BÀI TIỂU LUẬN TẾ BÀO HỌC

BÀI TIỂU LUẬN TẾ BÀO HỌC
Giảng viên: TS Nguyễn Xuân Viết.

Học viên: Hoàng Thị Thạch Tâm.
Cao học : K20
Tổ: LL và PPDH Sinh học
CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT-NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG
MỤC LỤC
PHẦN MỞ ĐẦU
PHẦN NỘI DUNG
Chương 1: Đại cương về cấu trúc-chức năng tế bào thực vật.
Chương 2: Công nghệ tế bào thực vật ( nuôi cấy mô tế bào thực vật ).
Chương 3: Một số thành tựu nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam.
PHẦN KỂT LUẬN.
CÁC TÀI LIỆU THAM KHẢO.

PHẦN MỞ ĐẦU
-Thực vật và động vật đều được xây dựng trên nền tảng tế bào, đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản nhất của mọi cơ thể sống. Ở các sinh vật đơn bào,mỗi tế bào chính là 1 cơ thể. Các sinh vật đa bào được cấu tạo từ hàng triệu tế bào với cấu trúc và chức năng chuyên hóa tạo nên các mô và các cơ quan khác nhau. Các tế bào được phân biệt ở 2 mức độ tổ chức: tế bào nhân sơ( prokaryota ) và tế bào nhân thực ( eukaryota ).
PHẦN MỞ ĐẦU
-Thuật ngữ “ Tế bào ’’ bắt nguồn từ chữ Latinh “ cella ’’, có nghĩa là ô chứa nhỏ và được Robert Hooke phát hiện lần đầu tiên vào năm 1665 nhờ kính hiển vi tự tạo với độ phóng đại 30 lần. Ông đã mô tả. Ông đã mô tả cấu trúc của bần thực vật ở dạng xoang rỗng có thành bao quanh.

PHẦN MỞ ĐẦU
-Antoni Leuvenhoek ( 1674 ) với kính hiển vi có độ phóng đại 270 lần đã mô tả các tế bào động vật và đã xác định rằng tế bào không phải xoang rỗng mà có cấu trúc phức tạp.
-Đến thế kỷ 19, nhờ sự hoàn thiện của kỹ thuật hiển vi, nhờ sự tổng kết các công trình nghiên cứu của nhiều tác giả về cấu trúc tế bào thực vật, động vật và vi khuẩn,M.Schleiden và T.Schwann ( 1839 ) nêu ra học thuyết tế bào. Học thuyết tế bào xác nhận: Tất cả cơ thể sinh vật từ đơn bào đến động vật, thực vật đa bào đều có cấu tạo tế bào.




PHẦN MỞ ĐẦU
-Thế kỷ XX, nhờ sự phát triển của kỹ thuật hiển vi điện tử, các nghiên cứu về tế bào đã phát triển mạnh và đạt được những kết quả to lớn. Môn Tế bào học (Cytology) đã trở thành một môn khoa học thật sự, độc lập và phát triển nhanh chóng cả về nghiên cứu cấu trúc và chức năng.

PHẦN MỞ ĐẦU
-Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của KHKT, Tế bào học là cơ sở cho sự phát triển của Công nghệ sinh học. Hiện nay Công nghệ sinh học là nghành mũi nhọn được cả thế giới quan tâm.
-Tốc độ phát triển nhanh chóng của Công nghệ sinh học không kém gì sự bùng nổ Công nghệ thông tin và tạo ra một cuộc Cách mạng sinh học trong nông nghiệp, công nghệ thực phẩm, y dược và đặc biệt là trong nông nghiệp trồng trọt.Nhờ ứng dụng công nghệ sinh học tế bào thực vật-trọng tâm là nuôi cấy mô-tế bào thực vật được ứng dụng rộng rãi trong nhân giống nhiều loại thực vật,chọn dòng chống chịu,lai xa, chuyển gen vào cây trồng…



PHẦN NỘI DUNG

CHƯƠNG I: ĐẠI CƯƠNG VỀ CẤU TRÚC- CHỨC NĂNG TẾ BÀO THỰC VẬT.


I- Cấu trúc tế bào thực vật

Hầu hết các thực vật đều được cấu tạo từ các tế bào nhân thực (eukaryota).
Hình dạng tế bào thực vật nằm trong cấu trúc mô thường là đa giác, ở vùng sinh trưởng giãn của thân, rễ, các tế bào có dạng hình hộp dài.
Tế bào thực vật được chia làm 2 phần chính: thành tế bào (cell wall) và phần nguyên sinh chất bên trong (protoplast,tế bào trần). Trong nguyên sinh chất có tế bào chất,nhân tế bào và các bào quan.


1/ Thành tế bào.
1.1) Cấu trúc: Thành tế bào sơ cấp là 1 mạng lưới hydrat hóa cao.Mạng lưới này bao gồm các nhóm polisaccarit chính,thường gọi là hemixellulozo và pectin,cùng với 1 lượng nhỏ protein cấu trúc.Mạng lưới polisaccarit gồm số lượng không ổn định các polime,có thể thay đổi tùy theo kiểu tế bào và loài thực vật.
1.2) Chức năng:
- Là lớp vỏ bao bọc,có vai trò như bộ khung xương quy định hình dạng tế bào.
- Cần thiết cho sự trao đổi nước bình thường ở thực vật.
- Phát sinh hình thái ở thực vật phụ thuộc lớn vào đặc tính của thành tế bào.
……

2/ Màng sinh chất
2.1) Cấu trúc:
Màng sinh chất gồm một lớp phospholipit kép, trong đó có các phân tử protein bám và gắn vào màng.
Phân tử phospholipit có chứa 2 axit béo liên kết cộng hóa trị với glyxerol qua 2 gốc phosphat và tạo thành đuôi của nó.
Lớp phospholipit có vùng đầu ưa nước và các đuôi kỵ nước.
Cấu trúc màng sinh chất
2/ Màng sinh chất
2.2) Chức năng:
Màng sinh chất thực hiện các chức năng quan trọng sau:

Ngăn cách tế bào với môi trường, tạo cho tế bào một hệ thống riêng biệt.

Thực hiện sự trao đổi chất giữa tế bào và môi trường( các protein được gắn vào màng làm nhiệm vụ như cái bơm hoặc tạo các kênh nhỏ để vận chuyển các phân tử đặc biệt vào và ra tế bào).

Thu nhận thông tin có nguồn gốc ngoại bào và chuyển vào môi trường nội bào…

3/ TẾ BÀO CHẤT
3.1) Thành phần cấu trúc:
Trong tế bào chất có các bào quan như:
Lạp thể.
Ty thể.
Vi thể ( microsom ).
Phức hệ Golgi.
Peoroxisom.
…
Cấu trúc tế bào thực vật
3.2) Chức năng của các bào quan trong tế bào chất.
Trong tế bào chất xảy ra các quá trình sống của tế bào như: đồng hóa, dị hóa, sinh tổng hợp,sinh trưởng và phản ứng với các tác động ở bên ngoài.
Lạp thể chứa chlorophill và là nơi có bộ máy quang hợp.
Ti thể là nơi khai thác năng lượng từ các phân tử, tích lũy năng lượng dưới dạng ATP và từ đây cung cấp cho các bào quan khác.
Trung thể gồm Ribosom là trung tâm tổng hợp protein và lyzosom nơi chứa các enzim tham gia vào quá trình phân giải các hợp chất tự nhiên trong tế bào.
Phức hệ Golgi tham gia vào quá trình biến đổi, sắp xếp, phân loại và tập hợp các đại phân tử để dự trữ hoặc cung cấp cho các bào quan khác.
Proxisom chứa các enzim oxidase tham gia phá hủy các hydro peoroxit.
4/ KHÔNG BÀO
4.1) Cấu trúc:
Không bào là 1 khoang lớn nằm ở trung tâm chất nguyên sinh của tế bào thực vật.
Những tế bào thực vật trưởng thành thường có 1 không bào lớn chứa đầy nước và chiếm từ 80-90% tổng thể tích của tế bào.
4.2) Chức năng của không bào.
Không bào chứa nước, các muối vô cơ, muối hữu cơ, đường, các enzym…những chất này thường giữ vai trò chống chịu cho thực vật.
Do tích lũy nhiều chất có tính thẩm thấu, các không bào tạo lực thẩm thấu đối với nước, cần thiết cho sự tăng trưởng của tế bào thực vật.
Áp suất thẩm thấu phát sinh bởi hấp thụ nước đã làm cho cấu trúc của tế bào và mô trong thân các thực vật thân thảo có đủ độ cứng cần thiết,giúp cây có thể đứng được khi chúng thiếu các cấu trúc linhin như các tế bào thực vật thân gỗ.
Không bào cũng rất giàu các enzym thủy phân, những enzym này sẽ được giải phóng ra tế bào chất trong quá trình lão hóa, tham gia vào sự thoái hóa của tế bào…
II- Sinh trưởng và phân hóa của tế bào thực vật
Sinh trưởng và phát triển của cơ thể thực vật cũng như của các cơ quan, mô là kết quả sinh trưởng và phát triển của mỗi tế bào.
Mỗi tế bào thực vật ở trạng thái trưởng thành đều đã trải qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn phân bào ( giai đoạn phôi sinh ).
Giai đoạn giãn ( giai đoạn tăng sinh ).
Giai đoạn phân hóa ( giai đoạn biệt hóa ).

Sinh trưởng và phân hóa tế bào
CHƯƠNG II: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT
(NUÔI CẤY MÔ-TẾ BÀO THỰC VẬT)
I- Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
Gottlieb Haberlandt (1902)- nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ông đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào.Theo ông, mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể đó và có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Tuy nhiên những thí nghiệm của ông với các tế bào mô mềm, biểu bì thất bại do chúng không phân chia được.
Năm 1922, Kotte- học trò của Haberlandt cùng với Robbins đã lặp lại các thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ 1 cây hòa thảo.hai tg đã nuôi được trong một thời gian ngắn trên môi trường lỏng có chứa đường glucozo, muối khoáng và thu được hệ rễ nhỏ.

II- Cơ sở sinh lí của nuôi cấy mô tế bào thực vật.
TÍNH TOÀN NĂNG:

Tính toàn năng(totipoteney) của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào đã được biệt hóa có khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và trong điều kiện phù hợp dẫn đến hình thành cây mới hoàn chỉnh.
III- Các điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
1/ Điều kiện vô trùng
Vô trùng dụng cụ và môi trường.
* Khử trùng khô
* Khử trùng ướt
* Màng lọc
Vô trùng mẫu cấy:
* Lựa chọn mẫu cấy.
* Phương pháp vô trùng mẫu cấy.
2/ Ánh sáng và nhiệt độ.
Nhiệt độ phòng nuôi cấy duy trì 25-28độ C.
Tất cả các nuôi cấy đều cần ánh sáng, trừ một số nuôi cấy tạo mô sẹo.

Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào TV
PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ
Yêu cầu tối thiểu cần những phòng sau:
Phòng chuẩn bị và giữ môi trường dinh dưỡng.
Phòng thao tác nuôi cấy.
Phòng nuôi cấy.
Phòng thí nghiệm.
Phòng làm việc.
Phòng nuôi cấy
Phòng chuẩn bị và giữ môi trường dinh dưỡng
Phòng thao tác nuôi cấy
-Thiết bị phòng này gồm: tủ cấy vô trùng, giá và bàn để môi trường…
- Các dụng cụ như: dao, kéo, đèn cồn…
Phòng thao tác với tủ cấy và giá để môi trường
PHÒNG NUÔI CẤY
- Phòng nuôi cấy dùng để nuôi mô hoặc cây trong ống nghiệm.

- Có phòng nuôi sáng và phòng nuôi tối.
MÁY PHỤC VỤ NUÔI CẤY MÔ
Một số hình ảnh về nuôi cấy tế bào thực vật
Hình 1, 2, 3: Nồi hấp
Hình 4: Tủ cấy

Các dụng cụ dùng trong nuôi cấy mô tế bào
Các loại bình serum


Máy Bioreactor
Các dụng cụ dùng trong nuôi cấy mô tế bào
Hộp nhựa dùng trong công tác giữ giống
Đĩa pipet
Các dụng cụ dùng trong nuôi cấy mô tế bào
Bình hình trụ
Bình tam giác
IV- MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
IV.1) Thành phần của môi trường

IV.1.1) Thành phần vô cơ bao gồm các muối khoáng (cả đa lượng và vi lượng). Trong thành phần muối khoáng đa lượng, các nguyên tố cần phải cung cấp là:
Nitơ vô cơ dưới 2 dạng: Nitrat (NO3-) và amoni ( NH4+). Đa số các môi trường có chứa dạng nitrat nhiều hơn dạng amon.
Phospho thường được đưa vào môi trường ở dạng muối phosphat. Hàm lượng phospho trong môi trường dao động từ 0,15-0,04mM.
Kali được cung cấp trong môi trường nuôi cấy dưới dạng KNO3, KCl, KH2PO4. Nồng độ kali trong môi trường từ 2-25mM.
* Yêu cầu về muối khoáng vi lượng của mô thực vật trong nuôi cấy khá phức tạp và ít được nghiên cứu…
IV- MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Axit nicotinic (vitamin B3, PP, niacin) tham gia tạo coenzym của chuỗi hô hấp, sử dụng 0,1-0,5mg/l.

Cấu trúc phân tử vitamin PP
- Pyridoxin (vitamin B6) là một coenzym quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất, sử dụng 0,1-1mg/l

Cấu tạo vitamin B6







IV- MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Myo-inositol: là một loại đường-rượu liên quan đến quá trình tổng hợp phospholipit, pectin của thành tế bào và các hệ thống màng trong tế bào, vận chuyển đường và trao đổi hydratcacbon…hàm lượng sử dụng khoảng 100mg/l môi trường.
Các aminoaxit và amit:
- Tất cả các dạng tự nhiên của aminoaxit (dạng L) dễ dàng được mô nuôi cấy hấp thụ (Skoog and Milles, 1957):
+ L-arginin dùng cho nuôi cấy rễ.
+ L-tyrolin dùng cho nuôi cấy chồi.
+ L-serin dùng cho nuôi cấy hạt phấn.
- Các dạng amit dùng trong nuôi cấy là L-glutamin, L- asparagin…
IV- MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
b) Các thành phần hữu cơ phức tạp: được dùng trong môi trường nuôi cấy để cung cấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin và các khoáng chất…
Cazein thủy phân(CH, casein hydrolysate). Hàm lượng trong nuôi cấy là 0,05-0,10%(W/v).
Dịch chiết nấm men(YE, yeast extract). Hàm lượng sử dụng 0,025-0,02%
Dịch chiết malt (malt extract): 0,05-0,1%(W/v).
Các loại nước ép hoa quả, củ:
+ Nước ép quả cà chua : 30% (V/v).
+ Nước ép cam : 3-10% (V/v).
+ Nước ép chuối xanh : 150g/l.
+ Nước dừa ( CM, coconut milk): 10-20%(V/v).
IV- MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
VI.1.3) Các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy in vitro. Hiệu quả tác động của chất điều hòa phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng, hoạt tính, mẫu nuôi cấy.
Các nhóm chất điều hòa sinh trưởng bao gồm:
Nhóm Auxin
Nhóm Cytokinin
Nhóm Giberellin
Nhóm Ethylen
Các chất khác…
IV- MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
VI.1.3) Các chất điều hòa sinh trưởng.
a) Nhóm Auxin : được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phôi vô tính…( Epstein và cộng sự,1989). Các auxin thường dùng:
IAA( Indole acetic acid)
IBA (Indole butyric acid)
NOA ( Naphthoxy acetic acid)
a-NAA
2,4-D…
IV- MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
VI.1.3) Các chất điều hòa sinh trưởng.
b) Cytokinin:
Kích thích sự phân chia tế bào, sự hinh thành và sinh trưởng của chồi in vitro (Miller,1961).
Các Cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sự sinh trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy.
Các loại Cytokinin được dùng trong nuôi cấy mô:
+ Zeatin
+ Kinetin
+ BAP
+ TDZ
IV- MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
VI.1.3) Các chất điều hòa sinh trưởng.
c) Giberillin:
Kích thích kéo dài tế bào, qua đó tăng kích thước của chồi nuôi cấy.
Phá ngủ cho hạt.
Trong cây Giberillin được tổng hợp ở lá đang phát triển, quả và rễ sau đó được vận chuyển đi khắp nơi trong cây.
* Loại Giberillin được sử dụng thường xuyên nhất là GA3(giberillic axit).
IV- MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
VI.1.4) Nguồn cacbon.

Loại hydratcacbon được sử dụng phổ biến là đương saccarozo với hàm lượng 2-6% (W/v).
Các loại đường khác như: fructozo, glucozo, maltozo, lactozo, sorbitol… chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt.
Hàm lượng đường thấp được sử dụng trong nuôi cấy tế bào trần, các hàm lượng đường cao hơn có thể dùng trogn nuôi cấy hạt phấn, phôi…
IV- MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
VI.2) pH của môi trường.

pH của đa số các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi 5,5-6,0. pH dưới 5,5 làm cho agar khó chuyển sang trạng thái ge, còn pH lớn hơn 6.0 agar có thể rất cứng.
Nếu trong thành phần môi trường có GA3 thì phải điều chỉnh giá trị pH của phạm vi nói trên.Vì pH kiềm quá hoặc quá axit, GA3 sẽ chuyển sang trạng thái không hoạt tính (Van Braft and Pierk, 1971).
Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm xuống do một số mẫu thực vật sản sinh ra các axit hữu cơ.
IV- MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
VI.3) Tính thẩm thấu của môi trường
* Các thành phần chính có ảnh hưởng đến thế năng của nước trong môi trường bao gồm:
Hàm lượng đường
Hàm lượng agar.
Một số thành phần muối khoáng.
* Tính thẩm thấu của môi trường đặc biệt quan trọng trong:
Nuôi cấy mô sẹo.
Nuôi cấy tế bào đơn và huyền phù tế bào.
Dung hợp và nuôi cấy tế bào trần.
CÁC GIAI ĐỌAN TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
CÁC GIAI ĐỌAN TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
Chọn vật liệu khởi đầu: thường từ các mô non, chưa bị phân hóa từ các cây mẹ khỏe, sạch bệnh
CÁC GIAI ĐỌAN TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
Tiệt trùng bề mặt mẫu nuôi cấy: sử dụng tác nhân oxy hóa, clo hoạt động, kim loại nặng, rượu kết hợp với các chất tẩy rửa
Đảm bảo điều kiện vô trùng sau tiệt trùng và trong khi cấy chuyển: tủ cấy vô trùng gió thổi ngang áp suất dương
CÁC GIAI ĐỌAN TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
Đưa mẫu nuôi cấy lên môi trường nuôi cấy thích hợp (mỗi loài, giống cây trồng có môi trường riêng)
Nhân nhanh trong
ống nghiệm
CÁC GIAI ĐỌAN TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
Đưa cây vào vườn ươm
V- CÁC KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
Một số kĩ thuật nuôi cấy mô-tế bào thực vật chính đã sử dụng:

1/ Nuôi cấy phôi.
2/ Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời.
3/ Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn.
4/ Nuôi cấy mô phân sinh.
5/ Nuôi cấy và dung hợp tế bào trần.
6/ Chuyển gen vào thực vật.
V- CÁC KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
V.1/ NUÔI CẤY PHÔI.

* PHÔI là một nhóm tế bào có khả năng phát triển tạo thành cơ thể hoàn chỉnh, là pha phát triển trung gian giữa hợp tử hay tế bào Xoma hay bào tử thể.
* Có 2 loại phôi là: phôi hữu tính và phôi vô tính ( phôi Xoma)

1/ NUÔI CẤY PHÔI
Phân biệt phôi hữu tính và vô tính
Phôi hữu tính : được hình thành và phát triển từ những tế bào sinh dục : sau khi sự thụ tinh đôi xảy ra: một hạt phấn thụ tinh với noãn và thành lập hợp tử lưỡng bội, một loạt các phân cắt đẳng nhiễm xảy ra, hợp tử phát triển thành phôi ( bào tử thực vật mới ).
Phôi vô tính (phôi soma) : được phát sinh từ tế bào sinh dưỡng 2n chỉ của bố hoặc mẹ và tế bào ấy có cấu trúc như một phôi gọi là phôi vô tính.

Các giai đoạn phát triển phôi hữu tính
PHÔI SOMA
Quy trình nuôi cấy phôi hữu tính in vitro
* Sự phát sinh phôi hữu tính:
- Xảy ra quá trình thụ tinh giữa hạt phấn và noãn hình thành hợp tử
- Hợp tử trải qua quá trình nguyên phân liên tiếp tạo thành phôi
Quá trình phát sinh phôi hữu tính
Quy trình nuôi cấy phôi hữu tính




* Tách phôi:
Phôi hữu tính được hình thành trong môi trường vô trùng của noãn và mô bầu hoa. Dùng kỹ thuật tách phôi và đưa vào môi trường ở điều kiện vô trùng.
+Ở một số loài phôi có kích thước lớn, thuận tiện cho quá trình tách phôi ( cây họ đậu), nhưng một số loài hoa khó tách phôi ( hoa lan)
+ Ở thực vật hoa dạng chùm, mô non thường xếp ở đỉnh hoa
Trong quá trình thu nhận phôi cần hạn chế sự tổn thương của dây treo phôi.
Quy trình nuôi cấy phôi hữu tính
*Thành phần môi trường nuôi cấy
Muối khoáng: môi trường MS có hàm lượng các ion K+ và Ca + giảm hàm lượng NH4+
Chất điều hòa sinh trưởng: thêm auxin, cytokinin hoặc từng loại riêng rẽ.
Nguồn cacbon từ đường saccharose, nồng độ thay đổi tùy theo từng giai đoạn phát triển. Phôi trưởng thành cần khoảng 2%, phôi non cần hàm lượng cao hơn.
Axit amin và các thành phần hữu cơ phức hợp: các axit amin có thể sử dụng riêng rẽ hay phối hợp như Glutamin và Cazein.
- Nội nhũ:
+ Các phôi non thường khó nuôi cấy trong môi trường nhân tạo đặc biệt là phôi hình thành từ phép lai xa.
+ Cấy phôi vào môi trường nội nhũ đảm bảo phát triển bình thường
Quy trình nuôi cấy phôi vô tính

*Sự phát sinh phôi soma:
Phôi soma được hình thành từ:
- Các tế bào sinh dưỡng của cây trưởng thành
- Các mô tái sinh không phải là hợp tử
- Các lá mầm và trụ dưới lá mầm của phôi và cây con không qua bất cứ sự phát triển nào của mô sẹo
Phôi vô tính phát sinh ngẫu nhiên trong quá trình nuôi cấy, sự phát sinh phôi vô tính có thể khởi đầu từ hai con đường:
-Phát sinh phôi xảy ra trực tiếp không qu a mô sẹo, phôi hình thành từ những tế bào được xác định là tiền phôi
-Phôi hình thành từ các tế bào phôi hóa cảm ứng trong mô sẹo
* Các sự kiện quan trọng quyết định liên quan đến chương trình sớm của quá trình phát triển (Hohlenbach, 1978) :
- Cảm ứng biệt hóa tế bào của những tế bào tiền phôi .
- Biểu hiện trình tự phát triển ở các tế bào tiền phôi.
* Các phôi phát triển qua các giai đoạn liên tiếp của hình thành phôi bao gồm: Giai đoạn hình tim, hình tim, hình cá đuối.
Quy trình nuôi cấy phôi vô tính
Các giai đoạn phát triển của phôi vô tính




1/Giai đoạn hình cầu
(Globurla)
Các giai đoạn phát triển của phôi vô tính




2/ Giai đoạn hình tim (Heart)
Các giai đoạn phát triển của phôi vô tính


Giai đoạn hình cá đuối (Torpedo)
Nuôi cấy phôi soma
Các tế bào tiền phôi có khả năng biệt hóa nhưng sự phát triển của chúng có thể bị ngăn cản do mất cân bằng của các chất trong môi trường nuôi cấy. Sự hình thành các cụm phát triển phôi và sự kết dính phôi có thể xảy ra nếu những môi trường có nồng độ auxin cao sau khi tế bào đã biệt hóa.
Hai loại môi trường đước sử dụng:
+ Môi trường có auxin: tạo các tế bào có khả năng phát sinh phôi
+ Môi trường không có auxin hoặc có với nồng độ thấp: môi trường cho những tế bào phát triển thành phôi
Các bước nuôi cấy phôi soma
Chọn mẫu cấy.
Khử trùng mẫu.
Tách mẫu.
Đưa vào môi trường nuôi cấy phôi.
Duy trì quá trình phát sinh phôi đồng nhất.
Tái sinh cây hoàn chỉnh từ phôi soma.
1.Chọn mẫu cấy
Mẫu có thể là :
* Tế bào sinh dưỡng của cây trưởng thành
* Các tế bào sinh sản không phải là tế bào sinh dục
* Lá mầm hay trụ dưới lá mầm của phôi hợp tử mà cây con không thông qua sự phát triển từ mô sẹo.

2.Khử trùng mẫu
Người ta thường sử dụng các dung dịch khử trùng thông thường như Ca-hypochlorite , Na-hypochlorite , thủy ngân clorur…Ngoài ra người ta còn dụng thêm các chất hoạt động bề mặt như Tween 80 , teepol , mannoxol…
3.Môi trường hóa học nuôi cấy

*Các chất điều hòa sinh trưởng:
+ Auxin
+ Cytokinin
*Nguồn nitơ: ảnh hưởng đến sự hình thành phôi và sự sinh trưởng của phôi trông nuôi cấy
-Thường sử dụng ở các dạng: các nitơ hữu cơ(glutamin, asparagin, cazenin thủy phân, nước dữa…)
*Thạch và các chất khác:
- Sử dụng hàm lượng thạch từ: 0.5-1.5% , đối với các nuôi cấy huyền phù tế bào thì sử dụng môi truờng lỏng nuôi cấy
4.Môi trường vật lý nuôi cấy phôi
Ánh sáng:
+ Giai đoạn cảm ứng tạo tế bào tiền phôi cường độ ánh sáng thấp
+ Giai đoạn tái sinh phôi thì cường độ ánh sáng cao hơn
Nhiệt độ tối ưu trong nuôi cấy là 25±2oC
Ứng dụng của nuôi cấy phôi hữu tính
* Thu nhận thể đơn bội
Nuôi cấy phôi hữu tính để thu nhận các thể đơn bội thông qua quá trình loại bỏ trực tiếp NST sau khi lai xa. Tổ hợp giữa hai loài càng khác xa nhau thì sự đào thải hoàn toàn NST đơn bội của một loài càng dễ xảy ra.
* Kiểm tra nhanh sức nảy mầm của hạt:
Nuôi cấy phôi hữu tính được dùng để kiểm tra nhanh khả năng nảy mầm của hạt, đặc biệt là các hạt giống có sức sống kém và hạt sau thời gian bảo quản dài. Phương pháp này cho độ chính xác cao.
* Nhân giống các cây hiếm
Hạt của một số cây rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên, vì vậy làm giảm khả năng sinh sản hữu tính của chúng. Bằng cách nuôi cấy phôi tách rời đã thu được rất nhiều cây con. Áp dụng với loài mà hạt có sức sống kém, hạt không có nội nhũ hoặc ít nội nhũ:
ứng dụng


Ứng dụng của nuôi cấy phôi vô tính

Hầu hết các loài thực vật được nhân giống bằng hạt, chẳng hạn như : Hạt lúa, hạt bắp, hạt hoa, hạt rau…. Nhưng đó chỉ là hạt giống hữu tính, được tạo ra từ quá trình thụ phấn ở cây trồng. Như một thể nhân giống, hạt giống có thể được trồng trọt nhanh với  những thiết bị cơ giới. Tuy nhiên, phương pháp nhân giống từ hạt không hiệu quả do tỷ lệ hạt nảy mầm thấp, không đảm bảo độ đồng đều và không đảm bảo về mặt di truyền. Vì vậy, nhân giống vô tính hiện được xem là một phương pháp hiệu quả để tạo ra một số lượng lớn cây giống đạt chất lượng
ứng dụng


Ứng dụng của nhân giống vô tính
Nhân giống nhanh và dễ dàng đối với những đối tượng:
Loài khó sinh sản hữu tính: thời gian ra hoa lâu, tỉ lệ đậu quả ít.
- Không thể nuôi cấy phôi hữu tính được.
- Nhân giông nhanh những kiểu di truyền mong muốn(giống chọn lọc,cây chuyển gen).
- Nhân giống kiểu di truyền giống cha hoặc mẹ
cho sản xuất các thế hệ lai F1.
Ứng dụng của nuôi cấy phôi vô tính
Ứng dụng của công nghệ nuôi cấy phôi vô tính (phôi soma) là:
-Tạo phôi vô tính.
- Tạo củ siêu nhỏ (micro).
- Hạt nhân tạo.
- Công nghệ hóa quá trình nhân giống, vườn ươm và xây dựng mô hình trồng thử.



Ứng dụng của nuôi cấy phôi vô tính




Hạt nhân tạo gồm 3 phần:
+ Phôi vô tính
+ Vỏ bọc polyme (alginate, agrose,…)
+ Màng ngoài (alginat caxi)
Trạng thái phát triển của phôi vô tính được duy trì ở nhiệt độ thấp hoặc dùng các chất ức chế trước khi bao hạt
Khi sử dụng đem hạt vào môi trường thích hợp phôi này sẽ nảy mầm tạo thành cây hoàn chỉnh.
Các bước cơ bản tạo hạt nhân tạo
Tạo mô sẹo phôi hóa
Nuôi và nhân tế bào trong dịch lỏng
Lọc lấy các cụm tế bào phôi hóa nhỏ đồng nhất
Đưa tế bào tiền phôi vao nuôi cấy trong môi trường thích hợp
Làm khô và bọc màng nhân
Tiến hành bảo quản


Thành tựu
Ứng dụng của công nghệ nuôi cấy phôi invitro đã phát triển nhân nhanh một số giống công nghiệp và bán công nghiệp đối với một số loài hoa và cây lâm nghiệp có giá trị kinh tế cao; tuyển chọn được 18 giống hoa Lili, 10 giống Hồng môn với những sắc màu, kiểu dáng đa dạng có giá trị kinh tế cao và trên 15 vạn cây giống Sa nhân, Tếch, Trầm hương... 
Thành tựu


Cho đến nay, trên 200 loài cây trồng đã được nhân giống bằng công nghệ phôi vô tính. Phôi vô tính có thể bảo quản lâu dài và cho nảy mầm vào thời vụ thích hợp. Từ phôi vô tính có thể tạo hạt nhân tạo, đây là yếu tố thuận lợi cho cơ giới hóa và tự dộng hóa nhân giống công nghiệp. Với cây cà phê, từ 1gr sinh khối, trong vài tháng người ta có thể tạo được 60 vạn phôi vô tính có tỷ lệ tái sinh đến 47%.
Thành tựu
1.Hạt khoai tây nhân tạo
Thành tựu
2.Nuôi cấy phôi cây bông và tạo đa chồi (nuôi cấy phôi hữu tính).

 Hình ảnh quá trình tạo đa chồi cây bông từ phôi
Thành tựu

Tái sinh cây bông thông qua chồi soma
Thành tựu
Ứng dụng hệ thống Bioreactor trong sản xuất một lượng lớn các cây dược liệu và hoa cảnh mà chủ yếu là ứng dụng trong nuôi cấy phôi sôma.
- Tạo hạt nhân tạo thành công với cây Địa Lan.
- Hạt địa lan nhân tạo được boc bằng vỏ bọc Sodiumal alginate.
Thành tựu
V- CÁC KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
V.2/ Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời.
* Lược sử:
Wetmore(1946) nuôi cấy đỉnh chồi cây nho dại, cùng với một số tác giả khác, ông đã chứng minh các bộ phận của cây tách rời đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuận lợi.
Lon và Ball (1946) với thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi cây măng tây (Asparagus) đã cho thấy khi nuôi các bộ phận của cây như lá, thân, hoa thì thân có khả năng tạo mô sẹo nhiều hơn.
V.2/ Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời.
* Nhu cầu dinh dưỡng:
Nguồn cacbon dưới dạng đường
Các muối của các nguyên tố đa lượng(Nito, phospho, kali, canxi) và vi lượng (Mg, Fe, Mn, Zn, Co…).
Một số chất hữu cơ đặc biệt như vitamin (B1, B6, axit nicotinic).
* Ứng dụng:
Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời được sử dụng để nghiên cứu:Điều kiện dinh dưỡng đối với các bộ phận và mô khác nhau của cây,để nhân cây invitro, để tạo mô sẹo (callus) phục vụ cho nghiên cứu cơ bản và ứng dụng như phân hóa tế bào và cơ quan, tạo nguyên liệu để chọn dòng tế bào…
Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời
Nuôi cấy mô của cơ quan tách rời:
VD: củ cà rốt cắt lát tách mảnh mạch rây xử lí+ nuôi cấy mô phôi phôi nảy mầm cây non trong ống nghiệm cây trưởng thành
Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng:
Từ 1 mô phân sinh của đỉnh sinh trưởng của rễ hoặc thân nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng sẽ tạo nên cây con
Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời
Nuôi cấy từ mô hay cơ quan:
VD: từ 1 mô lá tách tế bào nuôi cấy trên đĩa Pêtri điều kiện thuận lợi sẽ hình thành những cây non trồng chậu phát triển cây trưởng thành.
V- CÁC KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
V.3/ Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn.
Lược sử:
Những công trình nuôi cấy bao phấn đầu tiên được Guha và Maheshwari (1964) thực hiện ở cây cà độc dược (Datura).
Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã phát triển và hoàn thiện nhờ các công trình của Bourgin và Nitsch (19667) trên thuốc lá, Niizeki và Oono (1968) trên lúa.
Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan.
V.3/ Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn.
2. Hiện tượng sinh sản hữu tính ở thực vật
Nhị hoa
Nhuỵ hoa
Nhuỵ hoa
Nhị hoa
V.3/ Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn.
2.1)Cấu tạo của hoa
Bao phấn
Hạt phấn
Chỉ nhị
Bao phấn phóng to
2.2) Quá trình hình thành hạt phấn và túi phôi
a. Quá trình hình thành hạt phấn
Từ tế bào 2n trong bao phấn của Nhị hoa
4 tiểu bào tử đơn bội (n)
Giảm phân
Mỗi tiểu bào tử đơn bội (n)
Nguyên phân
Hạt phấn có 2 tế bào:1 tế bào sinh sản và 1 tế bào ống phấn
b. Quá trình hình thành túi phôi
Noãn
4 Đại bào tử đơn bội (n)
Từ tế bào 2n của Noãn trong bầu nhuỵ
Giảm phân
Nguyên phân 3 lần
Túi phôi có nhiều nhân,trong đó có 1 tế bào trứng và 1 tế bào nhân tâm (2n) tham gia vào quá trình thụ tinh
1 Đại bào tử đơn bội (n) sống sót
Tế bào trứng
Tế bào nhân tâm (2n)
Bầu nhuỵ
2.2) Quá trình hình thành hạt phấn và túi phôi
2.3) Quá trình thụ phấn và thụ tinh
a. Thụ phấn:
Có 2 hình thức: tự thụ phấn và thụ phấn chéo
b. Thụ tinh
Thụ tinh là sự hợp nhất của nhân giao tử đực với nhân của tế bào trứng trong túi phôi hình thành hợp tử
Thụ tinh kép: Là hiện tượng cả 2 nhân tham gia thụ tinh, nhân thứ nhất hợp nhất với trứng tạo thành hợp tử. Nhân thứ hai hợp nhất với nhân lưỡng bội (2n) tạo thành tế bào tam bội (3n).
Hợp tử(2n)
Nhân nội nhũ (3n)
1.3. Quá trình thụ phấn và thụ tinh
Noãn đã thụ tinh phát triển thành hạt. Hạt chứa hợp tử phát triển thành phôi và tế bào tam bội hình thành nên nội nhũ.
Có 2 loại hạt: Hạt có nội nhũ và hạt không có nội nhũ
b. Hình thành quả
Quả do bầu nhuỵ phát triển thành, chứa hạt, bảo vệ hạt và giúp phát tán hạt.
1.4. Quá trình hình thành hạt, quả
a. Hình thành hạt
Trong chọn giống thực vật để tạo ra dòng thuần chủng người ta tiến hành tự thụ phấn bắt buộc qua nhiều thế hệ, việc này tốn rất nhiều thời gian.
Vì vậy vấn đề đặt ra là làm thế nào trong một thời gian ngắn, chúng ta có thể tạo ra được dòng thuần chủng.
Năm 1934, Stow đã phát hiện ra sự phát triển khác thường của hạt phấn thành những cấu trúc giống túi phôi đã xảy ra ở một số loài thực vật ở Hyacinthus. Hiện tượng này đã cho thấy các hạt phấn có khả năng phân chia để hình thành các tế bào mới hoặc các mô khi được sinh trưởng trong các điều kiện thích hợp và chúng tiếp tục phát triển thành cây đơn bội


Tính đồng hợp tử có được chỉ sau một đời nuôi cấy trong khi đó chọn dòng thuần thông thường phải mất 5 - 6 đời tự thụ phấn.
Cây lưỡng bội hoá tính đồng hợp tử tuyệt đối, trong khi tự thụ phấn thông thường qua nhiều đời mà vẫn còn tồn dư dị hợp tử.
Sự đa dạng di truyền ở quần thể cây lưỡng bội hoá từ nuôi cấy bao phấn hạt phấn lớn hơn quần thể tự thụ phấn tạo dòng thuần sau các đời tự thụ.
Những gen lặn có thể bị che khuất ở các cây nhị bội dị hợp tử nhưng ở cây đơn bội hoặc lưỡng bội hóa từ hạt phấn lại có cơ hội biểu hiện ngay ra thành kiểu hình.
Cây đơn bội có thể dùng trong chọn lọc hồi quy để tạo giống chống bệnh.
Cấy truyền liên tục các dòng callus từ nuôi cấy bao phấn có thể tạo ra biến dị giao tử là nguyên liệu cho chọn giống.
Ưu thế của việc tạo dòng thuần chủng
từ nuôi cấy bao phấn, hạt phấn.
Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tạo cây đơn bội là nhờ sự cảm ứng phát sinh phôi từ những lần phân chia lặp lại của các bào tử đơn bội, các tiểu bào tử, các hạt phấn non. Giai đoạn phát triển đặc thù của bao phấn tại thời điểm nuôi cấy là nhân tố quan trọng nhất đối với sự thành công của phát sinh phôi.

Thực vật hạt kín, mỗi chồi hoa có thể chứa các bao phấn ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Vì vậy, mỗi chồi hoa phải được kiểm tra để xác định tất cả các giai đoạn phát triển giúp lựa chọn những bao phấn có độ tuổi phù hợp cho nuôi cấy.
5.1) Đặc điểm của nuôi cấy bao phấn và hạt phấn.
Quy trình và những điều kiện ảnh hưởng
đến nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
5.2). Các phương pháp cơ bản sử dụng trong
nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
Có 2 phương pháp cơ bản được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là:
Phương pháp1: Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc môi trường lỏng và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn.
Phương pháp 2: Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn hoặc bằng phương pháp cơ học hoặc do nứt nẻ tự nhiên của bao phấn và được nuôi trên môi trường lỏng.



5.3) Quy trình nuôi cấy
Chọn bao phấn: Bao phấn thích hợp nhất có chứa hạt phấn bắt đầu từ thể 4 nhân đến ngay sau lần nguyên phân thứ nhất. Bao phấn của các hoa đầu tiên cho kết quả tốt hơn bao phấn của hoa muộn.
Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để nuôi cấy, nhằm kích thích sự phân chia của hạt phấn và từ đó tạo cây đơn bội.
Chọn môi trường tái sinh cây thích hợp: Tùy theo đối tượng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn mà chúng ta lựa chọn môi trường thích hợp tương ứng.
Chọn lọc cây đơn bội: có nhiều cách để xác định cây đơn bội như: làm tiêu bản để đếm số lượng nhiễm sắc thể, đo hàm lượng DNA trong tế bào, so sánh cây tái sinh từ bao phấn với cây mẹ về khả năng sinh trưởng, hình thái, kích thước.
Sơ đồ tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn
Tách các bao phấn
Khử trùng bề mặt
Nhuộm acetoarmine để xác định
GĐPT của hạt phấn
Nuôi cấy trên
mt đặc
Nuôi cấy trên
mt lỏng
Phát triển phôi
Loại bỏ chỉ nhị
Cây đơn bội
Hoa
5.4). Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo cây
đơn bội trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn in vitro
Cây đơn bội chỉ thu được khi cấy bao phấn chứa hạt phấn ở giai đoạn phát triển thích hợp, bắt đầu từ thể 4 nhân cho đến ngay sau lần nguyên phân đầu tiên.
a. Tuổi hạt phấn.
b. Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn và hạt phấn
Kết quả tạo cây đơn bội phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của cây bố, mẹ cho bao phấn, hạt phấn. Trạng thái sinh lý lại liên quan đến điều kiện môi trường mà cây sinh trưởng như: quang chu kỳ, cường độ ánh sáng, nhiệt độ và môi trường dinh dưỡng khoáng.
Khả năng thành công cao nhất với những bao phấn thu được trong lần trổ hoa đầu tiên và giảm dần trong những lần trổ hoa tiếp theo.
Sử dụng bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh sáng cao, ngày ngắn sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao hơn.
c.Tiền xử lý bao phấn và hạt phấn
Hiệu quả nuôi cấy bao phấn, hạt phấn cao hơn khi tiến hành xử lý mẫu trước khi cấy.
Xử lý Nhiệt độ lạnh đã làm tăng khả năng tạo mô sẹo và cây từ bao phấn, đồng thời cho phép bảo quản mẫu lâu hơn.
Bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh sáng cao, trong điều kiện ngắn ngày sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao hơn.
d. Mật độ bao phấn, hạt phấn
Phản ứng sinh trưởng trong nuôi cấy đơn bội bị chi phối bởi mật độ bao phấn, hạt phấn nuôi cấy trên môi trường và thay đổi tùy theo loài thực vật.
5.4). Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo cây
đơn bội trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn in vitro
Nuôi cấy bao phấn:
Vì bao phấn có kích thước lớn nên thao tác dễ dàng.
Môi trường nuôi cấy đơn giản.
Nuôi cấy hạt phấn:
Tạo ra giống cây trồng sạch bệnh.
Giống tạo ra có phẩm chất di truyền đồng đều.
Phát sinh phôi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy.
Tạo cây đơn bội thuận lợi cho việc nghiên cứu di truyền.
Tóm lại, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ra đời đã làm giảm thời gian, đồng thời làm tăng vọt số lượng các cá thể đơn bội thu được.
6.1 Ưu điểm
6.2) Nhược điểm
Nuôi cấy hạt phấn:
Khó thao tác do hạt phấn có kích thước nhỏ.
Các giai đoạn phát triển của hạt phấn không đồng đều nên hiệu suất tạo cây đơn bội không cao.
Hạt phấn là vật liệu quan trọng để gây đột biến và chuyển nạp gen, tuy nhiên nó ít được sử dụng vì làm giảm tỉ lệ tái sinh cây
Nuôi cấy bao phấn:
Khó sàng lọc cây đơn bội.
Khi nuôi cấy bao phấn thường gặp hiện tượng bạch tạng
Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tạo cây đơn bội phức tạp, phụ thuộc nhiều yếu tố: tuổi hạt phấn, trạng thái sinh lý của bao phấn và hạt phấn, kiểu gen, kinh nghiệm…


7.1).Thành tựu:
Trong lĩnh vực nông nghiệp, các kết quả nghiên cứu về công nghệ tế bào - mô phôi thực vật giúp chúng ta nhanh chóng tạo ra các giống cây trồng thuần. Hàng loạt dòng thuần ở lúa (ĐV2, MT4, DT26...) đã được tạo ra bằng kĩ thuật đơn bội nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn. Đặc biệt, chúng ta đã sản xuất được dòng lúa thuần mang gene quý như gene bất dục đực tế bào chất, bất dục đực nhân (gen TGMS, PGMS). Đối với ngô, đã tạo được 5 dòng ngô thuần và hai tổ hợp ngô lai có triển vọng.
Thành tựu và hiện trạng
7.1).Thành tựu:
Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào phát triển nhanh v