Bai giang tin sinh hoc 3

THIẾT KẾ TRÌNH TỰ MỒI
TRONG PHẢN ỨNG PCR BẰNG FASTPCR VÀ
DNA CLUB

Mục tiêu của bài học
Thiết kế được những trình tự primer cho những trình tự DNA khuôn (vi sinh vật, virus và các động vật khác)




Phân tích được những thông số của primer qua các phần mềm





Tìm kiếm trình tự sinh học
2
Quá trình sao chép DNA trong tế bào
Giới thiệu môn học
3
Qui trình phản ứng PCR
Giới thiệu môn học
4
Các vi sinh vật,
động vật
Thu nhận mẫu
Kỹ thuật PCR lần đầu tiên được Mullis và cộng sự mô tả vào năm 1986 và cũng do
chính phát minh này Mullis đã được trao giải nobel vào năm 1993
Thành phần trong phản ứng PCR
Phản ứng PCR được thực hiện khi có:
DNA mẫu
Primers (mồi xuôi và ngược dài khoảng 18-30 bp không bắt cặp bổ sung )
Taq polymerase ( emzyme chịu nhiệt tách từ vi khuẩn suối mước nóng Thermus aquaticus )
4 loại deoxiribomucleotid triphọtphat (dATP , dCTP, dTTP , dGTP) ,
Dung dịch đệm và Mg2+
Giới thiệu môn học
5
MÁY PCR
Giới thiệu môn học
6



PCR là một kỹ thuật duy nhất để khuếch đại một mẫu DNA mong muốn khuếch đại (ví dụ những đoạn gene của vi sinh vật, vi khuẩn hay những đoạn gene của người và những động vật khác)
Nguyên tắc trong phản ứng PCR
Giới thiệu môn học
7
Biến tính
Bắt cặp
Kéo dài
Nguyên tắc trong phản ứng PCR
Giới thiệu môn học
8
Phản ứng PCR gồm có 3 giai đoạn:
• Biến tính DNA mẫu T=940C

• Bắt cặp mồi Tm = 550C-650C

• Giai đoạn kéo dài, tổng hợp DNA mới T kéo dài =700C

Mục đích, nguyên tắc
Mồi là những đoạn nucleotide ngắn, bắt cặp bổ sung với đầu 5` hay đầu 3` của mạch DNA khuôn mẫu. Mồi được thiết kế dựa vào 2 vùng trình tự đã được biết, nằm ở hai đầu của đoạn gen cần khuếch đại.

Giới thiệu môn học
9
Forward primer
Reverse primer
Đoạn DNA cần khuếch đại
Primer là gì?

Primer là một đoạn ngắn oligonucleotide nó là khả năng bắt cặp bổ sung với DNA khuôn


Primer sẽ bắt cặp với đoạn DNA khuôn (DNA mục tiêu) cần khuếch đại số lượng lớn DNA
10
Tìm kiếm trình tự sinh học
Đặc tính của primer
1. Tính chuyên biệt

2. Tính ổn định nhiệt độ của phản ứng

3. Tính tương thích cặp primer
Giới thiệu môn học
11
Tính chuyên biệt
Chỉ có duy nhất một vị trí bắt cặp của primer trên khuôn DNA.



Primer càng dài thì nó càng thể hiện tính duy nhất và nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ bắt cặp càng cao. Để đảm bảo tính duy nhất chiều dài của primer 17-28 base.

Thành phần (G+C) trung bình khoảng từ 50-60% sẽ cho ta nhiệt độ lai
Giới thiệu môn học
12
Template DNA 5’...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3’
GTTGAACGTA GTTGAACGTA
CAGTCAACTGCTAC

Tính chuyên biệt
Giới thiệu môn học
13

Tỷ lệ G/C trung bình khoảng từ 50-60% sẽ cho ta nhiệt
độ lai thích hợp
Nhiệt độ của primer
1. Nhiệt độ nóng chảy:
Tmealt: Nhiệt độ nóng chảy là nhiệt độ của mồi khi chưa bắt cặp với DNA khuôn Tmprimer=59.9+0.41*(%GC)-600/(chiều dài nucleotide) khi mồi chưa bắt cặp với DNA, thường nhiệt độ nóng chảy từ 55-650C.
2. Nhiệt độ bắt cặp:
Tanneal:Là nhiệt độ của đoạn mồi bắt cặp với DNA khuôn
Tanneal= Tm-primer -40C
Giới thiệu môn học
14
Tính ổn định
Nhiệt độ nóng chảy của mồi Tm và nhiệt độ bắt cặp của mồi T anneal là hai yếu tố quan trọng để đảm bảo phản ứng PCR thành công và thu được sản phẩm khuếch đại (một số lượng lớn bản sao của đoạn DNA dùng làm khuôn ban đầu).

Việc tính toán bằng phương pháp thủ công để kiểm tra các yêu cầu trên cho mỗi đoạn mồi dự định thiết kế là rất tốn thưòi gian và công sức. Công việc này trở nên dễ dàng và nhanh chóng nhờ các phần mềm thiết kế mồi.
Giới thiệu môn học
15
Tính ổn định
Giới thiệu môn học
16
Cấu trúc kẹp tóc
Thiết kế mồi
Giới thiệu môn học
17
Trình tự DNA khuôn
Các qui tắc chọn primer
Thông số của phản ứng PCR
Thiết kế

Primer
Lấy các thông số từ phần mềm

2. Kiểm tra đặc hiệu của Primer bằng blast





Làm thế nào để biết trình tự khuôn
Giải trình tự DNA hoặc RNA của các sinh vật (chúng ta sẽ biết tự nucleotide của sinh vật) từ đó thiết kế phản ứng mồi theo trình tự đã giải.



Chúng ta có thể lấy trình tự nucleotide của các sinh vật trên cơ sở dữ liệu NCBI rồi từ đó thiết kế những primer qua những phần mềm thiết kế PCR
Giới thiệu môn học
18
Trình tự DNA khuôn
- Trình tự đích quan trọng trong phát hiện vi sinh vật

- Trình tự vừa có vùng bảo tồn cao cho một nhóm vi sinh vật và vừa có vùng biến động đặc trưng cho từng loài riêng biệt

Ví dụ 1: Các loài Ecoli co gen mã hóa ngoại độc tố: ST (heat stable) và heat labile (LT) bảo tồn cao
Ví dụ 2: Enterotoxigenic E. coli (ETEC), Enteropathogenic E. coli (EPEC), Enteroinvasive E. coli (EIEC), Enterohemorrhagic E. coli (EHEC), Enteroaggregative E. coli (EAEC) chọn ra những gene đặc trưng cho từng loài ETEC, EPEC, EIEC và EHEC.



19
Tìm kiếm trình tự sinh học
Tính tương thích
Mồi làm việc theo cặp, mồi xuôi và mồi ngược. Chúng sử được sử dụng trong cùng điều kiện của phản ứng PCR.

Một đặc điểm phải chú ý nhất về sự hòa hợp này là nhiệt độ bắt cặp (Tanneal)

Nhiệt độ này thể hiện sự tương thích giữa mồi xuôi và mồi ngược
Giới thiệu môn học
20
Các thông số phản ứng PCR qua phần mềm
Giới thiệu môn học
21
Nhập trình tự mồi
Giới thiệu môn học
22
Thu nhận Gene PMWAV qua mã số truy cập
Giới thiệu môn học
23
DNA club
Giới thiệu môn học
24
Bước 1: Nhập trình tự
DNA club
Giới thiệu môn học
25
Bước 2: Chọn start primer selection
Những điều kiện của phản ứng PCR
Giới thiệu môn học
26
Chức năng đánh giá
Giới thiệu môn học
27
Danh sách những đoạn mồi do DNAclub tìm được
Giới thiệu môn học
28
Danh sách những đoạn mồi
Giới thiệu môn học
29
Chọn những đoạn mồi tốt nhất
Giới thiệu môn học
30
Chức năng đánh giá
Giới thiệu môn học
31
Sử dụng PDA (primer Design Assistnat)
Giới thiệu môn học
32
http://dbb.nhri.org.tw/primer/
Sử dụng phần mềm FastPCR
Giới thiệu môn học
33
Kết quả phản ứng của Tm của mồi xuôi
Giới thiệu môn học
34
Kết quả phân tích mồi ngược
Giới thiệu môn học
35
Chức năng đánh giá độ đặc hiệu mồi
Giới thiệu môn học
36
Kết quả của độ đặc hiệu mồi
Giới thiệu môn học
37
Kiểm tra độ đặc hiệu mồi bằng blast
Giới thiệu môn học
38
Nucleotide blast
Giới thiệu môn học
39
Nhập trình tự mồi
Giới thiệu môn học
40
agtggcttgccgctacgactccactgtctgaaaacagccgac
Tính tương đồng của của các primer
Giới thiệu môn học
41
Độ đặc hiệu của mồi
Giới thiệu môn học
42
Độ đặc hiệu của mồi
Giới thiệu môn học
43
10R1_13785-13806
-Hệ số Expect: Xác suất của các trình tự tương đồng. E càng nhỏ độ đặc hiệu càng cao.

- Score và Excpect tỷ lệ nghịch.
Bài tập
1. Hãy thiết kế đoạn mồi dùng cho phản ứng PCR nhằm khuếch đại đoạn gen từ vị trí 156 đến 620 trong trình tự gen myoglobin của người, có mã số truy cập là NM_203378
2. Hãy kiểm tra tính duy nhất của mồi vừa thiết kế bằng phương pháp blast và cho biết tính đặc hiệu của mồi vừa thiết kế
3. Hãy phát hiện Salmonella enterica bằng phương pháp PCR. Hãy kiểm tra lại bằng blast và kiểm tra khả năng hình thành dimer, hairpin…
Giới thiệu môn học
44