Chương IV Enzym Cố định

Chương IV: Enzym cố định (immobilized enzymes)
Nội dung:
4.1. Giới thiệu chung về enzym cố định
4.2. Các phương pháp điều chế enzym cố định
4.3. Tính chất của enzym cố định
4.4. Các Reactor chứa enzym cố định
4.5. Sử dụng enzym cố định trong công nghiệp và y học
4.1. Giới thiệu chung về Enzym cố định
1. Định nghĩa: Enzym cố định (Enzym không tan) là enzym được cố định trên chất mang không có khả năng hoà tan
2. Ưu điểm:
Có thể sử dụng enzym lặp đi lặp lại nhiều lần
Enzym cố định không lẫn trong sản phẩm, do đó tránh được ảnh hưởng không tốt đến sản phẩm
Có thể dừng nhanh chóng phản ứng khi cần thiết
4.2. Các phương pháp điều chế enzym cố định
1. Phương pháp hấp phụ vật lý
2. Phương pháp gắn enzym bằng liên kết đồng hoá trị
3. Phương pháp "gói" enzym trong khuôn gel
Có 3 phuong pháp di?u ch?:
4.2.1.Phương pháp hấp phụ (Adsorption)
Nguyên lý: Enzym có thể hấp phụ trên một số chất mang có hoạt động bề mặt
Chất mang không có lỗ xốp: Enzym được hấp phụ trên bề mặt hoặc tạo liên kết ion với chất mang
Chất mang có lỗ xốp: Enzym thâm nhập vào bên trong lỗ xốp
Các chất mang: Than hoạt tính, Dextrin, Silicagel, nhựa trao đổi ion (DEAE - Cellulose, CM-Cellulose)
Ví dụ:
Glucoamylase cố định trên DEAE-Cellulose hay DEAE-Sephadex
Protease axit tính(Pepxin) dễ cố định trên DEAE-Cellulose
Protease kiềm tính (Tripxin, Chymotripxin) dễ cố định trên CM-Cellulose
Nhược điểm: Enzym dễ bị phản hấp phụ và hoà tan trở lại khi thay đổi pH hoặc lực ion của dung dịch
4.2.2. Phương pháp gắn enzym bằng liên kết đồng hoá trị
2 phương pháp:
Gắn enzym vào chất mang không hoà tan trong nước bằng liên kết đòng hoá trị
Gắn các protein - enzym lại với nhau bằng liên kết đồng hoá trị
A. G¾n enzym vµo chÊt mang kh«ng hoµ tan trong n­íc
Chất mang (Ligand):
Kích thước: > 0,1 mm, thường là 0,5 - 1 mm
Có độ hoà tan thấp, bền với các những tác động cơ học và hoá học
Không gây tác dụng kìm hãm với enzym
Hấp phụ phi chọn lọc đối với các protein khác
Tốt hơn là có bản chất háo nước vì chất mang kị nước có thể gây ra những tác dụng ức chế các enzym được liên kết
Phân loại: 2 nhóm
Chất mang hữu cơ
Chất mang vô cơ
Chất mang hữu cơ:
Polipeptit
Polisaccarit: D/x của Cellulose (DEAE-Cellulose, CM-Cellulose), d/x của Sephadex (DEAE-Sephadex) và Agarose
Các Polime tổng hợp: Poliacrylamid, Poliamid, Polistirol
Chất mang vô cơ: Silicagel, Bentonit, Nhôm hidroxit
Gắn protein - Enzym vào chất mang:
2 phương pháp:
Phương pháp 1 giai đoạn: Nếu chất mang có nhiều nhóm có khả năng kết hợp trực tiếp với nhóm amin của protein.
VD: Chất đồng trùng hợp anhydrit maleic và ethylen để liên kết giữa nhóm NH2 của Lizin ở phân tử enzym với gốc anhydrit maleic của polime
Phương pháp 2 giai đoạn (chủ yếu):
Hoạt hoá chất mang
Gắn enzym vào chất mang hoạt hoá
Chất mang chứa nhóm amin:
Hoạt hoá bằng phản ứng Diazo:

b. Hoạt hoá bằng Phosgen hay Thiophosgen tạo thanhd d/x Izoxianat hay Izothioxianat



b. Ph­¬ng ph¸p Carbodiimide
2. Chất mang chứa nhóm Cacboxil:
Phương pháp Azit

2. Chất mang là Polisaccarit được hoạt hoá bằng Cyanogen bromide
2.1. Bằng CNBr
2.2. Ethyl chloroformate
Dùng Glutaraldehyde để làm chất kết gắn
B. Gắn protein - Enzym với nhau bằng liên kết đồng hoá trị
5. 3-aminopropyltriethoxysilane
4.2.3.Phương pháp "gói" enzym trong khuôn gel
Nguyên tắc: Để "gói" enzym trong khuôn gel người ta tiến hành trùng hợp các gel với enzym. Sau quá trình trùng hợp enzym được giữ lại trong gel. Gel chứa enzym có thể được nghiền nhỏ hoặc cho qua rây có lỗ rây với kích thước nhất định và sấy khô ở nhiệt độ thấp.
Các chất mang: Poliacrylamid, alginat, agarose, nhưng Poliacrylamid rất độc nên thường dùng 2 loại sau.
Nhược điểm: Không đồng đều hoạt tính ở tất cả vị trí.
Chất mang: Alginat, agarose, caraghinat
4.2.3.1. Gel được hình thành từ các polime tổng hợp
Membrane Incorporation
4.2.3.2. Enzym bị "nhốt" trong các lỗ nhỏ của sợi tổng hợp
Cho enzym vào nhũ tương Cellulose triaxetat trong Methylen Clorua, sau đó ép dung dịch đi qua khuôn hình sợi có kích thước nhất định; các sợi nhỏ hình thành đi ra khỏi khuôn đi vào bể chưa Toluen sẽ đông lại.
Structure of Immobilised Enzyme Particles
4.2.3.3. "Gói" enzym trong các bao vi thể (Microcapsule)
Enzym được gói vào trong các bao vi thể có màng bán thấm.
4.3. Một số đặc tính của enzym cố định
Enzym cố định có hoạt tính riêng thấp hơn hoạt tính riêng của enzym tan
Enzym cố định hoạt động tuân theo định luật Michaelis - Menten, nhưng có những sai khác đáng kể:
Enzym cố định bền nhiệt hơn enzym tan
Enzym cố định có pH tối ưu dịch về phía kiềm hoặc axit so với pH của enzym tan
Enzym cố định có khả năng bảo quản lâu hơn enzym tan

4.4. Các Reactor chứa enzym cố định (Immobilised Enzyme Reactors)
Reactor hoạt động theo chu kỳ:
- Thiết bị phản ứng có khuấy (Stirred Tank Reactors)
2.1. Reactor dòng chảy có khuấy trộn (Continuous Flow Stirred Tank Reactor )
2. Reactor hoạt động liên tục
(Packed Bed Reactors )
2.2. Reactor dòng chảy không khuấy trộn
(Fluidised Bed Reactors )
2.3. Reactor dòng chảy có enzym ở dạng huyền phù
(Membrane Reactors)
2.4. Reactor chứa ống mao quản có vách ngăn
4.5. Sử dụng enzym cố định trong công nghiệp thực phẩm và y tế
4.5.1. Trong y tế:
Enzym cố định dưới dạng Microcapsule được dùng để chứa bệnh thiếu enzym, không gây phản ứng miễn dịch
Urease cố định để chạy thận nhân tạo
Catalase cố định để chuyển hoá H2O2 trong cơ thể
Asparaginase cố định ức chế khả năng STPT của một số u ác tính
4.2. Trong công nghiệp thực phẩm
4.2.1. Aminoacylase cố định để sản xuất aminoacid
Trong quá trình tổng hợp hoá học thường thu được hỗn hợp Acyl-DL-aminoacid. Sử dụng Aminoacylase cố định (AACĐ) để thu nhận L-aminoacid. AACĐ chỉ thuỷ phân acyl-L-isome tạo thành L-aminoacid. Acyl-D-aminoacid còn lại được đun nóng để chuyển về dạng Acyl-DL-aminoacid và quá trình trên lại lặp lại.
Hãng Tanake Seizaku (Nhật) - 1969 Aminoacylase cố định trên DEAE - Sephadex. Sán xuất 700 - 1000 kg L-aminoacid/ngày với chi phí chỉ bằng 60% so với dùng enzym tan.
Hãng Snam Progetti: ứng dụng Aminoacylase cố định trong sợi Triaxetat Cellulose
Acyl-D-AA
Hỗn hợp Acyl-DL-AA
Lọc
Xử lý nhiệt
Bioreactor
L-AA tinh thể
Bay hơi
Kết tinh
Ly tâm
Sơ đồ sản xuất L-Aminoacid của hãng Tanabe Seizaku
4.2.2. Sử dụng Aspartase cố định để sản xuất L-aspartic acid
Từ 1973 hãng Tanabe Seizaku đã sử dụng tế bào cố định có chứa Aspartase trong poliacrylamid gel với chu kỳ bán huỷ 120 ngày ở 37oC để sản xuất L-aspartic acid.
Phương pháp cố định: 10 Kg tế bào hoà tan trong 40 L dung dịch sinh lý + 7,5 Kg Acrylamid, 0,4 Kg Bis acrylamid, 5 L 5% Dimethylaminopronitrile và 5 L 2,5% NH4 persulfat, hỗn hợp để 40oC trong vòng 10=15 ph., gel tạo thành được cắt thành miếng vuông 2 - 3 mm.
4.2.3. Sử dụng Fumarase cố định để sản xuất L-Malic acid
Enzym Fumarase xúc tác:
HOOC-CH=CH-COOH + H2O ----- HOOC-CH(OH)-COOH
Axit Fumaric Axit Malic
Hãmg Tanabe Seizaku sử dụng tế bào cố định có chứa Fumarase
Hãng Snam Progetti sử dụng Fumarase cố định trong sợi Triaxetat Cellulose
4.2.4. Sử dụng Lactase cố đinh để thuỷ phân Lactose
Hãng Snam Progetti: Bioreactor 20L chứa 4 Kg Lactase cố định trong sợi Triaxetat Cellulose. Sữa được tiệt trùng ở T=142oC, 3 s., làm lạnh nhanh đến T= 4-7oC, cho chảy qua Bioreactor với V=7L/ph.SP thu được có thể bảo quản ít nhất 3-4 tháng. Hiện nay sản xuất 10T sữa không có Lactose/ngày.
Hãng Corning Glass: 1978 bắt đầu sử dụng Lactase cố định với các hạt Silicagel để xử lý Lactose trong huyết thanh sữa với CS 30T/ngày
Enzym Lactase xúc tác p.ư:
Lactose ------- Galactose + Glucose
4.4.2.5. Sử dụng tế bào nấm men cố định để lên men rượu
Cố định tế bào nấm men trong Alginat