Cây đọn bội

CHUYÊN ĐỀ:
Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật vào việc
nuôi cấy bao phấn , hạt phấn tạo
cây đơn bội
Trường đại học dân lập Văn lang
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
GVHD : THS. VÕ THỊ XUYẾN
NHÓM VI _ LỚP K14S1
NGUYỄN THỊ TƯỜNG VI
NGUYỄN VIỆT HẠNH TIÊN
NGUYỄN THỊ HOÀNG YẾN
NGUYỄN THỊ MỸ NƯƠNG
BÙI THỊ THỦY TIÊN
6. TÔ THỊ NGỌC HÂN
7. ĐÀO THỊ MINH KHIẾT
8. NGÔ THỊ THÚY AN
9. LÊ THỊ NGỌC LOAN
10.NGUYỄN THỊ HOÀNG XIÊM



Giới thiệu
1953 Tulecke, lần đầu tiên quan sát hạt phấn chín thuần thục của cây hạt kín Ginkgo Biloba có thể phát sinh tăng sinh trong nuôi cấy hình thành mô sẹo đơn bội.
Năm 1964, Guha và Maheswari ghi nhận sự phát triển trực tiếp của phôi từ tiểu bào tử Datura innoxia qua nuôi cấy túi phấn tách rời.
Bourgin và Nitsch(1976) thu nhận được cây thuốc lá( Nicotiana tabacum) đơn bội hoàn chỉnh và từ đó có nhiều thành tựu trong nuôi cấy mô đơn bội được công bố.




Cây đơn bội có số lượng NST đơn bội ,đó là một bộ NST ở thể bào tử .
Hai phương pháp cơ bản của kỹ thuật đơn bội hiện nay là:
Nuôi cấy bao phấn hay tiểu bào tử tách rời hay còn gọi là như phương pháp trinhsinh đực trong ống nghiệm (in vitro androgenesis).
Nuôi cấy tế bào trứng chưa thụ tinh hay còn gọi là phương pháp trinh sinh cái trong ống nghiệm (in vitro gynogenesis).
Mục tiêu
Nghiên cứu phát sinh đột biến và cũng như sản xuất những cá thể đồng hợp tử với số lượng lớn.

Tìm hiểu vai trò của DNA nhân và DNA tế bào chất, xác định các tính trạng liên quan đến di truyền tế bào chất.

Sử dụng trực tiếp trong trồng trọt.
Đặc điểm của nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tạo cây đơn bội là nhờ sự cảm ứng phát sinh phôi từ những lần phân chia lặp lại của các bào tử đơn bội, các tiểu bào tử, các hạt phấn non. Giai đoạn phát triển đặc thù của bao phấn tại thời điểm nuôi cấy là nhân tố quan trọng nhất đối với sự thành công của phát sinh phôi.
Thực vật hạt kín, mỗi chồi hoa có thể chứa các bao phấn ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Vì vậy, mỗi chồi hoa phải được kiểm tra để xác định tất cả các giai đoạn phát triển giúp lựa chọn những bao phấn có độ tuổi phù hợp cho nuôi cấy.
Nuôi cấy bao phấn cần phải chọn đúng giai đoạn phát triển thích hợp của hạt phấn để có thể thu nhận tỷ lệ tái sinh và số lượng cá thể tự nhị bội hoá (dòng đơn bội kép) cao. Giai đoạn nuôi cấy hiệu quả nhất là giai đoạn tế bào hạt phấn từ tế bào đơn nhân sớm đến đầu giai đoạn hai nhân. Các hoa đực được tách khỏi cây cho bao phấn (donor plants) khi phần lớn các hạt phấn đang phát triển từ giữa đến cuối giai đoạn đơn nhân (mid- to late uninucleate stage).
Giai đoạn lưỡng bội hoá bộ nhiễm sắc thể của các cây đơn bội tạo thành cây đơn bội kép (doubled haploids) đồng hợp tử cùng nguồn gen
Giai đoạn biệt hoá cơ quan và tái sinh cây đơn bội từ các cấu trúc phôi (giai đoạn tái sinh).
Giai đoạn tạo cấu trúc phôi từ các hạt phấn nuôi cấy.
Các giai đoạn cơ bản trong quy trình nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tách rời
Phương pháp nuôi cây tạo cây đơn bội
PP1: Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc môi trường lỏng và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn.
PP 2: Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn hoặc bằng phương pháp cơ học, hoặc do nứt nẻ tự nhiên của bao phấn và được nuôi trên môi trường lỏng.

Chọn bao phấn: Bao phấn thích hợp nhất có chứa hạt phấn bắt đầu từ thể 4 nhân đến ngay sau lần nguyên phân thứ nhất. Bao phấn của các hoa đầu tiên cho kết quả tốt hơn bao phấn của hoa muộn.
Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để nuôi cấy, nhằm kích thích sự phân chia của hạt phấn và từ đó tạo cây đơn bội.
Chọn môi trường tái sinh cây thích hợp: Tùy theo đối tượng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn mà chúng ta lựa chọn môi trường thích hợp tương ứng.
Chọn lọc cây đơn bội: có nhiều cách để xác định cây đơn bội như: làm tiêu bản để đếm số lượng nhiễm sắc thể, đo hàm lượng DNA trong tế bào, so sánh cây tái sinh từ bao phấn với cây mẹ về khả năng sinh trưởng, hình thái, kích thước.
Kỹ thuật nuôi cấy
Sơ đồ tạo cây đơn bội từ nuôi cấy hạt phấn in vitro
Khử trùng bề mặt
Nhuộm acetoarmine để xác định
GĐPT của hạt phấn
Nuôi cấy trên
mt bán rắn(có agar)
Nuôi cấy trên
mt lỏng
Phát triển phôi
Hoa
Tách các bao phấn
Loại bỏ chỉ nhị
Cây đơn bội
Phương pháp kiểm tra nhiễm sắc thể
Các cây con sau khi đưa ra chậu 20-30 ngày có khoảng 10-15 nhánh. Lấy ngẫu nhiên ở mỗi cây 2-3 nhánh, cắt bỏ hết các bẹ lá ngoài, chỉ lấy một đoạn non trong cùng và đánh dấu thứ tự cho từng cây. Mẫu được cố định theo carnua ( 75ml cồn tuyệt đối + 25ml acetic acid đậm đặc) từ 6-12 giờ. Rửa mẫu vài lần bằng cồn 70%, sau đó rửa bằng nước cất. Nhuộm mẫu bằng dung dịch carmin 2% hay bằng Carbon fuchsin theo Kao.
Dung dịch Carbon fuchsin được pha như sau:
DD A (dd A): fuchsin basic (3g) + cồn 70%(100ml).
DD B (dd B): dd A (1ml) + phenol 5% ( 90 ml).
DD C (dd C): dd B + acetic acid (6ml) + formaldehyde (6ml).
Ép mẫu trong acetic acid 45%, kiểm tra mức bội thể dưới kính hiển vi.
Nhị bội hóa cây đơn bội
Xử lí colchicine: cây con in vitro khi còn dính túi phấn được xử lý 24 đến 48 giờ với dd colchicine 0,5%, được rửa sạch bằng nước cất vô trùng và cấy chuyền lại tuy nhiên nếu cây đơn bội lớn thuần thục, dung dd colchicines-lanolin thấm lên trên cuống lá.
Tái sinh qua phương pháp nuôi cấy mô: Những
thể lưỡng bội được hình thành từ sự nhân đôi xảy ra thường xuyên trong quá trình nuôi cấy mô thực vật đơn bội. Thường sử dụng mô lá của cây đơn bội nuôi cấy.
SỰ PHÁT TRIỂN CÁ THỂ CỦA PHÁT SINH ĐƠN TÍNH ĐỰC
Hiện tượng phát sinh cây đơn bội từ các tế bào giao tử đực của thực vật được gọi là sinh sản đơn tính đực (androgenesis)
Có 2 phương thức sinh sản đơn tính đực:
- Phát sinh trực tiếp
- Phát sinh gián tiếp
Mô hình phát sinh đơn tính đực
1. Sinh sản đơn tính trực tiếp từ tiểu bào tử
Tiểu bào tử trong bao phấn → Phôi → Cây đơn bội.
Cấu trúc dạng phôi (embryoid) phát triển trực tiếp từ hạt phấn.
Quá trình này thường xảy ra trong bao phấn.
Phôi ở giai đoạn hình cầu, được phóng thích ra từ vỏ ngoài và phát triển.
2. Sinh sản vô tính qua callus
Tiểu bào tử trong bao phấn → Callus → Chồi → Cây đơn bội.
Khối mô này thường phát triển ra ngoài bao phấn.
Kiểu phát triển này hoàn toàn phổ biến và do môi trường kích thích phát sinh
Phương pháp phát sinh cây đơn bội invitro
Qui trình tạo cây đơn bội thuốc lá từ hạt phấn phân lập

1. Cảm ứng
a. Tạo cây đơn bội
Nụ hoa được xử lý bằng ly tâm 2.000 vòng/phút trong thời gian 30’ ở nhiệt độ 5-10 0C sau khi cắt để 48h ở 2-50C.
b. Tạo cây nhị bội
Nụ hoa được ngâm trong dung dịch colchicine 0,04% và dimethyl sulfoxide (chất dẫn nạp) 2% trong thời gian 24h ở 2-5 0C và hút chân không. Sau đó rửa sạch dung dịch colchicine và xử lý lạnh tiếp 24h.
.
2. Nuôi bao phấn
Bao phấn được tách từ nụ, nuôi 3 ngày trong môi trường khoáng Halperin chứa đường sucrose 2% và Fe-EDTA (5mL/L: Na2EDTA 754mg + FeSO4.7H2O 557 mg pha trong 100 mL nước sôi), pH 5,8. Nuôi 50 bao phấn trong 5 mL môi trường lỏng.
3. Tách và nuôi hạt phấn
Ép bao phấn bằng đũa thủy tinh, lọc hạt phấn bằng lưới có mắt (Φ = 48 μm) và đưa vào ống ly tâm vô trùng có bông ở đáy. Ly tâm 850 vòng/phút và rửa hai lần bằng môi trường mới. Nuôi hạt phấn với nồng độ 104 hạt phấn/mL, mỗi đĩa petri đường kính 5cm nuôi 2,5 mL dung dịch, dán giấy parafilm và để ở nơi có ánh sáng nhạt. Sau 30 ngày sẽ xuất hiện phôi non
Nuôi cấy bao phấn cây thuốc lá
1. Nguyên liệu thực vật
Sử dụng bao phấn của cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) để nuôi cấy đơn bội.

Hoa thuốc lá
2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường dinh dưỡng để nuôi bao phấn rất đơn giản gồm muối khoáng và sucrose, không cần các chất hữu cơ khác cũng như hormone sinh trưởng.
Thành phần các môi trường nuôi cấy bao phấn thuốc lá

3.Nuôi cấy bao phấn
Chuyển
ra bầu
đất
Khử trùng
4 tuần
4. Nhị bội hóa thông qua giai đoạn callus
Tiến hành kiểm tra NST của cây đơn bội.
Thân của cây thuốc lá đơn bội nuôi cấy trong ống nghiệm được cắt thành từng đoạn dài 5 mm và cấy lên môi trường tạo callus.

Sau 7-10 ngày, từ đoạn thân trên sẽ tạo ra callus sơ cấp, sau đó nó sẽ tái sinh thành chồi khi gặp điều kiện thuận lợi.
Phương pháp kiểm tra nhiễm sắc thể

Mảnh lá non (1-2 mm) hoặc đầu rễ (2 mm) được tách ra từ cây thuốc lá đơn bội nuôi cấy trong ống nghiệm, cố định bằng hỗn hợp cồn: acetic (3:1) trong 24 giờ. Mẫu được bảo quản ở cồn 70%, nhuộm nhiễm sắc thể bằng acetocarmin. Đếm số lượng nhiễm sắc thể dưới kính hiển vi.
Kết quả phân tích số lượng nhiễm sắc thể của các cây tái sinh từ quần thể tế bào callus đơn bội là không đồng nhất, cho thấy: cây 1n chiếm tỷ lệ khoảng 21,9 %, cây 2n khoảng 61,5 % và khoảng 11,5 % là những cây có mức bội thể cao hơn nhị bội.
NUÔI CẤY HẠT PHẤN CỦA CÂY LÚA
Sơ đồ nuôi cấy bao phấn lúa
Thu thập vật liệu:
Túi phấn được thu nhận vào ngày thứ 60 hoặc 90 sau trồng.
Các dòng lúa được gieo trồng cách khoảng nhau 1 tuần và tiến hành trong 5 lần để tránh các giống có thời gian chín khác nhau.
Mỗi dòng cần 1-2 tép có mang tược hoa thụ phấn ở giai đoạn chín
Quy trình
Xử lý vật liệu:
- Cây lúa lấy ở giai đoạn phân tử có nhân phân chia đồng nhất trước khi hạt phấn đi vào quá trình phân chia giảm nhiễm.
Mẫu được lấy khi khoảng cách giữa tai lá đòng và lá thứ 2 khoảng 2-3cm. Đoạn thân được đặt trong bao nylon phủ giấy nhôm.
Xử lý lạnh túi phấn trước khi đưa vào nuôi cấy ở 100C trong tối 48-72h.
Khử trùng
20 phút
Rửa nước cất
2 tuần
Dán kính bằng
parafin
D= 2mm
Dán kính, 270C
5-7 lần
Sau vài tuần
Đoạn thân
chứa
túi phấn
xử lý lạnh
Dung dịch
Natrihypoclorit
2.5%
Tách hoa ra
khỏi thân
Tách túi phấn
Mô sẹo
phát sinh
Phòng dưỡng
cây ở 24- 270C.
CDAS 2000lux
Cấy lên môi
trường N6
Cấy lên MT
tái sinh MS

Phòng dưỡng cây
cường độ chiếu sáng
50-60mol/m2/s
Hình thành
chồi
Cây xuất hiện
rễ trắng
Khi cây cao 8-10 cm, cấy sang môi trường White
là bước trung gian khi chuyển ra đất.
Các môi trường sử dụng trong nuôi cấy túi phấn lúa:
Môi trường tạo mô sẹo: N6 + 2mg/l 2-4,D + 60g/l sucrose.
Môi trường tái sinh: MS + 1mg/l BAP + 1mg/l NAA + 1mg/l kinetin + 30g/l sucrose
Môi trường nhân chồi: MS + 2mg/l BAP + 30g/l sucrose
Môi trường nhân nhanh: MS + 30g/l sucrose
Môi trường tạo rễ: MS + 1mg/l NAA + 30g/l sucrose
Môi trường thích nghi: dung dịch Yoshida.
Kiểm tra NST
Tiến hành kiểm tra NST của cây đơn bội bằng cách cố định theo carnua, sau đó nhuộm mẫu bằng carmin hay dd cacbon fuchsin.
Quan sát dưới kính hiển vi
Nhị bội hóa cây đơn bội
Có 3 pp cùng nồng độ colchicine và thời gian 24-48h.
PP1: nhổ, rửa và ngâm rễ lúa trong dd colchicine khi cây bắt đầu đẻ nhánh mạnh, sau đó rửa sạch và cấy lại.
PP2: cắt bỏ phần trên cây lúa và bao chổ cắt của phần dưới bằng bông tẩm dd colchicine.
PP3: dùng dao rạch nhẹ từ trên xuống một đoạn dọc thân khoảng 2cm ngay trên ngọn bông lúa chưa trổ thành một khe nhỏ và đặt vào đó 1 miếng bông tẩm colchicine.
Ở pp 2 và 3 có thể pha colchicine trong dd glycerin 2% để tránh bay hơi.
Yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo cây
đơn bội trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn in vitro
a. Tuổi hạt phấn
Cây đơn bội chỉ thu được khi cấy bao phấn chứa hạt phấn ở giai đoạn phát triển thích hợp, bắt đầu từ thể 4 nhân cho đến ngay sau lần nguyên phân đầu tiên.
b. Mật độ bao phấn, hạt phấn
Phản ứng sinh trưởng trong nuôi cấy đơn bội bị chi phối bởi mật độ bao phấn, hạt phấn nuôi cấy trên môi trường và thay đổi tùy theo loài thực vật.
c. Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn và hạt phấn
Kết quả tạo cây đơn bội phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của cây bố, mẹ cho bao phấn, hạt phấn. Trạng thái sinh lý lại liên quan đến điều kiện môi trường mà cây sinh trưởng như: quang chu kỳ, cường độ ánh sáng, nhiệt độ và môi trường dinh dưỡng khoáng.
Khả năng thành công cao nhất với những bao phấn thu được trong lần trổ hoa đầu tiên và giảm dần trong những lần trổ hoa tiếp theo.
Sử dụng bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh sáng cao, ngày ngắn sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao hơn.
d.Tiền xử lý bao phấn và hạt phấn
Hiệu quả nuôi cấy bao phấn, hạt phấn cao hơn khi tiến hành xử lý mẫu trước khi cấy.
Xử lý Nhiệt độ lạnh đã làm tăng khả năng tạo mô sẹo và cây từ bao phấn, đồng thời cho phép bảo quản mẫu lâu hơn.
Bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh sáng cao, trong điều kiện ngắn ngày sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao hơn.
Ưu điểm và nhược điểm
Ưu
điểm

Nuôi cấy bao phấn:
Vì bao phấn có kích thước lớn nên thao tác dễ dàng.
Môi trường nuôi cấy đơn giản.
Nuôi cấy hạt phấn:
Tạo ra giống cây trồng sạch bệnh.
Giống tạo ra có phẩm chất di truyền đồng đều.
Phát sinh phôi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy.
Tạo cây đơn bội thuận lợi cho việc nghiên cứu di truyền.
Tóm lại, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ra đời đã làm giảm thời gian, đồng thời làm tăng vọt số lượng các cá thể đơn bội thu được.

Nuôi cấy hạt phấn:
Khó thao tác do hạt phấn có kích thước nhỏ.
Các giai đoạn phát triển của hạt phấn không đồng đều nên hiệu suất tạo cây đơn bội không cao.
Hạt phấn là vật liệu quan trọng để gây đột biến và chuyển nạp gen, tuy nhiên nó ít được sử dụng vì làm giảm tỉ lệ tái sinh cây
Nuôi cấy bao phấn:
Khó sàng lọc cây đơn bội.
Khi nuôi cấy bao phấn thường gặp hiện tượng bạch tạng
Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tạo cây đơn bội phức tạp, phụ thuộc nhiều yếu tố: tuổi hạt phấn, trạng thái sinh lý của bao phấn và hạt phấn, kiểu gen, kinh nghiệm…
Nhược
điểm
Thành tựu và hiện trạng

Các cây đơn bội có nguồn gốc hạt phấn đã được tạo ra ở 216 loài thuộc 78 giống, 31 họ và nhiều loài khác cũng được nghiên cứu thành công (Hu và Zhang, 1985).
Thông qua nuôi bao phấn đã tạo các giống lúa thuần như Khao 85, Khao 1105, VH2. Đặc biệt thông qua chọn dòng tế bào soma thu được các giống DR1, DR2, DR3 đang mở rộng ra qui mô sản xuất. Kết hợp biến dị tế bào soma với gây đột biến đã tạo giống lúa KDM39. Trong nghiên cứu lúa lai đang áp dụng kỹ thuật lai xa, cứu phôi, đột biến tạo dòng TGMS và CMS mới.
Thành tựu:
Trong lĩnh vực nông nghiệp, các kết quả nghiên cứu về công nghệ tế bào - mô phôi thực vật giúp chúng ta nhanh chóng tạo ra các giống cây trồng thuần. Hàng loạt dòng thuần ở lúa (ĐV2, MT4, DT26...) đã được tạo ra bằng kĩ thuật đơn bội nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn. Đặc biệt, chúng ta đã sản xuất được dòng lúa thuần mang gene quý như gene bất dục đực tế bào chất, bất dục đực nhân (gen TGMS, PGMS). Đối với ngô, đã tạo được 5 dòng ngô thuần và hai tổ hợp ngô lai có triển vọng.
Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào phát triển nhanh và ngày càng hiện đại mở tiềm năng to lớn cho cho nuôi cấy bao phấn hạt phấn tạo cây đơn bội từ đó tạo dòng thuần, đáng chú ý là ở các đối tượng có tầm quan trọng như: lúa gạo, lúa mạch, đại mạch, thuốc lá, ngô, khoai tây,….
Hiện trạng :
Hiện tại người ta mới nuôi cấy hạt phấn trưởng thành để tạo cây đơn bội thành công qua con đường phôi hoá, hoặc tạo thành mô sẹo, từ đó tạo cây đơn bội. Còn nuôi cấy hạt phấn non chưa đạt được nhiều hiệu quả, hiện tại chỉ có một số kết quả về nuôi cấy hạt phấn non thành công như nuôi cấy hạt phấn non cây Trillium electum (Saparov và cs,1955), cây hành Allium cepa (Vasil,1959), ở cây Atropa belladonna (Bajaj,1974).
Hầu hết các cây ngũ cốc và các cây họ đậu nuôi cấy bao phấn rẩt khó thành công hoặc tỉ lệ thành cây thấp, tỉ lệ cây bạch tạng cao.
Nhiều gen có khả năng thành cây thấp thường không được ứng dụng trong nuôi cấy bao phấn nhưng có khi gen lại có giá trị kinh tế cao. Ví dụ cấy bao phấn giống lúa Japonica dễ thành công hơn hơn giống lúa Indica, tuy nhiên giống Indica lại có vai trò quan trọng hơn nhiều giống Japonica
THANK YOU VERY MUCH