Cay truyen phoi

Cấy truyền phôi
Chuyên đề
GVHD: TS. Nguyễn Văn Ban
SVTH: Trần Văn Toàn
Nguyễn Thị Bích Việt
1
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
NỘI DUNG CHÍNH
Nguồn gốc
Nuôi phôi
Cấy phôi
Chương IV: CÔNG NGHỆ HỖ TRỢ SINH SẢN
IV. Cấy truyền phôi
2
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
3
4.1 NGUỒN GỐC:
Đối với người
Ở người, nguồn phôi sử dụng cho cấy truyền chủ yếu được tạo từ in vitro
Được công bố thành công đầu tiên năm 1984 khi cho ra đời 1 đứa trẻ bởi Lutjen và cs.
Thời gian đầu, được sử dụng điều trị cho những trường hợp buồng trứng bị hư hại.
Đối với động vật:
Phôi được nhận từ những con giống tốt sau khi thụ tinh in vitro.
Để có nguồi phôi in vivo, thông thường phải chọn những con cái tốt và tiến hành gây siêu rụng trứng bằng hoocmon, kết hợp gây động dục đồng pha.
Sự thụ tinh tiến hành bằng 2 cách: cho giao phối tự nhiên và dẫn tinh nhân tao.
4
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
Thu nhận phôi: thu nhận phôi giai đoạn sớm từ ống dẫn trứng hay thu nhận ở giai đoạn muộn từ tử cung. Thích hợp nhất khi phôi ở giai đoạn phôi nang hoặc phôi dâu.
+ Có 2 phương pháp thu nhận phôi in vivo ở động vật là dội rửa lấy phôi thông qua phẫu thuật và không thông qua phẫu thuật.
Soi tìm phôi: là cách nhặt ra những phôi có trong dung dịch gọt rửa. Thường sử dụng dụng cụ Emcon, hệ thống lọc Minitub. Thực hiện trên đĩa petri hay trên hệ thống đĩa lọc phôi.
Sau đó nhanh chóng hút phôi ra ngoài và chuyển phôi vào môi trường thích hợp.
5
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
6
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
7
4.2 NUÔI PHÔI:
4.2.1 Chuẩn bị:
Tủ ấm CO2, nhựa trung tính của Nunc, thủy tinh của Schott thường được dùng.
4.2.2 Môi trường nuôi cấy:
Các môi trường thông dụng:
Được Krebs Ringer dựa vào thí nghiệm sinh lý mô tả rỏ ràng, chung được chia làm 3 kiểu sau:
MT muối đơn giản bổ sung các cơ chất năng lượng
MT nuôi cấy mô phức tạp: có chứa các acid amin, VTM. Cơ chất của nucleic, ion kim loại và được bảo sung 5-20% huyết thanh.
MT liên tục: gần đây, thích hợp nhất với sự biến đổi sinh lý của phôi.
8
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
b. Thành phần cơ bản:
MT nuôi cấy luôn là MT đẳng trương và chứa các ion cần thiết cho quá trình sống ( Na+ ,K+ ­­, Ca++ , Mg++ , Cl- ), hệ đệm bicarbonat. Đồng thời phải bổ sung thêm kháng sinh và lượng protein tối thiểu dạng huyết thanh or albumin.
Nước: là thành phần chính chiếm 99%. Quyết định khả năng phát triển của phôi.
Thành phần ion kim loại: ảnh hưởng đến sự phát triển bình thường của phôi nhất là giai đoạn blastocyst.
Carbohydrat: có nhiều trong toàn bộ ống dẫn trứng và tử cung với các mức độ khác nhau. Kết hợp với amino acid là những thành phần cơ chất năng lượng quan trọng. Các carbohydat như pyruvat, lactate và glucose.
9
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
Các amino acid tự do có một lượng lớn trong dịch tử cung và ống dẫn trứng.
Vitamin có thể luôn hiện diện trong môi trường nuôi cấy, nhưng các tác động của chúng thì chưa được biết nhiều.
Các cơ chất nucleic acid: không hiện diện trong môi trường nuôi cũng không ảnh hưởng gì đến sự phát triển của phôi chuột và người đến giai đoạn blastocyst.
+ EDTA tác động có ích lên sự phát triển của phôi in vitro, nhưng nó cũng làm ảnh giảm đáng kể sự phát triển của phôi sau đó.
Các chất chống oxy hóa: được cho là một trong những chất làm chậm sự phát triển của phôi in vitro trước khi làm tổ so với phôi in vivo bởi chúng có thể gây ra stress oxy hóa.
có thể bố sung vào môi trường SOD, glutathyone, cysteamine có lợi cho sự phát triển của phôi.
10
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt

Các kháng sinh truyền thống: thường bổ sung penicillin,streptomycin, gentamicin trong nuôi cấy phôi.
Nguồn protein và các đại phân tử khác: sử dụng nhiều nhất trong IVF và nuôi cấy phôi là của chính bệnh nhân.
Hormon và các nhân tố tăng trưởng: có vai trò quan trọng trong môi trường phôi. Vai trò của nó trong sự tăng trưởng của phôi in vitro phôi động vật có vú được nghiên cứu nhiều bao gồm: insulin, IGF-II,EGF,TGF,…kích thích sự phân cắt, sự vận chuyển các amino acid, sự hình thành các phôi.
Hệ thống đệm: sử dụng chủ yếu bicarbonate, co2 để duy trì pH sinh lý. Tuy nhiên pH sẽ tăng khi tiếp xúc với không khí làm phôi hư.
11
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
c. Kiểm soát chất lượng môi trường:
Phôi chuột trước khi làm tổ phải được sử dụng rộng rãi trong các thí nghiệm sinh học nhằm kiểm tra thành phần của môi trường nuôi cấy cũng như thiết bị hổ trợ sinh sản và được gọi là các thử nghiệm sinh học.
với mục đích tương tự, tinh trùng cũng thường được sử dụng.
12
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
4.2.3. Một số điều kiện nuôi cấy:
Nồng độ oxy:
Trong lòng ống dẫn trứng của thỏ từ 2-6%, chuột túi,khỉ gân bằng 8%.
Nồng độ oxy giảm -> tăng cường phát triển phôi. Với thỏ, bò,cừu nồng độ oxy giảm giữa 5-8% sẽ gia tăng sự phtas triển của phôi in vitro hơn so với 20%.
Carbon dioxide:
Chúng xâm nhập vào trong protein, nucleic acid trong tất cả các giải đoạn của phôi chuột trước khi làm tổ.
Hệ thống nuôi cấy phôi động vật có vú thường kết hợp 5% CO2 trong không khí.
pH của dịch: thu nhận từ bộ phận sinh dục của khỉ Rhesus thay đổi song song với các sự thay đổi nồng độ CO2.
Kiểm tra bằng phương pháp tiêu chuẩn màu.

13
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
Nhiệt độ:
Thích hợp để nuôi phôi là 370 C.
Giao động nhiệt ở sự phân cắt sớm sẽ làm giảm khả năng phát triển của phôi in vitro.
Phôi người tiếp xúc với nhiệt độ phòng thì gây cảm ứng tạo các hư hỏng không thể sửa chửa được trong thoi vô sắc của quá trình giảm phân.
Ánh sáng: nhất là ánh sáng nhìn thấy được có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của phôi in vitro.
Thể tích giọt ủ hoặc việc tạo nhóm phôi trong in vitro cũng cần được quan tâm.
Tỉ lệ phân cắt và hình thành phôi g/đ blastocyst tăng khi phôi phát triển thành nhóm hay trong thể tích giảm.
Thể tích ủ giảm thì tăng sức sống của phôi.
14
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
4.2.4. Phương pháp đồng nuôi cấy:
- Là phương pháp nuôi cấy phôi kết hợp với các tế bào khác.
Có 2 hệ thống đồng nuôi cấy là: đồng nuôi cấy tương đồng và đồng nuôi cấy tự thân và chúng luôn có sự hiện diện của tế bào cho ăn để làm cải thiện hiệu quả sự phát triển của phôi.
Ở cùng giai đoạn phát triển, các phôi đồng nuôi cấy có số lượng tế bào phân chia cao hơn các tế bào ICM tạo sư kết dính hoàn toàn. Đặc điểm của sự phát triển này là kết quả của bốn cơ chế khác nhau như sau:
+ Khóa chuyển hóa
+ Các nhân tố cần thiết cho sự phát triển có thể được cung cấp do tế bào feeder.
15
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
+ Các chất động có thể được dọn sạch.
+ Những kim loại nặng có thể được bắt giữ bởi các glycine được xuất từ các tế bào feeder.
Weimer và cs (1998), khi ứng dụng kĩ thuật đồng nuôi cấy đã bổ sung và củng cố được sự tiên lượng cho các bệnh nhân vô sinh.
Hệ thống đồng nuôi cấy thường sử dụng với các tế bào fibroblast nội mạc tử cung thai bê, các dòng tế bào nội mạc tử cung người và vòi dẫn trứng và các dong tế bào Vero thương mại.
Một số bất lợi trong kĩ thuật đồng nuôi cấy:
Tốn công và tốn nhiều thời gian.
Môi trường các tế bào feeder bị chuyển hóa rất nhanh, pH thay đổi nhanh.
Các điều kiện nuôi khó duy trì.
Các tế bào làm giá thể có thể bị nhiễm vi rut, vi khuẩn và mycoplasma.
16
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
4.2.5 Một số diễn biến quan trọng trong sự phát triển phôi
17
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
Hình thái và tỉ lệ phát triển của phôi là 2 chỉ tiêu được sử dụng đầu tiên theo dõi sự phát triển của phôi in vitro.
Sau 20-34h sau thụ tinh hai tiền nhân tiến xát với nhau và hợp giao. Sau 35-36h thì hình thành 2 tế bào phôi lưỡng bội
Sau 16-18h sau khi tinh trùng thụ tinh với trứng thị nhân được hiện rõ và chúng có nhiệm vụ tổng hợp rARN của phôi.
Tesarik và Greco cho biết sự sắp xếp tiền nhân liên quan đến trục thể cực, sự định vị của nhân và tính ổn định nguyên sinh chất. Như trứng 3 tiền nhân là kết quả của sự hình thành thoi 3 thể cực.
Khi trứng được thụ tinh bình thường, thì bất đầu phân cắt hợp tử, sau 35,6h hình thành phôi 2 tb, sau 2 ngày thụ tinh hình thành phôi 4tb, sau 3 ngày -> phôi 8tb.
Từng tb riêng lẽ phân chia không toàn bộ sau một thời gian xuất hiện số tb lẽ.
18
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
Sự phân mảnh phôi là tiêu chuẩn về hình thái để đánh giá chất lượng phôi.
Kích thước tb phôi ảnh hưởng đến khả năng phát triển của chúng.
Trên các mảnh phôi có các protein có vai trò quan trọng, chúng tác động vào từng tb trong suốt quá trìnhphats triển của phôi.
Tốc độ phân bào nguyên nhiễm của phôi có 3 mức độ:
+ Thấp (2-6tb vào ngày thứ 3)
+ Phân cắt nhanh (9 tb vào ngày thứ 3)
+ bình thường (7-8tb vào ngày thứ 3)
Trong suốt ngày thứ 3 sau thụ tinh, nguyên sinh chất của phôi trở nên có hạt và các lõm nhỏ xuất hiện
Ngày thứ 4, phôi còn được gọi là morula, chúng có sự hình thành kết nối chặt chẽ và kết nối gap, xuất hiện sự phân cực của tb.
19
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
Dẫn đến sự phân tách rõ ràng 2 quần thể tb bên trong và tb bên ngoài, hình thành nên các mô ngoại phôi.
Khi morula xuất hiện khoảng rổng bên trong được gọi là giai đoạn blastocyst, khoang phôi chứa đầy dịch.
Giữa ngày thứ 5 và ngày thứ 7 hình thành nên blastocyst in vitro.
Phôi được gọi là blastocyst sớm khi khoang đã hiện diện rõ và các tb ICM, tb lá nuôi phôi biểu hiện hình thái khác nhau.
Blastocyst gia tăng kích thước thì được gọi là blastocyst mở rộng -> sự ỏng dần của màng zona pellucida.
Ngày thứ 6, thứ 7: blastocyst phát triển phôi nang thoát ra khỏi màng zona pellucida và được gọi là quá trình thoát nang.
Ngày thứ 8 và thứ 9, những phôi không thoát nang được sẽ bị thoái hóa.
Số lượng tb phôi blastocyst liên quan đến sức sống của phôi
20
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
21
4.3. CẤY PHÔI
1. Giới thiệu:
Việc cấy phôi vào tử cung gọi là chuyển phôi hay cấy truyền phôi, các phôi sau khi được tạo ra từ invitro cần được đưa vào tử cung của cá thể nhận thích hợp.
Chuyển phôi là kỹ thuật thu nhận phôi từ bộ phận sinh dục của cá thể cái để cấy vào tử cung của con cái nhận, nhằm tiếp tục hoàn thành quá trình mang thai và sinh con
Chuyển phôi trải qua các bước cơ bản sau:
Chuẩn bị phôi
Chuẩn bị con nhận phôi
Cấy truyền phôi vào con cái nhận
22
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
Khi đưa vào cá thể nhận, phôi vẫn sống và phát triển bình thường trên cơ sở trạng thái sinh lý, sinh dục của con cái nhận phôi phù hợp với trạng thái sinh lý, sinh dục của con cái cho phôi và phù hợp với tuổi phôi.
Cấy truyền phôi bò được tiến hành đầu tiên bởi Willett và cộng sự tại Đại học Cornell (Mỹ) năm 1951.
Năm 2000, đã có 530 000 phôi bò, 4 886 phôi cừu, 10 519 phôi dê, 1 264 phôi hươu, 2 830 phôi ngựa được cấy truyền trên thế giới.
23
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
2. Chuẩn bị cơ thể mẹ nhận phôi:
Việc chuẩn bị một con cái để có thể đón nhận những phôi từ con khác (cùng loài) gặp nhiều khó khăn và phức tạp hơn, trước hết phải tạo ra sự đồng pha sinh dục giữa con cái nhận phôi với con cái cho phôi.
Chỉ khi nào các kết quả đều thuận lợi, việc cấy phôi mới được tiến hành.
Gây trạng thái cùng cùng động dục: con cái nhận phôi phải cùng tuổi và nên có cân nặng xấp xỉ, vớicon cho phôi. Chúng được tiêm kích dục tố cùng thời điểm với con cho phôi hoặc sau 1 ngày, sau đó, những con cái này sẽ được phối tự nhiên với con đực đã bị cắt ống dẫn tinh hoặc vô sinh.
24
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
Chúng ta theo dõi sự động dục tự nhiên hoặc tạo trạng thái động dục cho con vật bằng hoocmone.
VD: ở bò sữa gây động dục nhân tạo bằng phương pháp tiêm PGF2α, đặt CIDR hoặc Prid...
25
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
3. Chọn lọc các phôi:
Các giai đoạn phát triển của phôi:
26
27
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
Morula
Early blastocyst
Blastocyst
Expanded Blastocyst
Hatched blastocyst
28
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
Tuyển chọn phôi để cấy gồm 3 loại phôi với các tiêu chuẩn sau đây:
1. Loại rất tốt: phôi có sự phát triển đúng với lịch trình sinh lý, hình thái chuẩn, khối phân bào phân chia đều, rõ và đậm màu. Màng zona pellucida tròn, đẹp. Phôi bào liên kết chặt chẽ, không có tế bào rời, không có kẽ gian bào.
29
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
2. Loai tốt: cơ bản phôi có sự phát triển
đúng với lịch trình sinh lý, đủ kích thước
và số lượng, có thể không đẹp, không đều,
có một số tế bào rời, một ít mảnh vụn,
nhưng sự liên kết tế bào phải chặt chẽ.
3. Loại trung bình: Các phôi bào liên kết thiếu chặt chẽ, có nhiều tế bào rời, nhiều mảnh vụn rời
xen kẽ hoặc kết tụ, kích thước phôi
bào không đều, nhỏ hơn bình thường,
màng trong suốt không tròn, đều,
dễ vỡ.
30
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
4. Chuyển phôi:
4.1 Chuyển hợp tử - ZIFT
Là kỹ thuật đặt một phôi vào trong ống dẫn trứng thông qua kính soi ổ bụng.
Để tiến hành ZIFT, cần thu
nhận trứng và tinh trùng, sau
đó thụ tinh trong ống nghiệm.
31
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
Chuyển phôi vào ống dẫn trứng bằng 1 ống dài đưa hợp tử vào đoạn cuối vòi trứng dưới sự hổ trợ của siêu âm.
Ưu điểm của phương pháp này là không cần phải nuôi hợp tử phát triển thành phôi đến giai đoạn blastocyst, nhưng không chắc chắn hợp tử có phát triển thamhf phôi tốt hay không.
32
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
4.2 Chuyển phôi giai đọan 2 tế bào đến giai đoạn morula:
Chuyển phôi 2 -12 tế bào:
+ Thời điểm thuận lợi nhất để chuyển phôi là khi phôi chỉ ở bên ngoài trong thời gian ngắn (2 ngày). Nếu để lâu ngoài môi trường thì chúng sẽ bị ảnh hưởng bởi các điều kiện ngoài (nhiệt độ, CO2, độ ẩm, không khí...)
33
+ Nên chọn phôi có nhiều tế bào vì các phôi phát triển nhanh sẽ dễ dàng làm tổ trong buồng tử cung.
+ Trong điều kiện tự nhiên,
giai đoạn này phôi vẫn còn
di chuyển trong vòi trứng,
nhưng trong quy trình thụ
tinh ống nghiệm mà phôi được chuyển vào buồng tử cung. Nhưng đôi khi chuyển phôi 10 -12 tế bào được thực hiện nhiều hơn do không tìm thấy phôi tốt ở giai đoạn trước đó.
34
Chuyển phôi marula:
Chuyển phôi vào giai đoạn này không được ưu tiên vì thời gian phôi phân chia nén đặc tế bào đang xảy ra trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo, đây là giai đoạn nhạy cảm
Cấy phôi lúc này thường không tốt
35
4.3 Chuyển phôi giai đoạn Blastocyst:
Các phôi bình thường sẽ phát triển đến giai đoạn blastocyst, chúng có điều kiện thuận lợi để bám tại màng nội mạc tử cung. Ưu tiên nuôi phôi đến giai đoạn early blastocyst trước khi chuyển vào tử cung mẹ nhằm tăng tỷ lệ mang thai và giảm nguy cơ đa thai.
36
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
Những thuận lợi của cấy chuyển phôi giai đoạn blastocyst:
và phát triển tốt hơn nhờ có sự phù hợp giữa tử cung Phôi làm tổ và giai đoạn phát triển của phôi.
Có thể chọn lọc phôi tốt nhất cho cấy truyền
Tỷ lệ làm tổ và mang thai cao
Chuyển ít phôi nên giảm tình trạng đa thai. Đây là nguyên nhân quan trọng nhất phải chuyển phôi giai đoạn blastocyst.
37
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
Bên cạnh đó cũng có những khó khăn sau:
Một số phôi blastocyst dễ chết trong phòng thí nghiệm.
Có thể phôi khó sống sót khi đông lạnh và giải đông.
Không ai biết được các phôi chết khi phát triển thành blastocyst, nếu được chuyển sớm có phát triển thành thai tốt, bình thường hay không?
38
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt