Bệnh lý phân tử_kỹ thuật lai SOUTHERN BLOTTING

Trường Đại Học Nông Nghiệp I
Bài Tập Bệnh Lý Phân Tử


Thực hiện: Nhóm 2
Lớp:Thú Y. A. K51
Khoa: Thú Y


Hà nội ngày 10 tháng 10 năm 2008


Mời thầy và các bạn lắng nghe bài thuyết trình của nhóm 2
KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC
PHƯƠNG PHÁP LAI SOUTHERN BLOTTING
I. Giới thiệu chung kỹ thuật Southern Blotting
- Kỹ thuật lai ghép trên Southern blotting hay còn gọi là kỹ thuật phân tích sự đa hình về chiều dài của các mảnh DNA bị cắt đoạn – RFLP.
- Do E.M.Southern đề xuất trình bày tại đại học Edingburgh từ năm 1975 và sau đó được tiếp tục hoàn thiện và phát triển.
- Southern Blot là một trong những kỹ thuật di truyền của công nghệ sinh học hiện đại,. Kỹ thật này được triển khai nhờ một số các kỹ thuật nền của CNSH phân tử như: Kỹ thuật tách chiết gen, nhân dòng gen, xác định trình tự gen, thiết kế các vector chuyển gen, chuyển nạp gen, theo dõi hoạt động và biểu hiện gen ở cơ thể nhận.
- Ứng dụng trong nghiên cứu cấu trúc của gen, điều chỉnh và biến đổi gen, tách, tổng hợp và chuyển gen theo mong muốn, kiểm tra các cơ thể mới cho sản phẩm đáp ứng yêu cầu xã hội trong đó chủ yếu là thực phẩm và sức khỏe loài người.




Phương pháp lai Southern Blot
2.1 Khái niệm.
Đây là phương pháp cho phép xác định được sự có mặt của những trình tự nucleotide trên một đoạn ADN nào đó trong hỗn hợp các đoạn ADN khác nhau bằng cách sử dụng các phương pháp dựa trên việc thẩm tích (blot) các phân tử axit nucleic lên màng và lai với các mẫu dò đặc hiệu.

2.2 Ngyên lý và điều kiện thực hiện lai Southern Blot
2.2.1 Nguyên lý.
Dựa trên nguyên tắc biến tính và hồi tính của phân tử DNA, dựa vào sự tương tác giữa các cặp nucleotide theo nguyên tắc bổ xung: A-T; G-C. Cụ thể ở đây chính là các đoạn polynucleotide đơn có cấu trúc bổ xung.

2.2.2 Điều kiện.
- Phản ứng lai cần nhiệt độ cao hoặc hóa chất gây biến tính DNA (NaOH, Formaldehyt).

- Đòi hỏi một đoạn ADN (ARN) đã biết được sử dụng làm mồi “đầu dò-Probe” (thường là đánh dấu phóng xạ P32).

- Các vật liệu, trang thiết bị máy móc chính xác như: Tấm lọc (nylon Filter), máy Blotting, buồng lai, máy PCR…
2.3 Mẫu Dò – Probe.

Phương pháp tạo mẫu dò (có 2 phương pháp).
Đánh dấu mẫu dò.

**Mẫu dò đánh dấu phóng xạ









Hình ảnh đánh dấu DNA bằng dịch chuyển điểm đứt.
Phương pháp đánh dấu bằng dịch chuyển điểm đứt.
- DNA dùng làm mẫu dò:


- Tạo ra các vết khía sau đó bổ xung các nucleotide tự do trong đó có các nucleotide, chẳng hạn nucleotide C, đã được đánh dấu phóng xạ.

- Cho DNA polymerase vào ống và ngay lập tức chúng bám vào các vết cắt.

- Polymerase bắt đầu sửa chữa DNA theo chiều 5` - 3`.

- DNA này sau đó được bằng nhiệt độ làm biến tính sợi kép thành hai sợi đơn.




Đánh dấu bằng phương pháp kéo dài mồi.










Đánh dấu ở đuôi đoạn DNA nhờ enzyme polynucleotide kinase (PNK).







**Mẫu dò đánh dấu bằng phương pháp hoá học
(mẫu dò lạnh)
*Hệ thống bằng liên kết các nucleotid đánh dấu avidin - biotin

1 .Đánh dấu biotin vào mẫu dò DNA đích

2. Aviđin, protein lòng trắng trứng hoặc streptavidin chất tương tự như avidin ở vi khuẩn tham gia kết dính vào biotin.

3. Enzym đánh dấu biotin như phosphataza được cho vào .

4. Tùy vào enzym đánh dấu biotin mà cơ chất có màu hoặc phát quang được thêm vào và sự đổi màu hoặc ánh sáng tạo thành là kết quả của sự chuyển hoá cơ chất thành sản phẩm đo được
*Hệ thống dựa trên sự phát quang sinh học

- Mẫu dò được đánh dấu bằng enzym peroxidaza.

- Sau quá trình lai cho màng lai tiếp xúc với một cơ chất của peroxidaza có khả năng phát sáng khi bị biến đổi, ánh sáng phát ra sẽ in dấu trên phim và thu nhận được kết quả trên phim.
2.2.2 Quy trình lai Southern Blotting.

Chia ra 3 khâu chính như sau:

- GĐ 1: Tách chiết và biến tính các DNA thành các sợi đơn.

- GĐ 2: Chuyển DNA biến tính từ agarose gel lên trên màng lai.

- GĐ 3: Lai với Probe và kiểm tra nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi.






GĐ 1: Tách chiết và biến tính các DNA thành các sợi đơn.
- Chiết tách ADN nghiên cứu.

- Cắt ADN nghiên cứu bằng enzym giới hạn.

- Tiến hành điện di hỗn hợp sản phẩm cắt trên gel agarose (thường dùng nồng độ agarose là 0,8%, đệm TBE, hiệu điện thế là 1,5V/cm chiều dài gel)

- Làm biến tính (tạo các sợi đơn) các băng ADN trên gel, điện di bằng cách xử lý gel điện di 20 phút trong dung dịch NaOH 0,4M.


GĐ 2: Chuyển DNA từ agarose gel lên trên màng lai
- Màng được sử dụng là màng nitrocellulose hoặc nylon.
Màng nitrocellulose có khả năng tiếp nhận 100μg DNA/cm2 .
Màng nylon có khả năng tiếp nhận 500μg DNA/cm2 và tính năng giữ DNA chắc chắn hơn, ít đứt gãy hơn.
- Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc mao dẫn hay máy hút chân không tự động hoặc máy truyền điện di (khoảng một vài tiếng)
Đệm từ phía dưới được thấm một cách tự nhiên lên trên chuyển các mảnh DNA từ gel lên màng và bám chặt vào màng ( thời gian chuyển dựa vào các phương pháp chuyển khác nhau).
- Cách tiến hành: Đặt gel lên giá chuyển máy Blotting để chuyển nguyên vẹn các sợi ADN biến tính (dung dịch dẫn chuyển là NaOH 0,4M; màng lai có cấu tạo là nitrocellulose hoặc nylon sẽ giữ cố định các đoạn ADN được chuyển lên từ gel điện di)

GĐ 3: Lai với Probe và kiểm tra nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi.

- Sự ăn khớp giữa các ADN cố định trên màng lai theo nguyên tắc bổ xung với ADN Probe trong dung dịch mẫu dò (quá trình này thực hiện trong buồng lai nhiệt độ 65-680C trong thời gian 6-12h; Probe được đánh dấu bởi P32 hoặc một chất gây phản ứng màu khác).

- Rửa và loại bỏ mẫu dò không tham gia phản ứng lai trên màng lai.

- Phát hiện vị trí lai nhờ phóng xạ tự ghi (autoradiogragh).

- Đặt phim lên tấm lọc.

- Tráng phim để thu các vạch đen tại nơi phát xạ.

Ứng Dụng
Lai Southern blotting - RFLP
- Phát hiện được sự có mặt của gen cần tìm trong hệ gen sinh vật nghiên cứu.
- Phát hiện sự đa dạng DNA của các cá thể khác nhau.

- Phát hiện các đột biến.

- Phát hiện các thể lai tế bào soma qua dung hợp tế bào trần

- Lập bản đồ giới hạn của một gen.


Một số ứng dụng cụ thể:
Trong nhân y: - Xác định dấu ấn di truyền: Phương pháp này đưa đến kết quả là mỗi cá thể sẽ có một hình ảnh đặc trưng bằng các vạch được đánh dấu bằng các đoạn dò khi lai ghép trên Southern blotting.
- Truy tìm tội phạm: Căn cứ vào các dấu vết tại hiện trường






- Chẩn đoán bệnh di truyền ở thai nhi:









Ở người khỏe mạnh gene -glubolin nằm ở phần đoạn có độ dài 7.6 kb. Ở đứa bé bị thiếu máu do hồng cầu lưỡi liềm, gene nói trên nằm phân đoạn có độ dài 13,0 kb, còn ở bố mẹ và thai nhi phát hiện thấy gene này có mặt cả ở đoạn 7,6 kb và 13,0 kb. Điều này chứng tỏ cả ba đều ở dạng dị hợp tử và mang gene bệnh thiếu máu do hồng cầu lưỡi liềm.
Xác nhận huyết thống.
Phương pháp này sử dụng mẫu dò lạnh (cold probe)
- Phát hiện sớm để phòng và điều trị những căn bệnh hiểm nghèo:
Người ta phát hiện thấy có sự khác nhau về số lượng và thứ tự sắp xếp gốc nucleotid ở đoạn gần với đầu 5’ của gene mã hóa tổng hợp insulin.
Phát hiện thấy liên quan của các tác nhân di truyền với sự thể hiện rối loạn teo cơ Duchenne và bệnh tâm thần trí tuệ kém phát triển Huntington.
……
- Ứng dụng trong kiểm định độ chính xác một số công trình nghiên cứu y học: Trên trang 646 tờ Nature 435, (2 June 2005), Urnov và cộng sự đã lợi dụng các ZFN (zinc-finger nucleases- các nuclease ngón tay kẽm) đưa ra một phương thức mới giúp hiệu chỉnh sửa sai một đột biến di truyền ở tế bào người. Bằng cách sử dụng kỹ thuật Southern blot, Urnov và cộng sự cho thấy là không có sự nhầm lẫn khi đánh dấu DNA đích cần hiệu chỉnh và cũng không có sự tái sắp xếp bất thường.
-Ứng dụng trong thú y:
+ Kiểm tra động vật được tạo ra từ phôi chuyển gen: Sau khi đưa gen vào trứng đã thụ tinh hay một giai đoạn nào khác, sau khi sinh, nở nuôi tới một giai đoạn nhất định thì kiểm tra để xác định xem gen chuyển có xen được vào genom động vật cần chuyển hay không.
+Điều tra phân tích kiểu gen: Vd Gen protein sữa (kappa – casein b – lactoglobulin) ở bò sữa Việt Nam.
+ Dự đoán các bệnh truyền nhiễm và ung thư bằng cách xác định được chủng loại virut gây bênh cho vật nuôi, những dạng tương ứng của đột biến…
-Ứng dụng trong khoa học cây trồng:
+ Áp dụng qui trình Southern  blot trên đối tượng là vi khuẩn Pseudomonas fluorescens. Kết quả này là cơ sở ban đầu trong việc hoàn thiện phương pháp lai phân tử để phục vụ cho những nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệ thực vật.
+ Nghiên cứu giám định gen và đánh giá tính kháng sâu xanh của giống bông Bt CS95 và con lai F1.
Các bước cơ bản: Cắt ADN genom cây bông bằng enzym giới hạn HindIII và phân giải trên gel agarose 1%; ADN ở dạng sợi đơn được chuyển lên màng nylon theo phương pháp thấm ngược; Đánh dấu mẫu dò và thang ADN chuẩn bằng lai với mồi ngẫu nhiên DIG; Tiến hành lai Southern bằng ống thuỷ tinh và lò lai; Tiến hành phản ứng dò tìm AND; Và hiện phim X-quang.
Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội
Xin chân thành cảm ơn !
Thực hiện: Nhóm 2.
Lớp: Thú Y. A. K51
Khoa:Thú Y.
Bài Tập Bệnh Lý Phân Tử
10/10/2008
Nhiệt độ lai phụ thuộc vào loại mẫu dò, nhưng nhiệt độ lai cũng như nhiệt độ rửa là rất quan trọng. Thông thường với mẫu dò myo thì nhiệt độ lai là 55 ºC, còn rửa thì tiến hành ở nhiệt độ thông thường. Còn các mẫu dò tự chế tác thì có thể tính toán trên cơ sở độ dài và thành phần nucleotide của mẫu dò cụ thể.