Bài 4. Đột biến gen

Phương pháp chuyển nạp gen ở vi sinh vật
Nhóm:
Phạm Thị Thúy Vi
Đinh Thị Xuân Diệu
Trần Thảo Nam Trân
Tóm tắt
Đặc điểm chung của VSV
Các VSV biểu hiện gen thường dùng
Vector
Các phương pháp chuyển nạp gen
Ứng dụng kĩ thuật chuyển nạp gen
TỔNG QUAN CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở SINH VẬT
I. Đặc điểm chung của VSV:
Kích thước nhỏ bé
Có khả năng sinh sản nhanh, phát triển mạnh
Hấp thu nhiều, chuyển hóa nhanh
Khả năng thích ứng cao, dễ phát sinh biến dị
Môi trường sống rộng rãi
II. Các VSV biểu hiện gen thường dùng:
1. Vi khuẩn:
E.coli:
Ưu:
Tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng biểu hiện gen tái tổ hợp mạnh.
Giảm chi phí hóa chất
Cấu trúc bộ gen đã biết
E.coli BL21 được dùng phổ biến nhất.

Nhược:
Khó biểu hiện một số gen( >50kD, giàu cystein,cầu nối S-S)
Một số chủng có thể gây bệnh, tạo độc tố
Khả năng tạo và tiết protein ngoại bào tương đối thấp.
Bacillus:
Khả năng tạo và tiết protein ngoại bào mạnh
Chi phí công nghệ thấp
Sản phẩm tương đối cao
Chủ yếu là giống B.subtilis.


2. Virus:
Baculovirus:
Ký sinh trên hơn 600 loài côn trùng
Biểu hiện nhiều loại protein người( α,β - interferon; inteuleukin 2;…)
Biểu hiện protein có phản ứng glycosyl hóa, cắt chuỗi peptid tín hiệu
Hiệu quả cao, giá thành sản phẩm giảm.
Tuy nhiên thời gian nuôi cấy lâu, điều kiện và môi trường nuôi cấy phức tạp.


Baculovirus
3. Tế bào nấm men:
S.cerevisiae, Pichia Patoris
Biểu hiện gen sinh vật bậc cao
Dùng được cả 2 loại vector dùng trong proka. và euka.
Đã giải mã được cấu trúc bộ gen
Không gây bệnh
Biểu hiện được hầu hết các loại protein
Khả năng tạo sản phẩm nhanh
III. Vector:
1. Các ứng dụng chủ yếu của vector:
Tạo dòng nhằm khuếch đại số lượng bản sao một trình tự DNA xác định
Chuyển các gen vào tế bào hay cơ thể tạo sinh vật chuyển gen
Sản xuất RNA với số lượng lớn từ DNA được tạo dòng
Sản xuất protein với số lượng lớn từ DNA được tạo dòng.
2. Nguyên tắc chọn:
Tùy vào kích thước và bản chất đoạn DNA
Dùng chung enzyme cắt và nối
Phải thích hợp với vật chủ (khả năng tái bản tạo số lượng lớn,không gây ảnh hưởng đến TB chủ)
Gen chỉ thị trong vector dễ nhận biết
Hiệu quả tách dòng cao
3. Các loại vector tách dòng thông dụng:
Plasmid: 
Ưu Điểm
Cấu trúc đơn giản, kích thước nhỏ
Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ hợp
Có thể nhân lên với số lượng lớn, tốc độ nhanh.
Nhược Điểm
Kích thước DNA chèn ngắn (1-5 kb)
Hiệu suất biến nạp vào kí chủ tương đối thấp.
Không hiệu quả khi biến nạp ở Eukaryote


Phage:
Phần lớn sử dụng phage λ
Ưu:
Khả năng xâm nhập vào tế bào kí chủ nhanh ở cả Prokaryote và Eukaryote
Có thể mang các đoạn cài đến ~20 kb
Dễ bảo quản do các hạt virus bền ở nhiệt độ thấp( vd:40 C)
Nhược:
Phân tích phức tạp
Hiệu suất nhân lên trong vật chủ không cao
Cosmid
Là vector lai của plasmid và trình tự cos của phage λ, mang các ưu điểm của hai vector này:
Khả năng tự tái bản số lượng lớn của plasmid; hoạt động như một plasmid, không phá vỡ tế bào
Có khả năng đóng gói in-vitro như phage - Có khả năng mang các đoạn ADN cài có kích thước đến 35 – 45 kb.
Ứng dụng chủ yếu để thiết lập thư viện bộ gen
NHIỄM SẮC THỂ NẤM MEN NHÂN TẠO (YAC)
Ứng dụng để tách dòng các phân đoạn gen kích thước lớn ở sinh vật nhân chuẩn (> 35-45 kb)
Có thể mang các đoạn cài ADN dài từ 150 đến 1000 kb.
Vector này được tạo ra từ một số trình tự đặc biệt của nấm men( ARS,CEN,TEL, gen chỉ thị đặc hiệu trpI).
NHIỄM SẮC THỂ VI KHUẨN NHÂN TẠO (BAC)
Về cơ bản giống với nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo nhưng được tạo ra từ nhân tố giới tính F của VK.
BAC có thể mang các đoạn cài lớn ( 100-300 kb), nhưng ngoài ra có khả năng sao chép trong E. coli giống như các véctơ plasmid, cosmid.
Sử dụng được cho cả Proka và Euka.
IV. Các phương pháp chuyển nạp gen:

Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli bằng kỹ thuật sốc nhiệt
Chuẩn bị tế bào khả biến:
Tế bào E.coli được nuôi trên môi trường thạch LB (môi trường nuôi VSV Lucia Bertani)
Lấy 1 khuẩn lạc E.coli  5ml môi trường LB lỏng, 37oC, lắc 12-16 giờ.
1 ml dịch vi khuẩn + 99ml môi trường LB, lắc 2-3 giờ  để lên đá trong 1-1,5 giờ
Li tâm lạnh thu cặn tế bào
Cặn tế bào + 100ml CaCl2 100mM lạnh  để lên đá 15 phút  li tâm lạnh thu cặn
Cặn tế bào + 40ml CaCl2 100mM lạnh  để lên đá 1 giờ  li tâm thu cặn (tế bào khả biến)
Tế bào khả biến + 50 µl CaCl2 (15% glycerol)  giữ lạnh -75oC đến -80oC
Kỹ thuật biến nạp
50µl tế bào khả biến để trên đá 15 phút + 0,5 ng DNA (vector tái tổ hợp)  đảo nhẹ, để trên đá 15-20 phút
Đặt vào bể ổn nhiệt 2 phút, 42oC  đặt lên đá 2 phút
Thêm 1000µl môi trường LB lạnh, nuôi 37oC ở máy lắc
100µl dịch tế bào trải lên hộp Petri, môi trường thạch LB + ampicilin 50µg/ml + IPTG + X-gal.
ủ 37oC, 12-16giờ  thu nhận khuẩn trắng
2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào nấm men bằng kỹ thuật xung điện
Chuẩn bị tế bào
Cấy 1 khuẩn lạc nấm men vào môi trường YPD (1% cao nấm men + 2% pepton + 2% glucose). Nuôi ở 28oC, 1 ngày đêm
30µl dịch nuôi + 100ml YPD, lắc 16 – 18 giờ
Để lên đá 5 – 10 phút  li tâm  lấy cặn hòa với nước khử ion lạnh  li tâm thu cặn
Tế bào + 20ml sorbitol 1M  li tâm thu cặn (tế bào khả biến)
Hòa cặn với 0,2 ml sorbitol giữ lạnh sâu -75oC đến -80oC
Kỹ thuật xung điện
50 µl dịch tế bào khả biến + 10 – 15 µg DNA plasmid tái tổ hợp  trộn  chuyển vào cuvet xung điện
Thực hiện xung điện 0,25 µF, 200 Ω, 1,5 kV trong 4 – 5 phần nghìn giây
Bổ sung 1ml sorbitol lạnh  cấy lên môi trường đĩa thạch
3. Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp
Chỉ thị kháng sinh
Đơn giản, dễ sử dụng
Trong môi trường có chất kháng sinh, tế bào chứa vector tái tổ hợp có gen kháng chất kháng sinh phát triển được
Tuy nhiên:
Một số tế bào xuất hiện các đột biến kháng chất kháng sinh vẫn có thể phát triển được
Hoặc plasmid không mang gen tái tổ hợp
 Sử dụng đồng thời vời gen chỉ thị màu
Chỉ thị màu
Gen LacZ mã hóa enzyme β–galactosidase.
Khi có chất cảm ứng IPTG (isopropyl thiogalactoside – chất đồng đẳng của lactose) enzyme β–galactosidase được tổng hợp.
Enzyme β – galactosidase có khả năng thủy phân X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) từ hợp chất không màu thành màu xanh.
Kết quả
Tế bào chứa LacZ nguyên vẹn (không tạo vector tái tổ hợp)  tổng hợp enzyme β–galactosidase  thủy phân X-gal
 khuẩn lạc màu xanh
Đoạn DNA chèn vào giữa gen LacZ (tạo vector tái tổ hợp)  LacZ mất hoạt tính  không tổng hợp enzyme β–galactosidase  không thủy phân X-gal
 khuẩn lạc có màu trắng
4. Phương pháp lai phân tử:
Chính xác cao
Thực hiện phức tạp, tốn kém, cần thiết bị chuyên dụng
Các bước thực hiện chủ yếu
Đặt 1 màng lai (nitrocellulose), để các khuẩn lạc in dấu ở vị trí tương ứng
Lấy màng lai đem lai với mẫu dò đánh dấu phóng xạ (hoặc huỳnh quang), mẫu dò phải tương ứng với đoạn đặc hiệu của gen tái tổ hợp
Xử lý màng lai bằng NaOH để làm vỡ tế bào và biến tính DNA
Cố định DNA trên màng lai
ủ để tạo phản ứng lai  rửa màng loại mẫu dò không lai
Thực hiện kỹ thuật phóng xạ tự ghi

Kết quả
Những vị trí có lai sẽ có chấm đen trên phim nhạy phóng xạ, hoặc vết màu khi hiện huỳnh quang
Lựa chọn khuẩn lạc tương ứng trong hộp Petri
Ứng dụng của kỹ thuật chuyển nạp gen

1. Sản xuất insulin tái tổ hợp:
Do các tế bào beta của tuyến tụy sản xuất, đóng vai trò chuyển hóa đường
Bệnh tiểu đường (Diabetes) do thiếu hụt insulin.
Cấu trúc gen mã hoá insulin ở người

Gen mã hóa insulin (IND) nằm trên NST số 11, trên cánh ngắn (11p)
Vùng không mã hóa chia làm 3 cụm gen ký hiệu I, II và III
Vùng mã hóa có kích thước 1430 bp. Trong vùng mã có 2 intron.
Đoạn gen mã hóa cho 4 peptid của phân tử insulin: Chuỗi peptid tín hiệu (SP), chuỗi B, chuỗi C và chuỗi A
Insulin is made up of 2 chains = 51 amino acids total
A chain = 21 amino acids
B chain = 30 amino acids

Sản xuất insulin tái tổ hợp
2. Sản xuất hormon sinh trưởng tái tổ hợp
Hormone sinh trưởng người (hGH – Growth Hormone) là loại hormone được sản xuất ở các tế bào tuyến yên trong não.
Có vai trò điều hòa quá trình sinh trưởng và phát triển của xương, cơ bắp
thiếu hụt hGH làm cho cơ thể chậm phát triển, hoặc có thể gây hội chứng lùn bẩm sinh ở trẻ em di truyền qua các thế hệ trong gia đình.
Cấu trúc phân tử hormone sinh trưởng người(hGH)
Công nghệ sản xuất hormon sinh trưởng người TTH
Bao gồm các bước:
Tách chiết và tinh sạch mRNA từ tế bào thùy trước tuyến yên và thực hiện kỹ thuật phiên mã ngược
Sử dụng enzym giới hạn cắt bỏ đoạn gen mã hóa 23-24 a.a của chuỗi peptid tín hiệu
Chuyển gen mã hóa hGH vào vector biểu hiện thích hợp
Biến nạp vector TTH vào E.coli, nuôi cấy, thu sinh khối, tách chiết và tinh sạch hGH
VSV biểu hiện: vi khuẩn, baculovirus, nấm men…
3. Sản xuất vaccin tái tổ hợp và vaccin DNA
Chia vaccin làm 2 nhóm: truyền thống và tái tổ hợp
Vaccin truyền thống: vi khuẩn hoặc virus sống đã làm giảm độc lực.
Nhược: thời gian bảo quản ngắn, khó bảo đảm an toàn → tính độc hồi lại
Vaccin TTH: protein kháng nguyên sản xuất nhờ kỹ thuật gen và các vaccin DNA tái tổ hợp.
Ưu: giá thành rẻ, sử dụng rộng rãi chống các bệnh do vi khuẩn, ký sinh trùng, viêm gan do virus
Vaccin DNA có hiệu quả cao trong phòng chống bệnh hiểm nghèo (ung thư, AIDS,…)
Vaccin tái tổ hợp
Vaccin TTH phòng chống viêm gan:

Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBV) được sản xuất trong nấm men S.cerevisae từ năm 1981. Bắt đầu sử dụng từ năm 1986
Một số sản phẩm vaccin phòng chống HBV: Recombivax HB, Engeris B, Genhevac B,… được sản xuất trong tế bào nấm men và vi khuẩn
Vaccin DNA
Vaccin DNA là tập hợp các gen mã hóa kháng thể đặc hiệu thường được cài gắn vào các vector biểu hiện mạnh, khi đưa vào tế bào các gen được dịch mã tạo các kháng thể đặc hiệu, giúp các tế bào chống lại sự xâm nhiễm của các tác nhân gây bệnh.
Gồm 2 loại: vaccin tập hợp gen kháng nguyên và vaccin tập hợp gen sinh kháng thể
Ưu: dễ dàng thiết kế, sản xuất, bảo quản
Tài liệu tham khảo:
Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng- PGS.TS Khuất Hữu Thanh
Sinh học phân tử- Hồ Huỳnh Thùy Dương
Vi sinh vật học – GS. Nguyễn Lân Dũng
http://vi.wikipedia.org
http://baigiang.violet.vn
http://www.slideshare.net
cảm ơn cô và các bạn đã lắng nghe!