CADN

Bài tiểu luận: Lập thư viện cADN
Nhóm sinh viên thưc hiên:
1. Trần Thị Vân Anh 6. Trần Trung Hiếu
2. Trần Xuân Bách 7. Nguyễn Quang Huy
3. Trương Thị Hải 8. Cấn Thị Khánh Huyền
4. Hà Minh Hiền 9. Hoàng Thị Thu Hường
5. Phùng Thị Thu Hiền 10. Hoàng Thị Yến
Khái quát chung
Ngày nay trái đất đối mặt với biến đổi khí hậu. Thay đổi khí hậu sẽ làm thay đổi mức độ thiệt hại của khô hạn, ngập úng, ngập mặn, nhiệt độ cao, tác hại của sâu bệnh. Chiến lược phát triển chung của ngành nông nghiệp thế giới là sẽ tập trung vào những nội dung sau: làm cho cây trồng thích ứng với biến đổi khi hậu; cải tiến năng suất vượt trội; tạo nền tảng đa dạng di truyền...
Để làm được những điều ấy người ta phải thực hiện nghiên cứu trình tự genom, cải tiến phương pháp đánh giá kiểu hình, áp dụng các kĩ thuật di truyền và đặc biệt là xây dựng thư viện cDNA
Trong nội dung của Hội nghị quốc tế lần thứ 6 ở ĐBSCL đã chỉ rõ: nước nào xem nhẹ công tác ngân hàng gen nước đó sẽ phải đối mặt với rất rất nhiều khó khăn trong công tác chọn giống trong tương lai
Thư viện cDNA giúp chúng ta có được các dòng cDNA mã hóa liên tục của một gen, tìm ra chúng một cách dễ dàng.
Nhận thấy tầm quan trọng của đề tài chúng tôi xin trình bày những hiểu biết của mình về Thư viện cDNA
Tổng quan đề tài
I, Thư viện cDNA là gì?
1, Khái niệm
2, Các bước tổng hợp cDNA
3, Các bước lập thư viện cDNA
4, Ưu điểm của việc lập thư viện cDNA
II, Thành tựu
I. Thư viện cDNA (c-DNA library) là gì?

1. Khái niệm
cDNA (complementary DNA) có nghĩa là ADN bổ trợ.
ADN bổ trợ chính là ADN đựơc tổng hợp từ ARN thông tin( messenger RNA hay m- RNA) duới sự xúc tác của enzim phiên mã nguợc (reverse transcriptase).
Thư viện cADN chính là tập hợp lưu trữ các ADN bổ trợ được tổng hợp từ các ARN thông tin.
Là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mARN của một tế bào. Không giống với thư viện bộ gen thư viện cDNA được thiết lập từ một tế bào xác định. Trong đó gen cần nghiên cứu phải biểu hiện thành mARN
Thường nguời ta thiết lập thư viện cADN trên vectơ thực khuẩn thể lambda( vectơ chèn) trong truờng hợp cần lập thư viện cADN tổng thể, hay vectơ plasmid trong truờng hợp cần lập thư viện cADN hạn chế.
Thư viện cADN thường được lập cho eukaryote
1.Các buớc chính để tổng hợp cDNA
1. Tổng hợp sợi thứ nhất bằng enzyme reverse transcriptase ( enzim phiên mã nguợc).
2. Biến tính và cắt RNA trong thể lai mRNA-cDNA tuần tự bằng nhiệt và enzyme RNase H của E. coli. Thay thế khuôn mẫu là chuỗi RNA bằng chuỗi cDNA thứ nhất và tổng hợp sợi cDNA thứ hai nhờ DNA polymerase I của E. coli.
3. Cắt vòng cặp tóc của cDNA sợi đôi nhờ nuclease S1 và sửa chữa hai đầu bằng đoạn Klenow.
(1). Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất
ARN thông tin của sinh vật bậc cao thuờng có đuôi (3’ end) là một chuỗi các gốc A (poly-A). Như vậy mồi để tổng hợp sẽ là một chuỗi các gốc T ( oligo-dT). Enzim xúc tác quá trình này là enzim phiên mã nguợc (reverse transcriptase). Nguyên liệu: dNTP ( bao gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
. Có thể tóm tắt quá trình làm như sau:
Người ta tách riêng mARN nhờ các tổ hợp ologonucleotid chỉ chứa deoxythimidin (Oligo dT). Người ta gắn các oligo (dT) trong phiễu chiết. Sau đó chiết xuất toàn bộ ARN của tế bào gồm rARN, tARN, mARN rồi cho hỗn hợp này chảy qua phễu có gắn xellulo-oligo (dT)
Các mARN sẽ bị giữ lại trong phễu do hình thành liên kết bổ sung A-T. Sau đó ta dùng dung dịch muối NaCl để đẩy tARN và mARN ra khỏi phễu. Cuối cùng dung dịch đệm Tris EDATA cho chảy qua phễu, các mARN sẽ được giải phóng do liên kết A-T bị phân giải. Dùng mARN này làm khuôn với sự có mặt của enzyme sao chép ngược cùng với các nguyên liệu , quá trình tổng hợp DNA sẽ xảy ra, kết quả sẽ thu được cDNA.
(1). Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất
Sau khi tổng hợp xong sợi 1 của ADN bổ trợ, lúc này sợi 1 của ADN bổ trợ vẫn còn kết cặp với ARN thông tin bởi liên kết hydro ( hỗn hợp 2 sợi ARN và ADN này gọi là heteroduplex)
Nguời ta gây biến tính (đun sôi) thể lai mRNA-cDNA để cắt RNA bằng RNase H của E. coli tại một số điểm ngẫu nhiên nào đó.
Xử lý enzim Rnase-H để làm đứt sợi m-RNA trong cặp heteroduplex bao gồm m-RNA + cADN sợi 1
(2). Tổng hợp sợi cADN thứ 2
Thông thường, đầu tận cùng 3’ của các cDNA sợi đơn có khả năng tạo thành các cấu trúc vòng cặp tóc (hairpin loop) và vì thế có thể được sử dụng để làm mồi (primer) cho quá trình tổng hợp sợi cDNA thứ hai bằng DNA polymerase I của E. coli hoặc reverse transcriptase .
Đoạn Klenow của DNA polymerase I thiếu hoạt tính exonuclease 5`-3` cũng được sử dụng thành công để tổng hợp sợi cDNA thứ hai.
(3). Cắt vòng cặp tóc của cDNA sợi đôi
Sau khi tổng hợp cDNA hoàn toàn, sợi thứ nhất và thứ hai được liên kết cộng hóa trị bởi vòng cặp tóc và vòng cặp tóc dễ bị cắt bởi nuclease S1. Sau đó, đoạn cDNA được sửa chữa bằng enzyme Klenow,kết quả là hai đầu tận cùng là đầu bằng.
Sợi đôi cDNA sau đó được tách thành các tiểu phần theo kích thước và các phân tử lớn nhất được gắn vào các plasmid của vi khuẩn. Hoặc là một tập hợp đầy đủ các kích thước của cDNA sợi đôi được tạo dòng trong bacteriophage l để xây dựng thư viện cDNA (cDNA library).
Tuy nhiên, việc đưa các đầu bằng vào vector sẽ gây khó khăn trong việc lấy chúng ra khỏi vector một cách nguyên vẹn sau này. Do đó các linker thường được nối vào hai đầu của các cDNA nhờ DNA ligase. Linker là những đoạn nucleotide ngắn có chứa vị trí nhận biết của một loại RE (ví dụ: EcoRI) được tổng hợp nhân tạo tương ứng với vị trí nhận biết RE (ví dụ: EcoRI) của vector. Sau đó, các cDNA mang linker và vector sẽ được cắt bởi cùng một enzyme (ví dụ: EcoRI). Nhờ đó các cDNA và vector đều có đầu sole tương đồng (đầu dính) và cDNA sẽ dễ dàng gắn cũng như lấy ra khỏi vector một cách nguyên vẹn.
3. Các bước lập thư viện cADN trong bacteriophage l vector
1. Chọn lọc kích thước của cDNA
2. Gắn các cDNA với các nhánh của bacteriophage l
3. Phân tích các đoạn chèn cDNA
4. Tạo thư viện cDNA hoàn chỉnh
5. Khuếch đại thư viện cDNA
(1). Chọn lọc kích thước của cDNA

cDNA sau khi cắt hạn chế được phân đoạn bằng sắc ký cột Sepharose để loại bỏ những linker thừa và các phân tử cDNA có kích thước nhỏ hơn 500 bp. Cột sắc ký thường có kích thước 27´0,3 cm thích hợp cho việc phân đoạn các cDNA.
(2). Gắn các cDNA với các nhánh của bacteriophage l
Thông thường cần phải tiến hành thử một loạt các phản ứng gắn và phản ứng đóng gói. Trong các phản ứng này, một lượng không đổi của các nhánh bacteriophage l được gắn với các lượng khác nhau của cDNA, mục đích là để xác định lượng cDNA tạo ra ít nhất là 5´ 106 bacteriophage tái tổ hợp.
Phản ứng gắn cần được thiết kế sao cho tối thiểu một bacteriophage tái tổ hợp đơn sẽ chứa nhiều hơn một phân tử cDNA bằng cách dùng tỷ lệ của các nhánh được phosphoryl hóa và cDNA để chỉ 5% bacteriophage được tái tổ hợp. Nếu sử dụng các nhánh dephosphoryl hóa, thì các bacteriophage không tái tổ hợp bị ức chế hiệu quả, và vì thế không thể xác định lượng cDNA cần thiết để tạo ra một quần thể bacteriophage chứa 5% thể tái tổ hợp.
(3). Phân tích các đoạn chèn cDNA
Thu thập khoảng mười hai plaque của bacteriophage tái tổ hợp và chuẩn bị DNA để cắt bằng RE thích hợp.
Phân tích kích thước của các đoạn chèn cDNA bằng điện di trên agarose gel 1%, dùng DNA marker có các đoạn từ 500 bp tới 5 kb.
Nếu các bacteriophage tái tổ hợp chứa các đoạn chèn có kích thước khác nhau và nếu kích thước trung bình của chúng xấp xỉ 1 kb hoặc lớn hơn, thì có thể tiến hành các bước tiếp theo (ví dụ: tạo ra thư viện cDNA hoàn chỉnh).
Nếu kích thước trung bình của các đoạn chèn nhỏ hơn 1 kb một cách rõ rệt, thì chất lượng của thư viện là không cao. Trong trường hợp này cần quay lại phân tích chất lượng của mRNA khởi đầu và các phản ứng tổng hợp cDNA.
(4). Tạo thư viện cDNA hoàn chỉnh
Nếu sử dụng các nhánh dephosphoryl hóa để xây dựng thư viện cDNA, thì tính toán lượng cDNA cho kết quả tăng gấp 10 lần số lượng của các plaque không tái tổ hợp. Nếu sử dụng các nhánh phosphoryl hóa, thì tính toán lượng cDNA cho kết quả quần thể bacteriophage chứa xấp xỉ 5% các thể tái tổ hợp.
Thiết kế một phản ứng gắn quy mô lớn, tăng số lượng của tất cả các thành phần ở một tỷ lệ thích hợp.
Chắc chắn rằng thiết kế phản ứng gắn đối chứng chỉ chứa các nhánh của bacteriophage l mà không chứa cDNA. Đóng gói tất cả các hỗn hợp gắn bằng cách thiết kế một chuỗi các phản ứng gắn, mỗi phản ứng chứa 0,5 mg các nhánh của bacteriophage . Gộp các tiểu thể đóng gói và xác định độ chuẩn của bacteriophage gốc trên các chủng vi khuẩn thích hợp.
(5). Khuếch đại thư viện cDNA
Vector lgt10.
Để thiết lập một sự cung cấp lâu dài của thư viện, thì nó cần phải được khuếch đại bằng sự sinh trưởng trên chủng E. coli thích hợp (chẳng hạn chủng BNN102) trên đĩa agar. Nếu thư viện chỉ được sàng lọc một lần, bước khuếch đại này có thể bỏ qua và các bacteriophage có thể được dàn mỏng trực tiếp trên chủng BNN102 ở một mật độ tối ưu để tiến hành sàng lọc.
Vector lgt11 và các dẫn xuất của nó và lZAP, lZAPII. Các thư viện cDNA được xây dựng trong các vector biểu hiện lgt11, lgt18, lgt20 và lgt22 phải được khuếch đại trên chủng E. coli Y1090hsdR (hoặc nếu là vector lZAP thì trên chủng BB4, vector lZAPII thì trên chủng XL1-Blue). Các chủng này là không hoàn hảo cho sự cắt hạn chế kiểm soát vật chủ nhưng lại mang một hệ thống methyl hóa hoạt động. Các vị trí tiềm tàng cho phản ứng cắt hạn chế bằng hệ thống EcoK sẽ được methyl hóa trong suốt quá trình khuếch đại sao cho, nếu cần thiết, các thể tái tổ hợp có thể được dùng để gây nhiễm chủng E. coli khả biến-cắt hạn chế. Trong suốt quá trình khuếch đại, điều quan trọng là ức chế sản xuất các protein độc tố tiềm tàng bới các bacteriophage tái tổ hợp.
4. Ưu điểm
Các dòng cDNA chứa trình tự mã hóa liên tục của một gen.
Nhiều gen ở eukaryote là gián đoạn, có chứa nhiều đoạn intron. Sau khi cắt tiền thân mRNA (pre-mRNA) và nối lại, các đoạn intron đã bị loại và mRNA hoàn thiện (mature mRNA) có trình tự mã hóa liên tục được tạo thành. Do cDNA được phiên mã ngược từ khuôn mẫu mRNA hoàn thiện nên các dòng cDNA có thể tổng hợp protein cần thiết với số lượng lớn như mong muốn.
Nhiều protein được tổng hợp với số lượng lớn bởi những tế bào chuyên hóa và như vậy trong các tế bào này mRNA của protein đó sẽ có tỷ lệ cao và thư viện cDNA được tạo ra từ các tế bào này sẽ có nhiều cDNA mã hóa cho các protein tương ứng. Sự dồi dào cDNA của một vài loại mRNA nào đó làm giảm nhẹ đáng kể việc xác định đúng dòng mong muốn từ thư viện gen.
II.Những thành tựu đã đạt đựơc
Các nhà khoa học thuộc CIAT, Colombia và Nhật Bản đã hòan thành việc xây dựng thư viện cDNA có chiều dài phân tử đầy đủ, dưới điều kiện bình thường, nóng, khô hạn, độ độc nhôm, và những điều kiện sau thu họach làm tổn hại đến sinh lý cây trồng
Bản chất di truyền của genome khoai mì khá phức tạp với chu kỳ sinh trưởng dài, do đó việc cải tiến giống khoai mì rất ít thành công.
Áp dụng công nghệ sinh học để cải tiến giống khoai mì là một chiến lược năng động. Kiến thức cơ bản về các gen điều khiển chống chịu stress sẽ vô cùng cần thiết khi tiếp cận với công nghệ sinh học, thí dụ như chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) và chuyển nạp gen.
Thư viện cDNA của khoai mì là tiềm năng phục vụ cho các nhà khoa học cải tiến giống khoai mì về năng suất trong điều kiện canh tác bị stress phi sinh học; cung cấp chuỗi trình tự đầy đủ của các gen mục tiêu này và phát triển catalog của gen trong genome khoai mì.
Thành tựu ở nuớc ta
Viện di truyền nông nghiệp Việt Nam:
Cho tới năm 2007 viện đã thiết lập được 14 thư viện cDNA tổng, mỗi thư viện chứa khoảng 30-40 nghìn clone; thu được 12 thư viện cDNA chọn lọc cho các tính trạng kháng đạo ôn, rầy nâu, hạn, mặn, mỗi thư viện chứa khoảng 800-1.000 clone.
Tách dòng tổng cộng được 184 dòng gen hoạt động mạnh trong điều kiện cực đoan; giải mã trình tự ADN và xác định trình tự axit amin của 41 dòng gen hoạt động mạnh. Ngoài ra kết quả đối chiếu với Ngân hàng gen cho thấy tất cả 41 dòng gen trên đều có vị trí xác định trên các clone genomic, BAC và PAC, trong đó có nhiều dòng gen có độ đồng nhất cao (trên 90%) với các clone cDNA của Ngân hàng Gen đã biết rõ chức năng.
Đã xác định được 4 dòng gen “kháng đạo ôn”, 2 dòng gen “kháng rầy nâu”, 2 dòng gen “chịu hạn”, và 3 dòng gen “chịu mặn” có thể được thiết kế thành chỉ thị phân tử tiềm năng phục vụ công tác tạo giống lúa.