BÔ TRỢ KIẾN THỨC SINH 12

Bản chất của vật chất di truyền
I. DNA là vật chất di truyền
Acid nucleic có 2 loại là desoxyribonucleic (DNA) và ribonucleic (RNA). Nhiều sự kiện gián tiếp cho thấy DNA là chất di truyền.
1. Các chứng minh gián tiếp
- DNA có trong tế bào của tất cả các vi sinh vật, thực vật, động vật chỉ giới hạn ở trong nhân và là thành phần chủ yếu của nhiễm sắc thể. Đó là một cấu trúc mang nhiều gen xếp theo đường thẳng.
- Tất cả các tế bào dinh dưỡng của bất kỳ một loại sinh vật nào đều chứa một lượng DNA rất ổn định, không phụ thuộc vào sự phân hóa chức năng hoặc trạng thái trao đổi chất. Ngược lại, số lượng RNA lại biến đổi tùy theo trạng thái sinh lý của tế bào.
- Số lượng DNA tăng theo số lượng bội thể của tế bào. Ở tế bào sinh dục đơn bội (n) số lượng DNA là 1, thì tế bào dinh dưỡng lưỡng bội (2n) có số lượng DNA gấp đôi.
- Tia tử ngoại (UV) có hiệu quả gây đột biến cao nhất ở bước sóng 260nm. Đây chính là bước sóng DNA hấp thu tia tử ngoại nhiều nhất.
Tuy nhiên trong các số liệu trên, thành phần cấu tạo của NST ngoài DNA còn có các protein. Do đó cần có các chứng minh trực tiếp mới khẳng định vai trò vật chất di truyền của DNA.
2. Thí nghiệm biến nạp DNA ( Transformation)
Vi khuẩn Diplococcus pneumoniae có hai dạng:
- Dạng S (gây bệnh): có vỏ bao tế bào bằng polysaccharid, ngăn cản bạch cầu phá vỡ tế bào và tạo khuẩn lạc láng trên môi trường agar.
- Dạng R (không gây bệnh) không có vỏ bao tế bào bằng polysaccharid và tạo khuẩn lạc nhăn.
Thí nghiệm:
a. Tiêm vi khuẩn dạng S sống gây bệnh cho chuột, sau một thời gian nhiễm bệnh, chuột chết
b. Tiêm vi khuẩn dạng R sống không gây bệnh cho chuột, chuột sống
c. Tiêm vi khuẩn dạng S bị đun chết cho chuột, chuột chết
d. Tiêm hỗn hợp vi khuẩn dạng S bị đun chết trộn với vi khuẩn R sống cho chuột, chuột chết. Trong xác chuột chết có vi khuẩn S và R.
Đến 1944, T. Avery, Mc Leod, Mc Carty tiến hành thí nghiệm xác định tác nhân gây biến nạp:
- Nếu tế bào S bị xử lý bởi protease hoặc ARNase thì hoạt tính biến nạp vẫn còn, chứng tỏ RNA và protein không phải là tác nhân gây bệnh.
- Nếu tế bào chết S bị xử lý bằng ADNase thì hoạt tính biến nạp không còn nữa, chứng tỏ DNA là nhân tố biến nạp.
DNA của S + tế bào R sống  chuột chết (có S, R )
Thí nghiệm biến nạp ở chuột
3. Sự xâm nhập của DNA virus vào vi khuẩn
Năm 1952, A. Hershey và M. Chase tiến hành thí nghiệm với bacteriophage T2, xâm nhập vi khuẩn E.coli nhằm xác định xem phage nhiễm vi khuẩn đã bơm chất nào vào tế bào vi khuẩn: chỉ DNA, chỉ protein hay cả hai.

Thí nghiệm này đã được chứng minh trực tiếp rằng DNA của phage T2 đã xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và sinh sản để tạo ra thế hệ phage mới mang tính di truyền có khả năng đến nhiễm vào các vi khuẩn khác.
Vật chất di truyền của phage là DNA

Sự xâm nhập DNA của virus vào vi khuẩn
II. Thành phần và cấu tạo hóa học của acid nucleic
DNA và RNA là những hợp chất cao phân tử. Các đơn phân là các nucleotid.
Mỗi nucleotid gồm ba thành phần
- H3PO4
- Đường desoxyribose (DNA ), ribose ( RNA)
- Bazơ nitơ
DNA RNA
+ Purin Adenin (A) Adenin (A)
Guanin (G) Guanin (G)
+ Pyrimidin Cytosin (C) Cytosin (C)
Timin (T) Uracin (U)

Mối liên kết hydro giữa A-T và G-C
DNA
1.1. Cấu tạo hóa học của DNA
+ số lượng A =T, G =X
+ Tỉ số A + T
G + X
đặc trưng cho mỗi loài sinh vật.
Theo nghiên cứu Wilkins và Franklin:
+ Các purin và pyrimidin có cấu trúc phẳng, mặt phẳng được xếp vuông góc với trục dài của mạch polynucleotid cái này xếp chồng lên cái kia, khoảng cách trung tâm giữa hai mặt phẳng kề nhau là 3,4Ao
+ Mạch polynucleotid xoắn thành lò xo quanh trục giữa, mỗi bước xoắn là 34Ao ( ứng với 10 nu)
+ DNA có nhiều hơn một mạch polynucleotid.
Sự bắt cặp bổ sung của các base của hai mạch đơn
Mô hình cấu trúc phân tử J. Watson và F. Crick (Dạng B)
+ Gồm hai chuỗi polynucleotid xoắn song song ngược chiều quanh một trục chung.
+ Các gốc base quay vào phía trong của vòng xoắn, các gốc H3PO4, pentose quay ra ngoài tạo phần mặt của hình trụ.
+ Khoảng cách giữa các cặp base là 3,4 A0, lệch nhau một góc 360
+ Chiều cao của mỗi vòng xoắn là 34 Ơ , và đường kính là 20 Ơ.
+ Hai chuỗi polynucleotid gắn với nhau qua liên kết hydro được hình thành giữa các cặp base đứng đối diện nhau theo NTBS. A chỉ liên kết với T và G chỉ liên kết với X.
A + G = T + X (quy luật Chargaff).
+ Biết thành phần, trật tự sắp xếp của các nucleotid trên chuỗi này sẽ suy ra thành phần, trật tự sắp xếp của các nucleotid trên chuỗi kia
Ngoài DNA dạng B, còn nhiều dạng xoắn phải khác (A, C, D, Z ...).
Điển hình mô hình dạng B của Watson-Crick, là dạng xoắn phải với trục đều
Mô hình dạng Z, là dạng xoắn trái với trục không đều.
Mô hình dạng B
Mô hình dạng Z
1.2. DNA cuộn lại trong tế bào
Hầu hết trong cơ thể sinh vật, DNA có chiều dài dài hơn rất nhiều lần so với chiều dài của tế bào.
Ví dụ: phage T2 có chiều dài tế bào khoảng 0,16 m, trong khi chiêu dài DNA của chúng khoảng 50 m.
Các dạng thẳng, vòng tròn và xiêu xoắn của DNA
DNA có thể ở 3 dạng cấu trúc:

Dạng siêu xoắn: mạch kép vặn xoắn lại thành hình số 8. Đây là dang tự nhiên ở vi khuẩn.

Dạng vòng tròn: sợi DNA căng tròn có được do DNA siêu xoắn bị cắt đứt 1 trong hai mạch kép.

Dạng thẳng: khi DNA bị cắt đứt cả hai mạch.


Mô hình về bộ gen của E .coli
2. RNA
RNA có cấu tạo từ các đơn phân là các ribonucleotid.
Mỗi ribonucleotid gồm ba thành phần: đường ribose, H3PO4, bazơnitric.
Trong tế bào có ba loại RNA: rARN, mARN, tARN.

2.1. rARN:
* chiếm khoảng 75% của tổng RNA trong tế bào.
- Eukaryota : ribosome có hệ số lắng khi ly tâm là 80S, gồm hai đơn vị:
+ Đơn vị lớn ( 60S) có rARN 25S; 5,8S; 5S
+ Đơn vị nhỏ (40S) có rARN 28S
- Prokaryota và lục lạp có hệ số lắng khi ly tâm là 70S, gồm 2 đơn vị:
+ Đơn vị lớn (50S): có loại rARN 23S; 5S; 4,5S
+ Đơn vị nhỏ (30S): có rARN 16S
- Ty thể: ribosome có hệ số lắng khi ly tâm là 70S, gồm 2 đơn vị:
+ Đơn vị lớn 50S: có loại rARN 24S; 5S
+ Đơn vị nhỏ 30S: có rARN 18,5S
* rARN có cấu trúc bậc I và cấu trúc bậc hai.
* rARN có cấu tạo là một sợi xoắn có nhiều vùng liên kết đôi theo nguyên tắc bổ sung A liên kết với U, G liên kết với X và có khi G liên kết với U.
2.2. RNA vận chuyển ( tRNA)
- Có hơn 20 loại tARN khác nhau tuơng ứng với 20 loại acid amine khác nhau.
- Các tARN cùng tham gia vận chuyển một acid amin là các izoaceptor.
- Cấu trúc bậc I của tARN: có phân tử lượng nhỏ: 25.000-30.000, gồm 75-90 nucleotid, có hằng số lắng 4S. Có khoảng 10% các nucleotid hiếm với khoảng 30 loại khác nhau. Chuỗi polynucleotid cuộn lại có những đoạn tạo mạch xoắn kép, hình thành cấu trúc bậc hai của tARN.
- Các tARN có một số đặc tính cấu trúc chung: chiều dài khoảng 73-93 nucleotid, cấu trúc gồm một mach cuộn lại như hình lá chẻ ba nhờ bắt cặp bên trong phân tử. Đầu mút 3’ có trình tự kết thúc là CCA, amino acid luôn gắn vào đầu này. Đầu 5 chứa gốc phosphate của G.
Mỗi tARN có có 4-5 vùng với chức năng khác nhau:
- Vòng DHU: có chứa nucleotid dihydrouridin, vùng này có chức năng nhận biết aminoacyl tARN synthetase
- Vòng anticodon: đọc mã trên mARN theo nguyên tắc kết cặp anticodon – codon.

Cấu trúc của tARN
- Vòng phụ: có thể không có ở một số RNA.
- Vòng TφC: có chứa nucleotid pseudouridin, vùng này có chức năng nhận biết ribosom để vào đúng vị trí tiếp nhận aminoacyl tARN (vị trí A)
- Đấu 3’ –CCA: vị trí gắn với acid amin.
tARN chiểm khoảng 15% tổng số RNA của tế bào
2.3. RNA thông tin (messenger RNA – mARN)

- RNA thông tin làm nhiệm vụ truyền đạt thông tin di truyền từ DNA đến protein.
- mARN chiểm khoảng 5% tổng số RNA tế bào.

- Cấu trúc của mARN:
5’ m7GxpYp AUG UAG phần đuôi

Đoạn 5’ Đoạn được Đoạn 3’
không mã hóa phiên mã không mã hóa
(X, Y có thể là A hoặc G)


- Các mARN của prokaryote có nữa thời gian (half life) tồn tại ngắn trung bình 2 phút. Các mARN của Eukaryote có nữa thời gian tồn tại khoảng 30 phút - 24 giờ.
mRNA ở eukaryote
2.4.-Ribozym và self- splicing

- Các phân tử rARN của các loài nguyên sinh động vật, lúc đầu được tổng hợp với một số lượng lớn tiền chất, từ số các rARN này sẽ có một được tạo ra bằng cách tự cắt nối (self - splicing).
Quá trình cắt nối này có thể xảy ra ở in vitro trong sự vắng mặt của protein.
Phản ứng self-splicing ở loài Tetrahymena gồm 2 bước:
+ Nucleotid G gắn vào trình tự intron, đồng thời cắt mạch RNA.
+ Đầu 3’ của RNA mới vừa được tạo ra gắn vào đầu bên kia của intron hoàn thành phản ứng nối liền.
Trình tự intron dài 400 nucleotid đã được tổng hợp trong ống nghiệm và nó cuộn lại tạo phức hợp bề mặt có hoạt tính tương tự enzyme trong các phản ứng với các RNA khác.
Các RNA có khả năng tự xúc tác được gọi là ribozyme.
Phản ứng self-splicing của RNA
Quá trình splicing, cắt các intron, nối các exon
IV Các tính chất của DNA

1. Biến tính (denaturation) và hồi tính (renaturation)
* Biến tính: Khi đun nóng DNA từ từ, vượt quá nhiệt độ sinh lý (khoảng 80-95oC), các liên kết hydro giữa 2 mạch bị đứt và tách rời nhau. Trước tiên các mối liên kết A-T, khi nhiệt độ > 90oC các liên kết G -C bị đứt.
* Điểm chảy của DNA (Tm): Nhiệt độ mà ở đó 2 mạch DNA tách rời nhau. Tm phụ thuộc vào số lượng các liên kết hydro. DNA có tỷ lệ G-C cao sẽ có điểm chảy cao. DNA có 60% G-C thì điểm chảy là 95oC.
Ngoài nhiệt độ, người ta còn dùng chất formanide (NH2 -CH = 0) làm biến chất DNA ở 40o­C
* Hồi tính: Các DNA bị biến chất được hạ nhiệt độ từ từ, ở 60o -700C các nucleotid sẽ gắn lại với nhau để tạo nên DNA mạch kép.

Sự biến tính và hồi tính của DNA
2. Lai acid nucleic
* Nguyên tắc: lấy DNA A làm biến tính thành mạch đơn, trộn với DNA B cũng bị biến tính thành mạch đơn. Dung dịch được hạ nhiệt độ từ từ để xảy ra hồi tính, sợi A kết với A, B kết với B, đồng thời có sợi A kết với B tạo thành phân tử lai.
Hiện nay còn sử dụng phương pháp lai trên pha rắn, được sử dụng rộng nhất:
+ Phương pháp Southern blot, dùng cho DNA
+ Phương pháp Northern blot dùng cho RNA
+ Phương pháp dot (điểm) và slot (khe) blot dùng cho RNA và DNA
Lai tại chỗ (in situ hybridization) là kiểu lai phân tử trong đó trình tự acid nucleic cần tìm nằm ngay trong tế bào hay trong mô.
* Dùng phương pháp lai DNA:
+ Có thể xác định mối quan hệ họ hàng giữa các loài. Ví dụ: DNA người và DNA chuột chỉ lai được 25%.
+ Có thể tiến hành lai mARN với DNA để xác định vị trí gen trên DNA tạo ra mARN tương ứng.
+ Giúp hiểu chi tiết hơn về bộ gen, nó là cơ sở của phương pháp chẩn đoán mới dùng acid nucleic đang đuợc sử dụng rộng rãi.
Phát hiện các DNA lai với mẫu dò

V. Những cấu trúc chứa DNA trong tế bào
1. Những đoạn DNA chứa thông tin di truyền
DNA do polynucleotid tạo thành, chia làm nhiều đoạn; mỗi đoạn là một đơn vị chức năng, gọi là gen.
Định nghĩa gen (trong di truyền học):
+ Mendel là người đầu tiên nêu lên khái niệm “nhân tố di truyền”
+ J. Morgan: gen nằm trên nhiễm sắc thể chiếm một locus nhất định. Gen là đơn vị chức năng xác định một tính trạng.
+ Sau khi học thuyết trung tâm ra đời: gen là đoạn DNA trên nhiễm sắc thể không những mã hóa cho các loại protein mà cả các loại RNA.
+ Cuối những năm 70: gen là một đoạn DNA đảm bảo cho việc tạo ra một polypeptid, bao gồm cả vùng trước và sau vùng mã hóa cho protein và cả những đoạn không mã hóa xen giữa các đoạn mã hóa.
Định nghiã tổng quát: gen là đơn vị chức năng cơ sở của bộ máy di truyền chiếm một locus nhất định trên NST và xác định một tính trạng nhất định. Các gen là những đoạn vật chất di truyền mã hóa cho những sản phẩm riêng lẻ như các RNA được sử dụng trực tiếp cho tổng hợp các enzym, các protein cấu trúc hay các mạch polypeptid để gắn lại tạo ra các protein có hoạt tính sinh học.
2. Virus chứa DNA và virus chứa RNA
- Virus gây bệnh đốm thuốc lá chứa RNA sợi đơn.
- Các thực khuẩn thể T2, T4, T6 chứa DNA mạch đôi thẳng, dài.

Virus khảm thuốc lá
a. Ảnh virus khảm thuốc lá chụp bằng kính hiển vi điện tử ở
độ phóng đại 37.428X
b. RNA điều khiển sự hình thành
tính trạng vỏ của virus

3. Nhiễm sắc thể chính và plasmid của vi khuẩn
- DNA của vi khuẩn làm thành thể nhân, là DNA mạch vòng, xoắn kép.
- Plasmid cũng là phân tử DNA mạch kép, dạng vòng ở bên cạnh thể nhân, có KLPT trung bình khoảng 1% DNA của thể nhân.Có thể tham gia sự tự nhân đôi và tham gia tiếp hợp khác như là một phần của NST chính.

4. Nhiễm sắc thể Eukaryota.
Các trình tự lặp lại và đơn độc
- DNA đơn độc (tái hợp rất chậm)
- DNA lặp lại trung bình (tái hợp nhanh vừa)
- DNA lặp lại cao (tái hợp rất nhanh)
Căn cứ vào đặc điểm cấu trúc và phân, chia DNA thành các loại sau:

- DNA đơn độc: phổ biến nhất, chiếm khoảng 75% genome. Các đoạn DNA này chỉ thấy 1 lần (hoặc vài lần) trong genome. Một phần nhỏ của DNA loại này là các gen mã hóa cho protein. Hẫu hết các DNA đơn độc là các intron hoặc là các đoạn nằm xen giữa các gen.

- DNA lặp lại: Chiếm 25% còn lại của genome, đây là các đoạn DNA được lặp đi lặp lại hàng ngàn lần trong genome DNA lặp lại gồm 2 loại:
+ DNA vệ tinh: tập trung ở 1 số vùng nhất định trên NST, chúng xếp đuôi nhau, cái này tiếp cái kia. Loại này chiếm 10% bộ gen.
+ DNA lặp lại rãi rác: chiếm khoảng 15% genome, gồm 2 loại:
Các yếu tố rãi rác có kích thước ngắn SINEs
Các yếu tố rãi rác có kích thước dài LINEs : bao gồm các họ LINE 1 (hay Kpn 1) và THE 1.
Nhiễm sắc thể của Eukaryota
NST Eukaryote gồm DNA và protein, trong số đó histon là protein cốt lõi trong việc cuộn lại và điều hòa hoạt tính của DNA. Sự hình thành NST kỳ giữa từ chuỗi xoắn kép DNA qua hệ thống các bậc cấu trúc sau:
+ Nucleosome là đơn vị cấu trúc của NST được tạo nên do sợi DNA dài quấn quanh các protein histon thành sợi 11nm. Đơn vị này là phức hợp gồm 146 cặp nucleotid của DNA quấn quanh 8 phân tử histon: 2H2A, 2H2B, 2H3 ,2H4. Các nucleosome kề nhau được nối qua một phân tử histon trung gian H1.
+ Sợi chromatin dày 30nm: các nucleosome xếp sít nhau tạo thành phức hợp nucleoprotein. + Vùng xếp cuộn dày 300nm do sợi chromatin sau nhiều lần xoắn uốn khúc tạo nên.
+ Chất dị nhiễm sắc 700nm
+ Kỳ giữa 1400nm.
Trình tự CEN: trình tự lặp lại cao CEN là của các tâm động.

Trình tự TEL: thuộc các telomer (đầu mút của NST) với nhiều vai trò khác nhau: bảo vệ đầu mút NST khỏi bị cắt bởi nuclease, giữ chiều dài của NST khi sao chép, gắn với màng nhân và kìm hãm sự biểu hiện của các gen ở đầu mút. Các trình tự TEL có tính bảo tồn cao trong tiến hóa. Chúng có số lần lặp lại cao, giàu A và C.