Các phương pháp sắc kí

CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ
THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PROTEIN
Lê Thị Hồng Chuyên
Dương Minh Thạnh
Nguyễn Thị Đan Thuỳ
Nguyễn Thị Thu Trang
Nhóm thực hiện:
Khi đã có nguồn cung cấp protein, việc tiếp theo là tinh sạch và xác định tính chất của nó. Quá trình trên được thực hiện theo sơ đồ:
Kĩ thuật sắc kí
(Chromatography)
Bản chất: tách và thu nhận riêng biệt các phân tử protein có tính hấp phụ khác nhau (trừ phương pháp lọc gel) trên chất mang thích hợp nhồi trong cột sắc kí
Ra đời: Tswett, nhà thực vật học Nga, phân tách các hạt sắc tố (pigments) thực vật với 2 pha lỏng-rắn
Chromatography
SEC-Size exclusion Chro.
(Gel permeation Chro.)
(Gel filtration Chro.)
IEC-Ion exchange Chro.
Affinity Chro. – IAC
Hydrophobic Chro.
IE - HPLC
HPAC – HPIAC
RP – HPLC
EBC - Expanded bed Chro.
Membrane Chromatography
HP
Nguyên tắc
Pha động
(Mobile phase)
Pha tĩnh
(Stationary phase)
1. Sắc kí lọc gel
(Gel Permeation Chromatography
Size Exclusion Chromatography)
Bản chất: Sự tách riêng biệt các phân tử protein dựa trên sự khác biệt về hình dạng và MW, khi hỗn hợp protein di chuyển dọc theo nền chất mang có kích thước lỗ qui định theo cơ chế thẩm thấu.
 sự khuyếch tán chọn lọc
Column
Φ= 10mm. L= 500-1000mm
Các hạt polymer có kích thước xác định

Dextran: Sephadex G & Sephacryl S (Pharmacia)
Polyacrylamide: Bio-Gel P (Bio-Rad)
Agarose: Sepharose CL & Superose (Pharmacia) hay Biogel A (Bio-Rad).
Polyacrylamide-agarose: Ultrogel AcA (LKB Instruments)
Ethylene glycol-methacrylate: Fractogel HW (Toyo Soda Company-TSK
……………..
Dung môi được đưa vào cột với tốc độ 1 ml/phút, áp suất 50 - 200 bar
Tăng qui mô  tăng Φ cột nhưng vẫn giữ small depth  tăng số cột
Kết quả thường làm loãng  cô đặc
2. Sắc kí trao đổi iôn
(IEC -Ion Exchange Chromatography)
Bản chất: dựa trên sự tương tác hấp dẫn ion thuận nghịch giữa protein và nền chất trao đổi ion ở giá trị pH qui định.
Anion Exchange Chromatography (AEC)

anion exchange resins are Q-resin, a Quaternary amine; and DEAE resin, DiEthylAminoEthane.
primary step (high capacity 10 - 100 mg/ml)
pH= 7 -10
- Buffer A = 20 mM Tris, pH= 8
- Buffer B = 20 mM Tris, 1 M NaCl, pH= 8
Protein khó tan/ pI cao
- Buffer A = 30 mM Ethanolamine, 8M urea, pH=10.0
- Buffer B = 30 mM Ethanolamine, 8M urea, 1 M NaCl, pH=10.0
Chạy dung dịch theo gradient với nồng độ muối tăng dần đến 1M NaCl.
Cation Exchange Chromatography (CEC)

cation exchange resins are S-resin & CM resin
primary step (high capacity)
Ít phổ biến bằng AEC (P không gắn resin ở pH sinh lí  chuẩn pI)
pH= 4 – 7
Buffer A = 30 mM sodium acetate, pH=4.5
Buffer B = 30 mM sodium acetate, 1 M NaCl, pH=4.5
Chạy dung dịch theo gradient với nồng độ muối tăng dần đến 1M NaCl
Cải tiến
Kết hợp chất mang lọc gel và TĐ ion
VD: DEAE sephadex & DEAE sephacel
Hãng Merk:
chất mang trao đổi ion nền Fractogel
 sản xuất công nghiệp.
chất TĐ ion kiểu tua: tay nối mềm là mạch polymer (oligoacrylamide) chứa nhóm –OH  nền silicagel/ polymer hữu cơ có độ cứng cơ học cao hơn nhiều
3. Sắc kí kị nước
(Hydrophobic Chromatography)
Bản chất: dựa trên tương tác giữa các nhóm chức có tính kị nước nằm trên bề mặt phân tử protein (thường là các a.a có tính kị nước) và chất mang thường là mạch hydrocarbon 8-18 nguyên tử C.
4. Sắc kí ái lực
(Affinity Chromatography)
Bản chất: dựa trên khả năng gắn rất đặc hiệu của phân tử protein trên bề mặt hạt chất mang thông qua những tay nối ligand đặc hiệu.
Ứng dụng cột AC Sephadex G75 để tinh chế Concanavalin A từ hạt đậu rựa trồng ở VN
Nguyễn Vǎn Lợi - Đào Kim Chi- Nguyễn Thị Thanh Loan - Đỗ Ngọc Liên
Trường đại học Dược Hà Nội-Trường đại học Khoa học tự nhiênI

Lectin:
Protein ( chủ yếu glycoprotein)
Động vật, thực vật, vi sinh vật & người
Nhiều đặc tính hoá sinh quan trọng :
khả nǎng tương tác và nhận biết các loại tế bào
liên kết đặc hiệu của lectin với các glycoprotein
 miễn dịch học, y dược: chẩn đoán ung thư, chẩn đoán và phòng ngừa bệnh suy giảm miễn dịch AIDS.
lectin thuộc các họ đậu (Fabaceae) và họ dâu tằm (Moraceae) có nhiều tiềm nǎng ứng dụng
Tách chiết, tinh chế Concanavalin A (Con. A) từ hạt đậu rựa trồng ở Việt Nam (Canavalia ensiformis)
5. Sắc kí lỏng cao áp
(HPLC- High Performance Liquid Chro.)
Tốc độ phân tách cực tốt, thường chỉ vài phút/ mẫu.(excellent fractionation speeds, often just minutes per sample)
Độ phân giải peak rất cao.(superior peak resolution)
Mức độ tự động hoá cao.(high degree of automation, including data analysis)
So sánh với mẫu chuẩn cho phép xác định chính xác MW của sản phẩm và các tạp chất.
Sự thay đổi theo mẻ (batch-to-batch) cũng được đánh giá qua việc so sánh sắc kí đồ.
Cột có Φ nhỏ 2-5mm, được nhồi bởi các hạt nhỏ 3-50μm cho phép thiết lập cân bằng nhanh giữa MP và SP.

Áp suất cao 300atm để đạt tốc độ dòng chảy vài ml/phút.

Lượng mẫu đưa vào: 20μg

Tr (thời gian lưu): đưa mẫu vào xuất hiện peak của mẫu trên sắc kí đồ.


Normal phase:pha tĩnh phân cực cao hơn độ phân cực của dung môi pha động.
RP-HPLC: dựa vào sự khác nhau về tính kị nước trên bề mặt phân tử. Pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha động có độ phân cực cao hơn.
- Pha tĩnh: Silica hay polymer, nối với phân tử kị nước(hydrophobic arm) (thường là nhóm butyl, octyl và octadecyl).
- Pha động:pha trộn giữa nước và một vài dung môi hữu cơ phân cực như acetonitrile
- Có thể phát hiện sự khác nhau ở 1 a.a
- Sự tương tác với pha tĩnh mang tính kị nước cao có thể làm biến tính P không hồi tính được, tạo peak giả trên sắc kí đồ.
SE-HPLC: kích thước và hình dạng.
Pha tĩnh: nền (support) silica và agarose với kích thước lỗ xác định.
Thường dùng để phân tích sự hiện diện của ≥ dimer với monomer hay hay các sản phẩm phân giải protein.
Ion Exchange-HPLC: được tiến hành dựa trên sự thay thế những ion trong mẫu với những ion trái dấu trong pha tĩnh. Khi đó pha tĩnh sẽ giữ lại mẫu và pha động di chuyển qua cột sẽ thế chỗ cho ion mẫu và đẩy mẫu ra khỏi cột.
Sắc kí trên hydroxyapatite
Cơ chế: tách phân tử protein trên nền hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2)
Tinh sạch Murine IgG1 sử dụng UNOsphere™ S and CHT™ Ceramic Hydroxyapatite Chromatography
Henry Lai, PhD, and Samuel G Franklin, PhD, Bio-Rad Laboratories, Inc., 2000 Alfred Nobel
IgGs
SK truyền thống:
protein A chromatography step + IEC/ HIC steps (Jiskoot et al. 1989, Godfrey et al. 1993, Shadle et al. 1995, Ford et al. 2001).
Protein A chromatography
Ưu điểm: độ tinh sạch cao
Nhược điểm:
1) không tách được các đồng phân của IgG
2) lẫn tạp protein A  thêm 1 bước loại bỏ
3) protein A đắt hơn SK trao đổi ion và KS trên nền hydroxyapatite.
UNOsphere S chromatography and CHT ceramic hydroxyapatite chromatography.  đơn giản hơn và tránh tạp nhiễm
UNOsphere S (crylamido and vinylic copolymers) là chất trao đổi cation mạnh  khả năng gắn kết protein cao & áp lực lên cột thấp  có thể thu hồi và tái sử dung resin
Chất nền CHT ceramic hydroxyapatite: Ca2+ & PO4 3- với cấu trúc hình cầu và ceramic  tính chọn lọc và độ phân giải cao.
Small-Scale
analytical column (0.7 x 5 cm)
scale-up
preparative column (2.2 x 20 cm)
6. Sắc kí nền mở rộng
(EBC-Expanded Bed Chromatography)
Cột sắc kí truyền thống: chất nền được nhồi chặt
 cột bị tắt, giảm tốc độ dòng chảy  phải tăng áp suất nén, làm giảm hiệu suất tách và kéo dài QT tách thành nhiều công đoạn (nhất là khi tách protein trực tiếp từ dịch lên men)
EBC: hệ đệm được bơm từ dưới đáy nền chất mang
 giảm tối đa tắt cột, giảm thời gian thao tác & số công đoạn thực hiện (nhất là trong hệ SK tách protein ở qui mô sản xuất)
Hạt chất nền: thủy tinh xốp và perfluoropolymer 1.1-1.3 g/ml, Φ= 100-300 μm. Hạt to nằm bên dưới cột, hạt nhỏ hơn nằm phía trên tạo điều kiện tách dễ dàng hơn.

Storage,
bed stabilisation under expansion,
equilibration,
loading of unclarified fermented broth,
washing of the bed and
elution and regeneration


Sắc kí màng
(Membrane Chro.)
Bản chất:
màng xốp vi lọc.
ligand  gắn vào mặt trong của lỗ xốp.
Ligand: tính trao đổi ion/tính kị nước/ tính ái lực.
So với KT sắc kí trên chất nền  nhanh hơn ~ 10 lần
KT truyền thống  protein di chuyển theo đối lưu + khuyếch tán ra các lỗ xốp  chậm hơn
KT màng  protein chỉ di chuyển theo dòng đối lưu.
 thuận lợi cho QT tách ở mức độ sản xuất
Scalable High Performance Membrane Chromatography

Sartobind® Membrane Chromatography
high flow rates with excellent dynamic binding in a ready to use,
durable, disposable format that permits easy scalability from lab to production.
Removal of contaminants such as DNA, endotoxin, viruses and host cell proteins are typical applications.
CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ THEO DÕI
Given below is a schematic representation of the typical steps involved in processing human leukocyte interferon produced by recombinant DNA techniques. This will give you an idea of where exactly affinity chromatography is usually involved in the realm of bioprocessing.
 
HUMAN LEUKOCYTE INTERFERON
|
E. coli EXTRACTION BY MECHANICAL BREAKAGE
|
POLYETHELYNEIMINE PRECIPITATION
|
AMMONIUM SULFATE PRECIPITATION OF SUPERNATENT
|
DIALYSIS OF PELLET
|
* IMMUNOADSORBENT COLUMN (MONOCLONAL ANTIBODIES)
|
CATION EXCHANGE CELLULOSE CHROMATOGRAPHY

Kaumudi M. Bhawe
(Biochemical Engineering Term Project - Fall 1997.)