Bài giảng CNSH

PGS.TS. Nông Văn Hải
Viện Công nghệ Sinh học
Bài giảng kỹ thuật xác định trình tự gen

Kỹ thuật xác định trình tự gen
Công nghệ sinh học nano
Nội dung
K? thu?t xác định trình tự gen
Nội dung

Nguyên lý của các phương pháp phân tích
trình tự gen
Phương pháp Sanger
Phương pháp Maxam-Gilbert

Phương pháp phân tích trình tự gen tự động
Hoá học/ Phản ứng chuỗi (dây chuyền) polymerase
Thiết bị
Các phần mềm/ Các cơ sở dữ liêu gen quốc tế
Xử lý số liệu/ Đăng ký dữ liệu gen
DNA/RNA
Cấu trúc phân tử của đường Ribose và Deoxyribose
Tr¹ng th¸i tù nhiªn
Tr¹ng th¸i biÕn tÝnh sîi ®¬n
Tr¹ng th¸i l¹i tÝnh
Đinh nghĩa: giải trình tự gen
Là phương pháp thực nghiệm để xác định trình tự nucleotide của một đoạn ADN
Xác định chính xác trật tự sắp xếp của các cặp trọng một đoạn ADN www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/gene27.html
Phân tích trình tự của các đơn vị mang thông tin di truyền. www.mwgbiotech.com/html/glossary/glossary_overview.shtml
Lịch sử phân tích trình tự gen
1870 Mischer: Phát minh DNA
1940 Avery: DNA là "chất liệu di truyền"
1953 Watson & Crick: Cấu trúc xoắn kép của DNA
1965 Holley: Trình tự của tRNA nấm men
1977 Wu: Trình tự của đầu dính DNA thực khuẩn ?
1977 Sanger: Phương pháp dừng chuỗi bằng dideoxy
Maxam & Gilbert: Phương pháp phân giải hoá học

1980 Messing: Chọn dòng trong thực khuẩn M13
1986 Hood et al: Tự động hoá một phần
1990 Phân tích trình tự bằng chu trình nhiệt (PCR); các
enzyme được hoàn thiện để đọc trình tự; các hệ thống
dò huỳnh quang được hoàn thiện (đọc qua ống mao
dẫn)
2002 Tự động hoá phòng thí nghiệm
1
15

150
1.500

25.000


50.000




200.000
Hiệu suất
bp/người/năm
53.000.000
Phân bố số lượng genom đã được giải trình tự
hoàn toàn ở các sinh vật




Archea (16)
Eukarya (20)
Bacteria (139)
Viruses (1500)
Nguyên lý của các phương pháp phân tích trình tự gen
Phương pháp Sanger
Frederick (Fred) Sanger
Phương pháp Maxam-Gilbert
Walter Gilbert
Phản ứng chuỗi/dây chuyền (của/bằng/nhờ/do) Polymerase
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Kary Mullis
Giải Nobel về hoá học, 1993
POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR
A `licence` to do molecular biology
A key central technique that has revolutionised molecular and consequently cell biology
Schematic illustration of PCR steps
Sơ đồ minh họa các buớc PCR











From: Recombinant DNA by Watson, Gilman, Witkowski & Zoller
Target Amplification
No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
20 1,048,576
30 1,073,741,824
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
7 cycle = 128 Amplicon
Các phuong pháp xác d?nh trình t? gene
Phương pháp Maxam-Gilbert (hoá học)
Phương pháp được phát minh đầu tiên nhưng đến nay ít được sử dụng, chỉ dùng cho “footprinting”

Phương pháp Sanger (enzyme)
Sử dụng DNA polymerase, primer, dNTP và một lượng nhỏ ddNTP (để kết thúc chuỗi)
5’-
Xử lý bằng hoá chất cắt đặc hiệu tại một base nào đó
4 ống
G-rxn
A>G
-rxn
T>C
-rxn
C-rxn
5’-
5’-
5’-
C
Khi phản ứng kết thúc mỗi sợi chỉ được cắt 1 lần
ddNTP Reaction Mix
PHƯƠNG PHÁP MAXAM-GILBERT
Sợi đánh dấu (P32)
C
C
Trình tự được đọc trực tiếp
autoradiograph of dried sequencing gel
C T A G

3’
G
C
A
T
T
C
C
A
T
A
G
G
5’
5’-
DNA Polymerase
+dNTPs
+ one of:
primer
4 tubes
ddCTP
ddTTP
ddATP
ddGTP
5’-
5’-
5’-
C
C
C
In the ddGTP reaction there is a random chance a ddGTP will be incorporated across from a C
C T A G
ddNTP Reaction Mix

5’
C
G
T
A
A
G
G
T
A
T
C
C
3’
PHƯƠNG PHÁP SANGER
End labeled
Sequence is complementary
to the strand being sequenced!
autoradiograph of dried sequencing gel
DNA Sequencing sau khi tạo dòng phân tử
Plasmid (or phage) with cloned DNA fragment
Dideoxy-Nucleotides
O
(P)-(P)-(P)-
H
Base
dNTP
ddNTP
If a ddNTP is added to a growing DNA chain, the sequence is terminated, because another base can not be added
OH
Dideoxynucleotides
DNA Sequencing using the Sanger method involves the use of 2`3`-dideoxynucleotide triphosphates in addition to regular 2`-deoxynucleotide triphosphates
Because 2`3`-dideoxynucleotide triphosphates lack a 3` hydroxyl group, and DNA polymerization occurs only in the 3` direction, once 2`3`-dideoxynucleotide triphosphates are incorporated, primer extension stops
2’-dideoxynucleotide
monophosphate
2`3`
dideoxy-nucleotides
Terminate
DNA
Replicaton
Phương pháp phân tích trình tự gen tự động
Hoá học: Phản ứng chuỗi (dây chuyền) polymerase
Các thiết bị
Các phần mềm/ Các cơ sở dữ liêu gen quốc tế
Xử lý số liệu/ Đăng ký dữ liệu gen
The dideoxy method has been modified so it can be done in one tube. In this case all of the ddNTP’s are labeled with different, coloured fluorescent molecules
This makes automation much simpler, reduces the cost of the reactions, and speeds up the process tremendously. Large sequencing centres use this method and can read millions of bp every single day
Sequencing Data
Máy giải trình tự DNA tự động
(Automated DNA Sequencers)
ABI: ABI 377, 310, 3100, 3100 Avant, 3700, 3730.
Amersham: MegaBace 500, 100
Beckman-Coulter: CE2000, 8000
Li-Cor:
Shimatzu: DSQ1000, 2000.
.
Tại Việt Nam:
ABI 3100 Avant (4 capillaries): 5/ VCNSH, TTCNSH (ĐHQGHN); ĐHYHN, VVSDTTW (sắp mua 2?)
ABI 310 (1 Capillary): 4/ĐH Thái Nguyên; VDTNN, VKHHS, ĐH Cần Thơ?
ABI 377: 1/ VKHHS
Pharmacia Biotech ALF: 4/ĐHKHTN ĐHQGHN, ĐHKHTN ĐHQGtpHCM, VCNSH, ĐHBK
Beckman- Coulter CE2000: 2/Viện Pasteur TPHCM; TT Welcome Trust)
??? Viện Chăn nuôi, VQY108, HVQY...
ABI sequencers
ABI 377
ABI 373
ABI 371
ABI Automated Sequencers (contd.)
ABI 310
ABI 3700
ABI 3100Avant
ABI 3100
Lý giải trình tự DNA
123123123
654654654
Khung đọc mở 2
Khung đọc mở 1
Bùng nổ thông tin sinh học !!!
Các Cơ sở dữ liệu gen Quốc tế
NCBI (USA); EMBL/EBI (EU); DDBJ (Nhật Bản)
NCBI- Trung tâm Quốc gia về Tin học Công nghệ Sinh học Hoa Kỳ
Cơ sở dữ liệu gen: GENBANK
Số trình tự gen được đăng ký trong các Ngân hàng gen
quốc tế tăng lên hàng năm theo hàm số mũ (exponential)
Currently 5.4 Million Sequence Entries in GenBank
4.6 Billion Bases from ~50,000 Species