Bài giảng CNSH

Bài giảng
Công nghệ gen thực vât
PLANT GENE TECHNOLOGY
PGS. TS. Nông Văn Hải

NCVCC, Phó Viện trưởng,
Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen
Viện Công nghệ sinh học
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Tel/Fax (04).3836322 Email: [email protected]
Nội dung môn học
Bài 1. Giới thiệu chung về CNGTV
(Introduction on Plant Gene Technology)
Bài 2. Hệ gen học thực vật (Plant Genomics)
và các môn học có liên quan
Bài 3. Các chỉ thị phân tử (Molecular Markers)
trong nghiên cứu thực vật
Bài 4. Chuyển gen/ biến nạp gen thực vật
(Plant Gene Transfer/ Transformation)
Bài 5. An toàn sinh học sinh vật/ cây trồng biến đổi gen
Biosafety of Genetically Modified Organisms/Crops (GMOs/GMCs) và sở hữu trí tuệ (Intellectual Property Rights, IPRs) trong lĩnh vực CNGTV

Tài liệu học tập & Kế hoạch thi
Các bài giảng của PGS. TS. Nông Văn Hải
Các bài giảng của TS. Chu Hoàng Hà (Nhóm SH thực nghiệm)
Các bài tổng quan Tạp chí CNSH
Các giáo trình, sách tham khảo khác
Internet

Kế hoạch thi:
Tiểu luận: 10-15 tr. (Mở đầu, Các nội dung chính, Kết luận, Tài liệu tham khảo): nộp tuần đầu tháng 5?
Thi viết (120 phút): tuần đầu tháng 5?
Bài 1.
Giới thiệu chung
về công nghệ gen thực vật


Các định nghĩa, khái niêm
Lịch sử hình thành và phát triển của CNGTV
Thành tựu và triển vọng của CNGTV
Các định nghĩa, khái niệm
Các bộ môn khoa học/ công nghệ có liên quan
Molecular Biology: Sinh học phân tử
Molecular Genetics: Di truyền học phân tử
Molecular Biochemistry: Hóa sinh phân tử
Molecular Microbiology: Vi sinh vật học phân tử
Genetic Engineering: Kỹ thuật di truyền/ Kỹ thuật gen
Genetic manipulation: Thao tác di truyền
Gene/DNA manipulation: Thao tác gen/DNA
Gene Technology: Công nghệ gen
Gene Cloning: Molecular Cloning: Tạo dòng gen/
(Recombinant) DNA Technology: Công nghệ DNA (tái tổ hợp)
Genomics (Hệ/ Bộ gen học)
(Structural Genomics: Hệ/ Bộ gen học cấu trúc)
Transcriptomics: Hệ phiên mã học
Proteomics: Hệ/ Bộ protein học
(Functional Genomics: Hệ gen học chức năng)
Protein Engineering/ Protein Designing (thiết kế protein)
Molecular Bioengineering (Kỹ nghệ/ Công nghệ sinh học phân tử)
Metabolomics: Hệ trao đổi chất học
Bioinformatics (Tin sinh học)
NanoBiotechnology (Công nghệ sinh học Nano)
etc.
Các thuật ngữ
Các thuật ngữ chung của sinh học phân tử và công nghệ gen
Các thuật ngữ riêng trong CNGTV
Chuyển gen thực vật: Plant gene transfer
Biến nạp gen thực vật: Plant transformation
Sinh vật/ cây trồng biến đổi gen: GMOs/GMCs
Cây trồng chuyển gen: Transgenic plants
Cây trồng công nghệ gen: GE crops
Cây trồng công nghệ sinh học: Biotech crops
Chọn giống nhờ/ bằng/ có trợ giúp bằng chỉ thị (phân tử): Marker Assisted Selection (MAS)
An toàn sinh học: Biosafety
…
Lịch sử hình thành và phát triển
công nghệ gen thực vật
Năm 1859, Charles Darwin đã xuất bản cuốn sách: “Nguồn gốc các loài”, đây chính là nền tảng của Học thuyết Tiến hóa và cơ chế của chọn lọc tự nhiên. Quan điểm này của Darwin đã đồng thời thách thức các quan điểm khoa học và các quan điểm tôn giáo của văn hóa phương Tây đã từng được chấp nhận hàng thế kỷ trước đó. Ngay trong lần đầu xuất bản, cuốn sách đã được bán hết chỉ trong 1 ngày. Các nhà thần học thời đó đã nhanh chóng gọi Darwin là: “kẻ nguy hiểm nhất nước Anh”… Nhưng, sau khi đọc cuốn sách, người bạn đồng thời cũng là đồng nghiệp của Darwin, T.H Huxley lại cho rằng: “Thật vô cùng ngu ngốc khi không nghĩ về điều đó.”
Năm 1865, kỷ nguyên của Di truyền học được mở đầu nhờ công lao của Gregor Mendel, khi ông nghiên cứu các tính trạng di truyền của các cây đậu Hà Lan. Ông đã đưa ra các quy luật cơ bản về sự di truyền (cho tới nay, các quy luật này vẫn đúng đối với tất cả các sinh vật). Phát hiện của Mendel về “các nhân tố di truyền” (các gen) không được các nhà khoa học chấp nhận trong suốt hơn 35 năm.
DI TRUYỂN NHIỄM SẮC THỂ
Năm 1910, Thomas Hunt Morgan đã đề xuất học thuyết về sự di truyền của các nhiễm sắc thể. Morgan cho rằng các gen được sắp xếp dọc trên các nhiễm sắc thể dựa trên những mô tả tính chất vật lý của một gen đặc biệt trên một nhiễm sắc thể đặc biệt. Morgan đã được nhận giải thưởng Nobel Y học năm 1933.
MỘT GENE, MỘT ENZYME
Năm 1941, George Beadle và Edward Tatum đã đưa ra giả thuyết “một gen, một enzyme”. Ông cho rằng một gene sẽ sinh ra một enzyme hoặc một protein. Hai ông cùng chung nhau nhận giải thưởng Nobel Y học năm 1958.
THÍ NGHIỆM WARING BLENDER
Năm 1952, Martha Chase và Alfred Hershey đã tách được prtein vỏ của virus khỏi DNA, từ đó, khẳng định rằng DNA là vật chất truyền thông tin di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Hershey đã nhận giải Nobel vào năm 1969.
KHÁM PHÁ RA CHUỖI XOẮN KÉP
Năm 1953, James Watson và Francis Crick đã suy luận ra cấu trúc của phân tử DNA – một chuỗi xoắn kép – mà không cần thực hiện một thí nghiệm nào. Watson và Crick đã gửi tới tạp chí Nature một bài báo vẻn vẹn trong một trang giấy với lời mở đầu: “Chúng tôi xin đưa ra một mô hình cấu trúc của muối deoxyribose nucleic acid (DNA)”, và kết thúc bài báo bằng câu nói: “Nếu chúng tôi không nhầm thì cách cặp đôi đặc biệt này sẽ cho chúng ta thấy cơ chế nhân bản của vật chất di truyền”. Công trình của họ đã được nhận giải thưởng Nobel vào năm 1962, cùng với Maurice Wilkins.
KHÁM PHÁ RA MÃ DI TRUYỀN

Năm 1967, Har Khorana, Robert Holley, và Marshall Nirenberg đã giải mã cơ chế để DNA có thể dịch mã thành các protein. Ba ông cùng chung nhau nhận giải Nobel vào năm 1968.
Năm 1968, Stanley Cohen, nhà nghiên cứu về các bệnh do vi khuẩn, đã xác định rằng các vi khuẩn mang các gene kháng kháng sinh trong plasmid - DNA dạng vòng nằm ngoài nhiễm sắc thể. Cohen đã nghiên cứu cách tinh sạch các plasmid và đưa chúng trở lại các tế bào vi khuẩn khác, từ đó có thể chuyển tính kháng kháng sinh giữa các chủng vi khuẩn.
Năm 1970, KHÁM PHÁ RA CÁC ENZYME GIỚI HẠN. Nhà khoa học Herb Boyer, thao tác trên các thể thực khuẩn, đã phát hiện ra rằng các vi khuẩn nhất định “giới hạn” đối với các phage nhất định bằng cách sinh ra các enzyme giúp cắt nhỏ DNA của phage, tạo ra các “đầu dính (sticky ends)” trên các mạch cắt. Boyer đã phân lập được các enzyme giới hạn EcoR1. Trong những năm tiếp theo, các nhà khoa học đã phát hiện được hàng trăm endonuclease giới hạn khác cắt DNA tại các vị trí đặc biệt. Các nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về các enzyme giới hạn (Hamilton Smith và cs) đã được nhận giải Nobel Y học vào năm 1978.
Năm 1972, CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP ra đời. Nhà sinh hóa người Stanford, Paul Berg, đã nối hai đoạn DNA đầu bằng cắt từ virus SV 40 và vi khuẩn E. coli lại với nhau, tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp. Berg đã được nhận giải Nobel Hóa học vào năm 1980 cùng với Walter Gilbert và Fred Sanger.
Năm 1972, “TỪ CORNED BEEF ĐẾN TÁCH DÒNG”: Vào tháng 11, tại một hội nghị khoa học ở Hawaii, Cohen nghe Boyer trình bày thí nghiệm với EcoE1 của ông và kết luận của Boyer rằng các đầu dính của DNA có thể được nối lại với nhau hoặc có thể “bị cắt” bằng DNA ligase. Sau đó, hai ông đã gặp nhau và thảo luận về phương pháp kết hợp phân lập plasmid với cắt nối DNA. Họ đã đưa ra ý tưởng về việc chèn đoạn DNA mong muốn vào các plasmid của vi khuẩn để sau đó có thể sản xuất lượng lớn các protein đặc biệt – chất cơ bản của công nghiệp công nghệ sinh học
Năm 1975, Hội nghị Asilomar: Paul Berg đã tổ chức hội nghị quốc tế về kỹ thuật DNA tái tổ hợp với hơn 100 nhà khoa học khác để thảo luận về những gì đã biết (cũng như chưa biết) về DNA tái tổ hợp và đề ra một số nguyên tắc chỉ đạo giúp các nhà khoa học tránh được những nguy cơ không đáng có. Các nhà khoa học đã đồng ý tạm dừng nghiên cứu liên quan đến các kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho đến khi xác định được các nguy cơ tiềm ẩn. Mặc dù kỹ thuật DNA tái tổ hợp đã tạo ra nhiều sản phẩm vô hại hơn cả sự mong đợi, nhưng Asilomar vẫn giữ nguyên quan điểm khoa học quan trọng của mình.
Năm 1975, TRÌNH TỰ DNA ĐƯỢC BẮT ĐẦU GIẢI MÃ. Walter Gilberg và Allan Maxam (Đại học Harvard) và Fred Sanger (Đại học Cambrige) cùng lúc đã đưa ra hai kỹ thuật nhằm xác định trình tự chính xác của các base của một gen. Gilberg và Sanger (cùng với Paul Berg) đã chung nhau nhận giải thưởng Nobel vào năm 1980.
Năm 1975, Cesar Milstein, Georges Kohler và Niels Jeme đã phát triển kỹ thuật kháng thể đơn dòng bằng cách dung hợp các tế bào u bất tử với các tế bào lympho B sinh kháng thể để tạo ra “các thể dung hợp (hybridomas)” vẫn tiếp tục tổng hợp được các kháng thể đã biết đó (các kháng thể đơn dòng). Milstein, Kohler và Jeme đã được nhận giải Nobel Y học vào năm 1984.
Năm 1976, NHỮNG BƯỚC ĐỘT PHÁ CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC. Nhờ các kỹ thuật sinh học phân tử, các tế bào được sử dụng như các nhà máy nhằm sản xuất các hormone và protein với quy mô công nghiệp. Các sản phẩm này chính là các “dược phẩm sinh học” có tiềm năng thương mại rất lớn. Robert Swanson – một nhà đầu tư táo bạo ở thung lũng Silicon, và Herb Boyer đã cùng nhau thành lập hãng Genetech, Inc với mục tiêu tách dòng insulin của người. Genetech được đưa lên sàn giao dịch vào ngày 14/10/1980, bán ra tới 1 triệu cổ phiếu với mệnh giá 35 $/cổ phiếu- và thu tới 35 triệu $ chỉ trong một buổi chiều. Tới cuối phiên giao dịch, cổ phiếu của Genetech đã lập kỷ lục khi lên giá tới 89$, một kỷ lục cho 1 lần đầu tiên chào bán.
1978 Insulin của người được các nhà khoa học của Genetech nhân tách dòng vào E. coli. Genetech sau đó đã chuyển giao công nghệ sản xuất insulin cho Eli Lilly. Năm 1982, insulin người, hay Humulin, trở thành loại thuốc DNA tái tổ hợp đầu tiên được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm của Hoa Kỳ (FDA) cấp phép
Năm 1985, Genetech trở thành công ty CNSH đầu tiên đưa ra sản phẩm sinh dược của riêng mình, ProTropin – hormone sinh trưởng dành cho trẻ bị thiếu loại hormone này
1986 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) do Kary Mullis đặt nền móng và đã tạo nên cuộc cách mạng trong sinh học phân tử… PCR sử dụng một DNA polymerase chịu nhiệt để khuếch đại bất kỳ một đoạn DNA lên hàng tỷ lần chỉ trong vài giờ. Taq polymerase được chọn là Phân tử của năm 1989 bởi tạp chí Science. Kary Mullis, đã tách khỏi công ty ông làm thuê (Cetus) và cũng thờ ơ với việc chứng minh khoa học, đã thậm chí không được nhắc tới trong bài báo của Science. Tuy nhiên, Mullis đã nhận được giải Nobel về hóa học năm 1993 và trở thành một nhà văn ăn khách. Cuộc chiến lâu dài, quyết liệt “David và Goliath” về quyền sở hữu kỹ thuật PCR và enzyme chủ chốt Taq polymerase giữa Hoffman-LaRoche và Promega Biotech cuối cùng cũng được giải quyết năm 1999.
1989 Dự án Hệ Gen Người bắt đầu. Một kế hoạch tham vọng với mục đích lập bản đồ, giải trình tự và đưa ra được các ý nghĩa để có thể sử dụng cho các nghiên cứu sinh học tiếp theo, tất cả ~100,000 gen người vào năm 2005, được điều hành lúc đầu bởi James Watson. Các NST người được đóng gói gửi đi các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới, với công nghệ đọc trình tự mới đã đáp ứng dần yêu cầu phân tích trình tự nhanh hơn. Chi phí dự tính: 3 tỷ $.

1994. Dũng cảm đưa ra loại thực phẩm mới. Vào ngày 18/5, FDA đã thông báo sự có mặt của cà chua FlavrSavr của Calgene, thực phẩm chuyển gen đầu tiên trên thế giới, trên thị trường. FlavrSavr đã trải qua suốt một thập kỷ để thí nghiệm, tốn tới 525 triệu $, trước khi được FDA chứng nhận là an toàn. Được cải biến để có thể vẫn cứng chắc khi đã chín, FlavrSavr “tạo ra hương vị mùa hè suốt cả năm”. Mặc dù rất ngon, FlavrSavr đã phải trải qua sự phản đối của người tiêu dùng, giá thành cao và sự tẩy chay của các bếp ăn. Calgene, mắc nợ nặng nề trước khi cà chua được đưa ra thị trường, đã tuyến bố khai tử FlavrSavr trên đồng ruộng năm 1997.
Kỹ thuật DNA tái tổ hợp
& Sinh vật biến đổi gen
Nông nghiệp truyền thống
Trong lịch sử loài người, hơn 10.000 năm qua, con người ở khắp nơi trên trái đất đã biết sử dụng thực vật và động vật hoang dã làm thực phẩm; biết thuần hóa và nuôi/ trồng chúng.
Những loài cây lương thực quan trọng nhất được gieo trồng: lúa mì, lúa, lúa mạch, ngô và lúa mạch đen; mía; động vật lấy thịt được nuôi như cừu, dê, ngựa và lợn; gia cầm như gà tây, gà, vịt; các sản phẩm thực vật và động vật: sữa, bơ, phomat, trứng và dầu.
Thuần hóa
Từ khi nền nông nghiệp bắt đầu, con người đã biết lai tạo các giống động vật và thực vật để cải tiến giống cây trồng, vật nuôi mang những đặc tính mong muốn
Kỹ thuật lai tạo giống là một thao tác di truyền trong quần thể thông qua “chọn lọc nhân tạo”
Các giống động vật và thực vật tương tự nhau nhưng khác nhau về tổ tiên hoang dại của chúng có thể là kết quả của lai tạo giống
Một số giống thuần hóa
và họ hàng hoang dã của chúng
Tại sao phải cải biến các sinh vật?
Ví dụ 1: Lúa mì và lúa mạch
Các đặc tính hoang dại:
Mang các hạt ở đầu ngọn giúp hạt dễ dàng bị rơi vãi xuống đất và nảy mầm
Đặc tính này lại khiến con người khó thu hoạch
Trong tự nhiên, đột biến đơn gen ngăn ngừa sự vỡ, rơi hạt là đột biến không có lợi (bởi vì hạt không thể tự rơi để nảy mầm), nhưng lại rất thuận lợi cho con người thu hoạch hạt.
Thuần hóa:
Con người bắt đầu thu hoạch các hạt ngũ cốc hoang dại, mang chúng về và gieo trồng, chọn lọc các hạt có đột biến ngằn ngừa sự vỡ, rơi hạt.
Ví dụ trên đối tượng động vật
Gà
Chọn lọc theo hướng tăng khối lượng
Ngựa hoang
Chọn lọc theo hướng giảm khối lượng
Cừu
Chọn lọc làm mất bộ lông cứng bên ngoài và không bị rụng bộ lông mềm mại bên trong (len)
Hầu hết động vật thuần hóa, có não nhỏ hơn và kém nhanh nhạy so với tổ tiên của chúng
Con người cho rằng, bộ não tốt và đôi mắt tinh nhanh rất cần thiết cho động vật tồn tại trong tự nhiên, nhưng không cần thiết khi nuôi trong nông trại.
Mỗi loài được cải biến phục vụ
các mục đích khác nhau
Kết quả là tạo ra các giống lai có kiểu hình rất khác nhau nhưng đều thuộc cùng một giống tổ tiên.

Chó (Canis familiaris)
Chọn lọc đa dạng để săn chuột, chim, diệt cáo, để đua, để ăn thịt hoặc để làm cảnh.

Cải bắp (Brassica oleracea)
Chọn lọc đa dạng về lá (cải bắp và cải xoăn), thân (su hào), hoa (súp lơ và cải hoa) và chồi (cải bruxen).
Các trung tâm nông nghiệp
cổ xưa và hiện đại:
Nơi các giống hoang dại đầu tiên được nuôi/ trồng có thể không nhất thiết là vùng mầu mỡ và có khí hậu thích hợp nhất
Sinh vật biến đổi gen –
Genetically Modified Organisms (GMOs)
GMOs là gì?
Sinh vật mang một - vài gen mã hóa cho các tính trạng mong muốn nhất định có nguồn gốc từ sinh vật khác (thường không có quan hệ họ hàng)
Các kỹ thuật mới sẽ tăng hiệu quả chuyển gen và có thể giải quyết các mối quan tâm về môi trường và sức khỏe.
Đưa gen vào những vị trí nhất định trên genome
Các chỉ thị mới thay thế các chỉ thị kháng kháng sinh
Kiểm soát có hiệu quả việc biểu hiện gen (đặc hiệu về thời gian và vị trí)
Chuyển gen vào lục lạp thay vì vào nhân
Triển vọng của công nghệ gen thực vật
Lợi ích của cây trồng biến đổi gen
Tăng sản lượng*
Tăng khả năng kháng sâu*
Tăng khả năng kháng thuốc diệt cỏ*
* Ở một mức độ đáng kể không thể có được nếu sử dụng các phương pháp truyền thống
Các sinh vật có thể được sử dụng để sản sinh các chất có giá trị như vaccines, dược phẩm…
Các rủi ro tiềm ẩn của GMOs
Các vấn đề có thể phát sinh trong những lĩnh vực sau:
Sức khỏe con người
Môi trường
Kinh tế
Tại sao lại sử dụng GMOs?
Các cây lương thực với các đặc tính nông học chính:
Tăng sản lượng
Kháng côn trùng (ngô, bông)
Kháng thuốc diệt cỏ (đậu tương, cải dầu)
Kháng virus (đu đủ, dưa hấu)
Kháng hạn, muối
(đang phát triển)
Tại sao lại sử dụng GMOs?
Các cây lương thực với các đặc tính liên quan đến người tiêu dùng:
Tươi, hương vị thơm ngon
Cà chua Flavr Savr
Quy trình chế biến
Dinh dưỡng
“Lúa vàng”
Dầu tốt cho tim
Giảm khả năng gây dị ứng
GMOs được sử dụng rộng rãi
ở Hoa Kỳ
Cây trồng biến đổi gen trên thế giới
Gần hai phần ba diện tích đất canh tác thuộc các quốc gia phát triển như Hoa Kỳ, Canada, Australia, Tây Ban Nha và hơn một phần ba diện tích đất canh tác thuộc các quốc gia đang phát triển như Trung Quốc, Ấn Độ, Philippines (châu Á); Argentina, Brazil, Mexico, Uruguay, Paraguay (Mỹ Latin) và Nam Phi (châu Phi)
Cây trong biến đổi gen tại các nước: 2005
Diện tích canh tác cây trồng biến đổi gen
toàn cầu (1996- 2005): triệu ha
Diện tích canh tác cây trồng biến đổi gen
toàn cầu, 1996 – 2005: tính theo cây
Đậu tương
Ngô
Bông
Cải dầu
Nhận thức của cộng đồng
Nhận thức của cộng đồng
Bạn đã bao giờ ăn thực phẩm biến đổi gen?
Thực tế
Ngày nay, khoảng 75% thực phẩm chế biến trên thị trường Hoa Kỳ có chứa các thành tố từ cây trồng biến đổi gen.
Bột ngô
Bột ngô chứa lượng fructose cao
Dầu ngô
Vitamin C
Bột đậu tương
Dầu đậu nành
Sữa đậu nành
lecithin
Chính trị
Thuật ngữ gây bối rối và có liên quan đến chính trị:

“công nghệ sinh học”
“công nghệ sinh học hiện đại”
“thực phẩm biến đổi gen”
“GM”
“sinh vật biến đổi di truyền”
“sinh vật biến đổi gen”
“Frankenfoods”
Các mốc thời gian liên quan
đến GMOs ở Hoa Kỳ
Từ 1970s và 1980’s
1975 – Lắp ghép DNA tái tổ hợp đầu tiên
1978 – Phân lập insulin của người
1980 – Phán quyết của tòa án liên bang: sinh vật sống có thể được bảo hộ dưới dạng sáng chế - patent (Chakabarty case)
1982 – sản xuất vi khuẩn; chính phủ nghiên cứu xây dựng quy chế để giải phóng có chủ định GEOs vào môi trường
1986 – Khung quản lý công nghệ sinh học của Liên bang
1993 – FDA phê chuẩn rBGH (Recombinant Bovine growth hormone)
1994 – Thực phẩm công nghệ sinh học đầu tiên được phê chuẩn (Cà chua Flavr Savr)
1996 – Hạt ngô biến đổi gen đầu tiên được bán; cây trồng biến đổi gen trở thành nguồn cung cấp thực phẩm
Các mốc thời gian liên quan
đến GMOs ở Hoa Kỳ
Công nghệ gen thực vật ở VN?
Chỉ thị 50 năm 2005 của Ban Bí thư về PT CNSH
QĐ 188 của TTCP về PT CNSH
QĐ 212 của TTCP về An toàn sinh học SVBĐG
Chương trình CNSH KC-04 (Bộ KH&CN)
Chương trình CNSHNN 2006-2015/20
Các PTNTĐ (2000-2008)
Các PTN, đề tài cấp Bộ, Viện, Trường