có cơ chế điều hoà biểu hiện của gene bởi một nhóm RNA khác gọi là micro RNA ( miRNA )

Cơ chế hoạt động của miRNA trong quá trình ức chế sự biểu hiện của gene cũng tương tự như ở siRNA.
2.2 Cơ chế làm tắt gene bởi miRNA
Các miRNA có chiều dài khoảng 19-24 nu được tạo từ tác động cắt các đoạn Pre- miRNA có trình tự kẹp tóc (được phiên mã từ các đoạn DNA không mã hoá protein) bởi 2 enzyme là Drosha và Dicer .

Gần 70% các miRNA được phát sinh liên quan đến sự điều tiết trong quá trình phiên mã tạo ra các mRNAvà các RNA không sinh tổng hợp các protein. 30% còn lại được phát sinh độc lập không liên quan đến quá trình nhân lên ( chức năng của 30% miRNA này chua được làm rõ )

2.2 Cơ chế làm tắt gene bởi miRNA

Tương tự với siRNA
+ Các miRNA có thể điều tiết sự phân giải mRNA với sự hiện diên của phức hợp RISC trong trương hợp bổ xung hoàn toàn.( ở thực vật ) ( perfect complementary)

+ Trong trương hợp bổ xung không hoàn toàn ( inperfect complementary ) với vùng 3’ UTR của mRNA =.> ức chế quá trình địch mã

Ước lượng có khoảng 120 gene mã hoá cho miRNA ở giun tròn , ở người có khoảng 250 gene và 50% gene mã hoá protein ở người đang bị kiểm xoát bởi miRNA.
Cơ chế làm tắt gene bởi miRNA

Thông thường các gene miRNA được điều hoà theo kiểu chỉ biểu hiện vào những thời điểm nhất định và ở các mô nhất định trong quá trinh phát triển của cá thể.


Đáng chú ý là 30% các phân tử miRNA ở giun trong có trình tự rất giống ở ruồi giấm và động vật có vú => điều này cho thấy, dường như cơ chế điều hoà biểu hiện gene bởi miRNA đã có nguần gốc từ lâu trong quá trình tiến hoá và vai trò của chúng trong việc “ lập trình” biểu hiện của hệ gene là rất quan trọng đối với giới sinh vật.
Video clip - RNAi
Những thành tưu khoa học ứng dụng RNAi
Tạo Hoa Hồng Xanh:
Hình - Sự hình thành màu hoa hồng ở hoa hồng thường
Tạo Hoa Hồng Xanh:

Hình-cơ chế hình thành màu hoa hồng ở hoa hồng xanh của Florigene
Những thành tưu khoa học ứng dụng RNAi
Ứng dụng cơ chế can thiệp RNA trong nghiên cứu ung thư
Ứng dụng cơ chế can thiệp RNAi trừ sâu bệnh …..
2. Triển vọng của việc nghiên cứu
ứng dụng RNAi
Việc nghiên cứu ứng dụng cơ chế can thiệp RNA có nhiều triển vọng to lớn mà con người có thể không ngờ tới được.Một số hướng nghiên cứu chính.
Can thiệp RNA chống lại sự nhiễm virus
Can thiệp RNA bảo đảm ổn định hệ gen bằng cách chống lại các yếu tố di truyền vận động(transposon):
Can thiệp RNA như cơ chế kiềm chế tổng hợp protein và điều khiển sự phát triển của tổ chức:
Can thiệp RNA như cơ chế giữ gìn nhiễm sắc tử cô đặc và tăng cừơng phiên mã:
Can thiệp RNA cống hiến một công cụ thí nghiệm mới để kiềm chế gene chuyên biệt.
Can thiệp RNA phải là một giải quyết hữu ích trong điều trị bệnh di truyền trong tương lai:
C- Kết Luận:
Như chúng ta thấy, qua trên nửa thế kỷ, những nhà nghiên cứu sinh học phân tử đã thu được những khám phá ngoạn mục.
Sự khám ra tế bào có một cơ chế đặc biệt – cơ chế can thiệp RNA (RNAi – RNA interference), đã vượt quá mong đợi và mở rộng hiểu biết của chúng ta về cơ chế kiểm soát gene trong cơ thể sinh vật.
Việc ngày càng phát hiện ra nhiều chức năng khác nhau của RNA là cơ sở cho quan điểm cho rằng RNA có thể là đại phân tử sinh học xuất hiện đầu tiên trong quá trình tiến hoá chứ không phải là DNA hay protein như nhiều giả thiết trước đây.
Sự phát triển của một tổ chức và chức năng chính xác của mỗi tế bào và mô tùy thuộc vào một cơ chế can thiệp RNA còn nguyên vẹn trong cơ thể
Hơn nữa, sự khám phá ra can thiệp RNA không chỉ cung cấp cho chúng ta một công cụ thí nghiệm mạnh mẽ mới để nghiên cứu chức năng của các gene mà còn nuôi dưỡng những mong đợi của chúng ta về những ứng dụng tương lai của can thiệp RNA trong y học,nông nghiệp,...
Đặc biệt là Y học nghiên cứu ứng dụng RNAi để chữa những căn bệnh về tim mạch, ung thư, các bệnh vius: cúm (AH5NI, AH1N1), HIV,… giải quyết tốt các vấn đề nhân loại.
Tài liệu tham khảo
1. http://vietsciences.free.fr
2. http://www.hmu.edu.vn

3. http:// www.thuvienkhoahoc.com
4. http://www.rnaiweb.com
5. http://nobelprize.org
6. http://www.giaothongvantai.com
7. http://www.iarc.fr
8. http://www.sinhhocvietnam.com/vn
9. http:// www.hcmbiotech.com.vn
10. http:// www.youtube.com
11. http://www.agbiotech.com.vn
12. http://ireb.hueuni.edu.vn
13. http://vietsciences.org
14. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng; Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào; NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội; 2008.
Xin chân thành cảm ơn !