Bai giảng PCR

TRƯỜNG CAO ĐẲNG CÔNG NGHIỆP TUY HÒA
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA
Tên bài giảng: PHƯƠNG PHÁP PCR
Giáo viên : LÊ QUỐC HỘI
1.Khái quát chung về PCR
1.1 Khái niệm
- PCR (Polymerase chain reactions) là một phương pháp tạo dòng in vitro nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA trong ống nghiệm mà không cần sử dụng các sinh vật sống..
PCR được phát minh năm 1985

Giải Nobel Hóa học 1993
Kary Mullis
- Tách dòng gene.
- Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm
- Chuẩn đoán những bệnh
- Xác định các đoạn trình tự cần nghiên cứu
- Phát hiện đột biến
- Nghiên cứu quá trình tiến hoá phân tử
- Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm
- Chọn giống vật nuôi, cây trồng
- Xác định các loài mới, các loài đặc hữu
- Là kỹ thuật nền cho các kỹ thuật khác như: RAPD, SSR…
1.Khái quát chung về PCR
1.2. Ứng dụng
Tạo dòng gen sử dụng Plasmid
1.Khái quát chung về PCR
1.2. Ứng dụng
2. Nguyên tắc và quy trình PCR
2.1 Nguyên tắc PCR
+ Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzim helicase.
+ Kết hợp với enzim DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới trong môi trường thích hợp.
+ Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên biệt, chủ động.
- Tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể nhưng có sự khác biệt:
2. Nguyên tắc và quy trình PCR
2.2 Quy trình PCR
Biến tính
94-96 °C
Mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn.
30s-1 phút
Gắn mồi
30s-1 phút
40-70 °C
Mồi bắt cặp với khuôn theo chiều 5/-3/
DNA polymerase gắn tiếp vào đoạn mồi. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA, tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc.
720 C
Kéo dài 30s đến nhiều phút
Tổng hợp hay kéo dài
2. Nguyên tắc và quy trình PCR
2.2 Quy trình PCR

Lượng bản sao tăng theo cấp số nhân
2  4  8  16  32  64 128  256  512  1028
2. Nguyên tắc và quy trình PCR
2.2 Quy trình PCR
4.1Thành phần phản ứng
Buffer
Ổn định pH
DNA khuôn
Mồi
Xuôi và Ngược
Nucleotides
Để tổng hợp DNA
Men polymerase
Taq polymerase
MgCl2
Tăng hoạt lực của men
Cần nhiệt độ chính xác
Máy PCR
Tự động điều chỉnh nhiệt độ theo chu kỳ
3. Các yêu cầu trong PCR
3.1 Thành phần môi trường
* Nước
- Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAase, enzim cắt giới hạn…
3. Các yêu cầu trong PCR
3.1 Thành phần môi trường
- Là mẫu DNA mà chúng ta sẽ khuếch đại. Có thể là DNA kép, đơn, hoặc RNA được tách chiết từ các đối tượng nghiên cứu. DNA khuôn có độ nguyên vẹn cao, thật tinh sạch tránh lẫn tạp chất.
Mồi PCR
Tại sao cần có mồi PCR
Polymerase chỉ có thể bắt đầu quá trình tổng hợp từ sợi đôi
Bắt đầu tại nơi mồi gắn vào
Mồi PCR là gì?
Các đoạn DNA ngắn, được tổng hợp nhân tạo
18-28 Nu
Tương ứng với DNA khuôn
Tm=(GC)*4+(AT)*2
3. Các yêu cầu trong PCR
3.1 Thành phần môi trường
- Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA. Chúng nhận ra phần DNA cần được nhân lên, bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi và một mồi ngược.
- Trong phương pháp PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính :
+ Khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3’ (là đầu mà nó xúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi
+ Quyết định nên tính đặc hiệu của sản phẩm PCR, vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu
Thermus aquaticus
Vi khuẩn Thermus aquaticus được phát hiện lần đầu tiên ở một con suối nước nóng ở khu vực Great Fountain của the Lower Geyser Basin tại công viên quốc gia Yellowstone. Taq polymerase được tách chiết từ vi khuẩn này
Taq polymerase cần 30-60s để tổng hợp 1 kilo base. Vì vậy thời gian kéo dài phụ thuộc vào kích thước sản phẩm
Hoạt động của men DNA polymerase luôn theo hướng 5’ 3’


3’
5’
3’
5’
5’
5’
3’
3’
Điều kiện PCR chuẩn
Hầu hết DNA có thể được khuếch đại dưới điều kiện chuẩn
Thành phần cho phản ứng 100 µL
DNA khuôn 103 – 104 phân tử
Mồi 0,2 uM mỗi mồi
MgCl2 1.5 mM
dNTP 50 µM mỗi loại
Taq DNA polymerase 2 units
Chương trình PCR 30-40 chu kỳ:
Biến tính 94ºC, 30 giây
Mồi bắt cặp 55ºC, 30 giây
Kéo dài 72ºC, 30 giây
Chu kỳ cuối: kéo dài lần cuối ở 72ºC, 5 phút
Kinh nghiệm PCR


Không bao giờ pha 1 phản ứng PCR duy nhất
Nên chuẩn bị hỗn hợp chủ (master mix)
Buffer, mồi, MgCl2, nước, dNTPs, Taq
Khi tính thể tích master mix, nên trừ hao thêm 1 mẫu vì hao hụt trong quá trình hút bằng pipet
Chứng âm
Không có DNA khuôn
Kiểm tra sự nhiễm
Chứng dương
Để kiểm tra hoạt động của mix pha
Điện đi: http://207.207.4.198/pub/flash/4/4.html
Các vần đề thường gặp khi làm PCR


Nhiễm
Không có sản phẩm hoặc nồng độ sản phẩm yếu
Mồi tự bắt cặp
Sản phẩm phụ
Vấn đề tệ nhất – NHIỄM
Sự sao chép quá mức DNA khuôn
Quá nhạy
Một lượng rất nhỏ chất nhiễm có thể gây ra nhiều trục trặc

Thủ phạm chính
Sản phẩm PCR
Các đoạn DNA ngắn hoàn toàn tương ứng
Nồng độ quá cao
Có thể lấn át khuôn DNA mới
Giải pháp cho vấn đề nhiễm
Dùng hóa chất tiệt trùng
Tách khu vực tiền PCR và hậu PCR
Luôn dùng chứng âm
Chia hóa chất thành nhiều ống nhỏ
Có thể bỏ đi khi có trục trặc
Dùng đầu côn lọc
Hút cẩn thận bằng pipet
Sản phẩm không có hoặc yếu
Quên một thành phần nào đó
Kiểm tra lại sổ thí nghiệm
Lặp lại thí nghiệm
Nồng độ sai
DNA khuôn
Mồi
Taq
MgCl2
Sai mồi
Kiểm tra trình tự
Thay mồi khác
Dùng chứng dương
Mẫu DNA không tốt
Kiểm tra mẫu trên gel agarose
Xem sự tách đoạn
Chất ức chế PCR
Bổ sung quá nhiều
Điều kiện phản ứng sai
Giảm tính chính xác
Giảm nhiệt độ bắt cặp
Tăng lượng MgCl2
Nhuộm không tốt
Kiểm tra hình ảnh
Dùng thang chuẩn
Mồi tự bắt cặp
Mồi tự bắt cặp với nhau
Sản phẩm nhỏ 50-100 bp
Thường do vần đề DNA khuôn
Mồi luôn cố gắn vào trình tự nào đó
Giải pháp
Chứng dương
Thiết kế lại mồi
Dùng Hot Start
Dimer
Hairpin loops
Sản phẩm không đặc hiệu
Cách phát hiện
Điện di trên gel agarose
Kích thước sản phẩm sai
Luôn dùng thang chuẩn
Biết kích thước
Giải pháp
Tăng độ chính xác
Tăng nhiệt độ bắt cặp
Giảm lượng MgCl2
Thay đổi chương trình
Thời gian kéo dài
Dùng nhiều mồi khác nhau
Giảm số chu kỳ
Ưu khuyết điểm của PCR:
Ưu điểm:
Hiệu quả cao: hoạt động trên một lượng DNA cực nhỏ
Tính đặc hiệu cao
Nhiều mồi hoạt động trên phạm vi đối tượng rộng (thực vật, động vật, nấm mốc)
Đơn giản hóa quá trình giải trình tự DNA

Khuyết điểm:
Khó khăn và tốn kém khi tạo mồi PCR
Gặp trục trặc khi phản ứng thất bại