Bài 28. Thực hành: Quan sát một số vi sinh vật

THỰC HÀNH VSV
1.Quan sát vi sinh vật
2.Lên men rượu
3.Lên men lactic
I.Quan sát vi sinh vật

-Chuẩn bị:
Vi sinh vật từ khoang miêng, nước dưa chua, sữa chua, ống MT nuôi VSV thuần khiết….
Các dụng cụ cần thiết:
Kính hiển vi, đèn cồn, que cấy, phiến kính, lamen…
Các loại thuốc nhuộm: Xanhmethylen, lugol, tim gentianviolet
Nguyên liệu khác: Bông tăm, cồn đốt, nước cất..

-Tiến hành:Làm tiêu bản soi tươi
+Đặt lên phiến kính 01 giọt thuốc nhuộm
+Dung que cấy lấy một vòng que cấy dịch có VSV đã chuẩn bị trước.
+Đậy lamen và quan sát ở vật kính x40, x100

1.1.Nhuộm đơn phát hiện VSV

-Chuẩn bị như trên
-Tiến hành:
+Làm vết bôi từ dịch có nấm men
+Cố định tiêu bản (bằng cách hơ khô vết bôi rồi đốt bằng cồn)
+Nhuôm đơn:
• Phủ lên vết bôi 1 giọt thuốc nhuộm, để 1-3 phút
• Rửa nước, làm khô tiêu bản và quan sát ở vật kính x40, x100

II.Lên men rượu

Đặt thí nghiệm và quan sát hiện tượng lên men:
-Ống 1: đựng dd đường 10%
-Ống 2 đựng dd đường 10%+ Bột nấm men
Ống 3 đựng nước cất +Bột nấm men


1 2 3
Làm sữa chua
Cách làm:
Lấy 300ml sữa đặc vào song. Rót tiếp 1lit nước sôi và khấy đều
Đợi nguội đến 400C thì cho 1hộp Vinamilk vào khuấy đều
Rót sữa vào từng bì nilon buộc kín
Đưa vào thùng xốp hay tủ ấm để duy trì nhiệt
Sau 6-8h, sữa sẽ đông lại Sữa chua
HÌNH DẠNG MỘT SỐ LOÀI VI KHUẨN
Streptococcus pneumoniae

Streptococcus sp1
Khuẩn lạc Streptococcus sp1
Streptococcus sp2
Streptococcus
Khuẩn lạc Streptococcus sp2
Gram positive, Staphylococcus aureus
Có dạng hình cầu đk: 0,8-1, đứng tụ lại thành đám như chùm nho, không có vỏ, không có lông, không di động, không sinh bào tử nhuộm màu Gram dương  

Streptococcus- Ảnh KHVDT quét
Staphylococcus sp.
Streptococcus và Staphylococus (Gram+)
Neisseria gonorhoeae
Lậu cầu khuẩn có dạng hình hạt cà phê, xếp thành từng đôi, không có vỏ không có lông, không sinh bào tử bắt màu Gram âm
Neisseria meningitidis
Não mô cầu không có vỏ không có lông, không sinh bào tử bắt màu Gram âm
Corynebacterium diphteriae

Trực khuẩn bạch hầu có hình thẳng dài 1-6x0,3-8µm có một hay hai đầu phình to như chùy, không có vỏ, không có lông, không sinh bào tử bắt màu Gram dương.
Clostridium tetani
Listeria monocytogenes

Bacillus anthracis
Lactobacillus sp.
Escherichia coli
Kích thước 2-3 x 0,5 m , có vỏ, có lông, di động, không sinh bào tử, bắt màu Gram âm
Khuẩn lạc E. coli
Theodor Eschrich (1857 – 1911)
1885 Escherich tìm ra vi khuẩn 
Escherichia coli gây ra bệnh tiêu chảy
Salmonella là những trực khuẩn dài 0,6-0,8m, có nhiều lông xung quanh thân, rất di động không có vỏ, không sinh bào tử, nhuộm Gram bắt màu Gram âm


Trực khuẩn thương hàn


Salmonella typhi
TRỰC KHUẨN THƯƠNG HÀN
Do Daniel E. Salmon phát hiện từ năm 1885 tại Mỹ

Daniel E. Salmon (1850-1914) Salmonella typhi

Shigella
Shigella có dạng hình thẳng dài 1-3 m không có lông, không di động, không có vỏ, không sinh bào tử bắt màu Gram âm
Klebsiella pneumoniae
Gram âm, thường đứng thành đôi, không có lông, không di động, không sinh bào tử, có vỏ dày > 2-3 lần so với tế bào
Pseudomonas aeruginosa
Trực khuẩn mủ xanh thẳng hai đầu tròn, dài 1-5µm, rộng 0,5-1µm ít khi có vỏ, có một lông ở một đầu, di động, không sinh bào tử, bắt màu Gram âm
Captocytophaga sp.

Proteus vulgaris
Gram negative, Pseudomonas fluorescens
Helicobacter pylori is a Gram negative bacteria

Nhuộm Ziehl-Nielsen (M. tuberculosis)
Mycobacterium tuberculosis
Clostridium perfringens
(Gđy b?nh ho?i thu)

Phẩy khuẩn tả: Vibrio cholerae

K�ch thu?c 2-4x0,3-0,6 ?m. VK c� m?t l�ng ? d?u, r?t di d?ng, kh�ng c� v?, kh�ng sinh nha băo, nhu?m b?t mău Gram đm, hi?u kh�, MT c� glucose c� th? phât tri?n du?c trong di?u ki?n k? kh�, phât tri?n t?t trong di?u ki?n ph=8,5-9,0, n?ng d? NaCl cao 3%, nhi?t d? th�ch h?p 370C, m?c du?c ? t0 5-400C.
Các xoắn khuẩn gây bệnh
A. Borrelia burgdorferi B. Treponema pallidum
(Gây bệnh sốt hồi quy) (Gây bệnh giang mai)

Treponema pallidum bacteria
Bệnh giang mai
LÊN MEN RƯỢU
*Mục đích yêu cầu :

-Nắm được bản chất sinh học và hóa học của các quá trình lên men.
-Biết cách thực hiện một số phản ứng định tính và nhận biết tác nhân chính gây nên sự lên men các hợp chất cacbonhydrat.

*Bản chất hóa học:
Khi phân huỷ đường trong điều kiện kị khí. VSV chuyển hydro từ NADH đến axetandehyt tạo thành rượu etylic để tái tạo NAD+. sản phẩm tạo thành là etylic và CO2.
NADH NAD+
C6H12O6  CH3COCOOH  CH3CHO C2H5OH +CO2 +113,4 KJ

*Vi sinh vật lên men:

Quá trình lên men rượu chủ yếu là do các nấm men thuộc chi Saccharomyces (S.cerevisiae, S. ellipsoideus) hay Schizosaccharomyces pombe...). Ngoài ra, một số loài nấm mốc Mucor rouxi hay vi khuẩn Sarcina ventriculi cũng có khả năng lên men rượu etylic.

1
2
3
4
Lên men rượu bằng dung dịch đường vàng 10% sau 24 giờ.

1: Bột bánh men
2: Bột bánh men có ống Duham
3: Nấm men MN7
4: Nấm men MN7 có ống Duham
Phân tích định tính quá trình lên men rượu

1.Phản ứng với Ba(OH)2: (Xác định sự có mặt của CO2 trong dịch lên men)
-Cho vào ống nghiệm 5ml dịch lên men
-Thêm 1ml dung dịch Ba(OH)2 10%
-Đun nóng nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn. Để lắng. Nếu có mặt của CO2 sẽ tạo thành kết tủa màu trắng do sự tạo thành BaCO3 theo phản ứng :
CO2 + Ba(OH)2 BaCO3↓ + H2O


Xác định khí CO2 trong dịch LMR
Hình dạng tế bào S. cerevisiae
Hình dạng tế bào nấm men
dưới kính hiển vi quang học


Hình vẽ A.Giả nấm men và B.bào tử nấm men
 

2.Phản ứng với kali bicromat :
(Xác định sự có mặt của rượu trong dịch lên men)

-Cho vào ống nghiệm 2ml dịch lên men.
-Thêm 1ml H2SO4 đậm đặc.
-Thêm vài tinh thể K2Cr2O7 lắc đều cho đến khi xuất hiện màu xanh lục.
Phương trình phản ứng diễn ra như sau:
2 K2Cr2O7 + 8 H2SO4 + 3 CH3CH2OH 4KCr(SO4)2 + 3 CH3COOH + 11 H2O
Ống đối chứng: Làm tương tự như trên, song thay dịch lên men bằng dịch chưa lên men. So sánh sự đổi màu ở hai ống thí nghiệm và đối chứng.

II. LÊN MEN LACTIC

*Bản chất:
Khi phân huỷ đường trong điều kiện kị khí. VSV lactic chuyển hydro từ NADH sang axit pyruvic tạo thành axxit lactic để tái tạo NAD+.
NADH NAD+
C6H12O6 ? CH3COCOOH CH3 -CHOH-COOH + Q

Vi sinh vật lên men:

-Lên men lactic dạng đồng hình chuyển hoá đường tạo thành sản phẩm chủ yếu là axit lactic (95%) gồm các chi: Streptococus (S. cremoris, S. lactis, S. thermophillus) và Lactobacillus (L. bulgaricus, L. acidophillus, L. cucumerris, L. plantarum...)

Lactobacillus acidophilus
Khuẩn lạc Lactobacillus acidophilus
VK lên men lactic đồng hình
S.cremoris Leuconostoc mesenteroides S.rhemophillus

Lactococcus lactis sp. lactis
-Lên men lactic dị hình: Khi lên men các vi khuẩn nhóm này chỉ tạo ra 60% axit lactic, phần còn lại là axit axetic, rượu etylic, glyxerin và một vài sản phẩm khác. Gồm các loài: L. brasicar fermentatae, Leuconostoc mesenteroides, E. coli...

Leuconostoc mesenteroides sp. cremoris
VK lên men lactic dị hình
Phản ứng tạo thành axetaldehyt:
-Cho 20ml dịch lên men (nước dưa chua) vào cốc dung tích 100ml.
-Thêm 2ml H2SO4 10% .
-Thêm 4- 5 giọt KMnO4 2%
-Đậy cốc bằng tờ giấy lọc có tẩm dd AgNO3 trong NH4OH rồi đun cho đến sôi. Quan sát sự chuyển màu của giấy lọc.
Kết quả : Axit lactic chuyển sang dạng axetaldehyt axetic(CH3CHO) bay hơi gặp AgNO3 làm đen giấy lọc.